PCR Laboratory Procedures (XX/1/0035) 2019 PDF

Laboratori PROCEDIMENT NORMALITZAT DE TREBALL XX/1/0035 NORMES GENERALS DE FUNCIONAMENT DEL LABORATORI DE PCR Edició: 5 Data: 10/04/2019 Elaborat / Revisat per: Aprovat per: Efrén Razquin Sara Sabaté MODIFICACIONS RESPECTE A L’EDICIÓ ANTERIOR - Actualització dels responsables de la revisió i...

Laboratori PROCEDIMENT NORMALITZAT DE TREBALL XX/1/0035 NORMES GENERALS DE FUNCIONAMENT DEL LABORATORI DE PCR Edició: 5 Data: 10/04/2019 Elaborat / Revisat per: Aprovat per: Efrén Razquin Sara Sabaté MODIFICACIONS RESPECTE A L’EDICIÓ ANTERIOR - Actualització dels responsables de la revisió i aprovació del PNT. XX/1/0035 Edició: 5 Data: 10/04/2019 Pàg. 1 de 10 Laboratori NORMES GENERALS DE FUNCIONAMENT DEL LABORATORI DE PCR INDEX 1 OBJECTE I CAMP D’APLICACIÓ .......................................................................3 2 DOCUMENTACIÓ DE CONSULTA......................................................................3 3 REACTIUS I PRODUCTES ..................................................................................3 4 MATERIAL I APARELLS .....................................................................................3 5 ORGANITZACIÓ DEL LABORATORI .................................................................4 6 5.1 Distribució d’espais i elements de protecció .............................................4 5.2 Normes generals de treball ..........................................................................5 5.3 Organització d’equips ...................................................................................6 NETEJA, GESTIÓ DE RESIDUS I CONATMINACIONS .....................................6 6.1 Neteja de paviments, superfícies i equips ..................................................7 6.2 Contenció de vessaments ............................................................................7 6.3 Gestió de residus ..........................................................................................7 6.4 Desconatminació per UV ..............................................................................8 6.5 Control ambiental ..........................................................................................8 6.6 Protocol d’actuació front a la contaminació de processos analítics........8 7 REGISTRE I GESTIÓ DE MOSTRES ...................................................................9 8 REGISTRE DE PRODUCTES I REACTIUS .........................................................9 9 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................9 XX/1/0035 Edició: 5 Data: 10/04/2019 Pàg. 2 de 10 Laboratori 1 OBJECTE I CAMP D’APLICACIÓ Aquest procediment descriu com s’organitza físicament l’àrea de PCR així com les normes de funcionament general que la regiran pel que fa al registre i gestió de dades, mostres i productes i també als processos de neteja de les instal·lacions i gestió de residus. 2 DOCUMENTACIÓ DE CONSULTA - PNT XX/1/0021: Normes generals de funcionament del Servei de Microbiologia. - PNT XX/1/0001: Control ambiental al Servei de Microbiologia. - PNT XX/1/0006: Circuit de mostres en el Servei de Microbiologia. - PNT XX/1/0020: Normes generals de neteja dels materials, equips i laboratoris del Servei de Microbiologia. - PNT EQ/1/0008: Funcionament i manteniment de cabines microbiològiques del Servei de Microbiologia. 3 REACTIUS I PRODUCTES - Dissolució de Detergent MERCK Extran MA 01 Alcalí al 5% amb aigua MiliQ. - Dissolució d’Hipoclorit Sòdic al 3%. - Aigua destil·lada. - Alcohol al 70%. 4 MATERIAL I APARELLS - Cabines de Flux i seguretat. - Refrigeradors 2-8ºC - Congeladors <-18ºC - Congelador <-60ºC - Guants de nitril rebutjables o similars - Bates de puny tancat blanques - Bates de puny tancat verdes XX/1/0035 Edició: 5 Data: 10/04/2019 Pàg. 3 de 10 Laboratori 5 ORGANITZACIÓ DEL LABORATORI 5.1 Distribució d’espais i elements de protecció La organització física de les operacions que s’hi duen a terme al Laboratori de PCR és: - Pre-PCR Aquesta àrea del laboratori es considera una àrea de baixa càrrega d’àcids nucleics i amplicons: Les activitats que s’hi realitzen són totes aquelles prèvies a la execució del mètode instrumental de PCR, però que a la seva vegada se separen en 2 tipus d’activitats: o Extracció d’àcids nucleics, i altres activitats com: mesures espectrofotomètriques d’àcids nucleics, preparació i dilució de controls positius d’àcids nucleics, recollida de residus, etc... o Preparació de les Mescles de Reacció de PCR: donat que aquesta activitat és la que requereix una càrrega nul·la d’àcids nucleics per tal d’evitar contaminacions a PCR queda confinada en una cabina microbiològica, juntament amb un joc de micropipetes, una microcentrifuga, un agitador i una bata que són d’us exclusiu per aquesta activitat. Per clarificar aquesta segregació d’activitat la bata és de color verd i està retolada com MMIX. Activitats diferents al que pròpiament es la extracció, però que son prèvies a la PCR, com per exemple en mostres d’aigua la filtració i en mostres clíniques la preparació de suspensions inicials de femtes es realitzaran fora dels espais registrats com Laboratori de PCR i s’executaran als Laboratoris de l’Àrea d’Aigües i Mediambient i d’Aliments previstos, emprant l’equipament i les mesures de protecció que hi apliquin. Això es realitza d’aquesta forma per tal de protegir les mostres de possibles contaminacions, minimitzar les contaminacions de les superfícies del laboratori de PCR i també per protegir als tècnics. La bata per treballar a aquesta zona és exclusiva, es a dir, no es fa servir fora d’ella i a més per evitar contaminacions creuades tindrà els punys tancats amb elàstic o boto. - PCR Aquesta àrea del laboratori es considera una àrea d’alta càrrega potencial d’àcids nucleics, ja que si per error es trenca algun contenidor de reacció de PCR, ja sigui capil·lar o placa, o s’obre per error, la quantitat de producte amplificat alliberat és un focus de contaminació i caldrà efectuar activitats de descontaminació abans de continuar les tasques de PCR. Les activitats que si realitzen poden dividir-se en dos grups: XX/1/0035 Edició: 5 Data: 10/04/2019 Pàg. 4 de 10 Laboratori o Càrrega de mescles de reacció, mostres i controls de PCR Aquesta activitat de càrrega de capil·lars i plaques es realitza de forma confinada en una cabina microbiològica amb un jocs de micropipetes, bata i d’altres utensilis d’us exclusiu. Per clarificar aquesta segregació d’activitat la bata és de color verd i està rotulada com PCR. o Programació i càrrega dels termocicladors i gestió documental Aquestes activitats es realitzen a les poiates i sempre. o Cabina de Flux: La bata per a treballar en aquesta zona és la més important del laboratori i serà d’us exclusiu. Donada aquesta importància es diferenciarà de la resta en ser de color verd. - Post-PCR La manipulació de productes d’amplificació, com per exemple la obertura de capil·lar i plaques per a extreure el contingut i fer-lo córrer en un gel d’electroforesi, es realitzarà en un tercer laboratori separat físicament dels altres dos. Aquest laboratori serà considerat com el de més alta càrrega de DNA i per tant d’alt risc com a focus de contaminació per a la resta d’activitats de PCR. Així doncs a aquest laboratori disposarà de bates i pipetes d’us exclusiu. 5.2 Normes generals de treball En totes les situacions s’empraran guants de nitril o similar rebutjables que és substituiran preventivament en alternar el contacte entre material brut i material net i a més sempre que es tingui la sospita de que es puguin haver contaminat amb àcids nucleics o microorganismes per vessaments o aerosols. Així doncs la gestió i preparació del material a l’hora de treballar en la laboratori és molt important per tal de minimitzar els canvis de guants. També cal tenir en compte que quan s’alterni la manipulació o transvasament de tubs contaminats i no contaminats, com per exemple durant processos d’extracció on hi ha els tubs de mostra i els tampons de rentat, mai es treballarà sobre d’altres tubs sinó que s’organitzarà el material net a un costat de l’operador i el brut a l’altre i es manipularan els tubs un a un sobre la poiata. D’aquesta forma si es produeix un vessament o aerosol no es contamina cap tub, tan sols la poiata que caldrà netejar immediatament. Mai és tindrà més d’un tub de mostra o control obert al mateix moment a menys que el protocol d’extracció que s’apliqui així ho requereixi. La organització del material net com per exemple reactius i del brut, com per exemple productes de la extracció finalitzats, en neveres i congeladors es farà per separat. XX/1/0035 Edició: 5 Data: 10/04/2019 Pàg. 5 de 10 Laboratori Així doncs hi haurà com a mínim una nevera i un congelador per emmagatzemar productes nets i un altra parella d’aquests equips per a emmagatzemar productes bruts. Aquests equips estaran expressament identificats per al seu propòsit d’us. En cas d’accident i que es produeixi un esquitx d’algun producte químic, especialment en el cas del tiocianat de guanidina, a la cara, ulls o alguna altra zona, caldrà esbandirse amb abundant aigua i recórrer a una visita mèdica d’urgència. 5.3 Organització d’equips El laboratori de PCR traça els equips que s’empren en cada una de les parts generals del seus procediments a partir del seu codi en el document anomenat Caràtula d’Equips que apareix descrita al PNT XX/1/0021 de Funcionament del Servei. Donat a més que les pipetes automàtiques són els instruments més sensibles a la contaminació a més a mes de la seva traçabilitat per codi en la mencionada caràtula s’han identificat amb diferents etiquetes de color per tal de compartimentar i identificar clarament la seva ubicació dins el laboratori i l’ús exclusiu pel qual estan destinades. Així doncs: 6 Etiqueta Text Vermella pre-PCR-EXT Groga pre-PCR-EXT Verda pre-PCR-MMIX Blanca PCR Ubicació en el Laboratori i Funció pre-PCR: Extraccions de DNA pre-PCR: Extraccions de RNA i opcionalment de DNA pre-PCR, cabina de mescles de reacció: Preparció de Mescles de reacció de PCR PCR , cabina de càrrega: Càrrega de capil·lars i plaques de PCR amb Mescla, mostres i controls. NETEJA, GESTIÓ DE RESIDUS I CONATMINACIONS Les operacions de neteja del laboratori de PCR, tant pel que fa a paviment i superfícies, així com la gestió dels residus que s’hi generen estan condicionades a que una part dels productes que s’empren en la fase d’extracció d’àcids nucleics tenen composicions que poden reaccionar perillosament amb àcids i lleixiu (hipoclorit sòdic). Degut a això s’emprarà preventivament tant per paviment com per superfícies detergents alcalins i l’ús de les solucions a base de lleixiu per a la descontaminació s’empraran sempre en segon terme o no s’aplicaran. XX/1/0035 Edició: 5 Data: 10/04/2019 Pàg. 6 de 10 Laboratori 6.1 Neteja de paviments, superfícies i equips - Paviment: no es farà servir en cap cas dissolucions a base de lleixiu (hipoclorit sòdic) o detergents àcids. O be es netejaran amb aigua o primer amb una dissolució en aigua d’algun detergent alcalí i després esbandit amb aigua. - Superfícies de treball i equips: es netejaran amb una la següent seqüència de productes: o primer una dissolució de Detergent MERCK Extran MA 01 Alcalí al 5% amb aigua destil·lada o miliQ. o després amb una dissolució d’hipoclorit sòdic al 3% o posteriorment esbandit amb aigua destil·lada o miliQ. o finalment amb etanol al 70%. En el cas d’equips es tindrà en compte les particularitats de manteniment indicades als respectius procediments. 6.2 Contenció de vessaments L’actuació genèrica serà la mateixa que la seqüència d’actuació per a la neteja de superfícies i equips: o primer una dissolució de Detergent MERCK Extran MA 01 Alcalí al 5% amb aigua destil·lada o miliQ. o després amb una dissolució d’hipoclorit sòdic al 3% o posteriorment esbandit amb aigua destil·lada o miliQ. o finalment amb etanol al 70%. Aquesta actuació podrà veure’s modificada en cas de que el producte vessat així ho recomani i a més en cas que el vessament afecti a un o mes equips es tindrà en compte les particularitats de manteniment indicades als respectius procediments. 6.3 Gestió de residus Els residus perillosos s’emmagatzemaran en recipients especials subministrats sota petició a la Unitat de Gestió i Serveis. Aquests recipients hauran d’anar etiquetats identificant com a mínim el nom del producte o productes que contenen i el símbol de seguretat que els hi apliqui. XX/1/0035 Edició: 5 Data: 10/04/2019 Pàg. 7 de 10 Laboratori La retirada i substitució dels recipients plens es realitzarà d’acord amb la Unitat de Serveis Generals que a la seva vegada coordinarà la recollida amb la empresa externa de gestió de residus. Residus: - Tiocianat de guanidina: en contacte amb àcids i/o lleixiu (hipoclorit sòdic) pot produir àcids cianhídric i per tal d’evitar-ho els productes i residus que en continguin es recolliran a mida que es facin servir en tubs amb aproximadament 10 mL de hidròxid sòdic 10 N. Finalitzat el seu ús, el residu recollit s’emmagatzemarà en un recipient que contindrà inicialment amb 0,5 litres d’hidròxid sòdic 10 N com a solució tamponadora. 6.4 Desconatminació per UV Tot aquell material que sigui reutilitzable en diverses activitats al llarg del temps, com micropipetes, racs de suport de tubs, etc... se sotmetrà a descontaminació per radiació UV a l’interior de cabines de flux fora de la jornada laboral. 6.5 Control ambiental El control ambiental tant de superfícies com de cabines microbiologies es realitzarà segons el descrit als PNTs XX/1/0001 i EQ/1/0008 però tenint en compte que les activitats de neteja prèvies no seran les indicades sinó les que consten en aquest procediment. 6.6 Protocol d’actuació front a la contaminació de processos analítics Quan es detectin controls de processos analítics contaminats, més enllà d’obrir incidència al Laboratori de PCR acció correctora dins el sistema garantia de qualitat, es detallen a continuació un seguit de mesures genèriques per a fer front a la situació tot implantant-les parcial o totalment. a) Posar fora d'us de forma temporal els lots/tubs de reactius no aliquotats que intervenen el procés o processos contaminats. b) Realitzar una actuació immediata de neteja del laboratori de PCR, del material (ex. pipetes) i de les cabines microbiològiques. Així mateix incrementar-ne la periodicitat. c) Introduir controls negatius extraordinaris al procés o processos, per duplicat o triplicats, que permetin valorar si la situació es puntual o general i valorar a posteriori la resposta a d'altres mesures que s’apliquin. XX/1/0035 Edició: 5 Data: 10/04/2019 Pàg. 8 de 10 Laboratori d) Si se sospita que la contaminació pot ser deguda a una alteració en la qualitat de les condicions ambientals (per exemple obres) o que la salut del personal del laboratori de PCR pot afectar (per exemple en cas d'encostipats) aturar l’aire condicionat en els passos d’extracció que es realitzin a poyata i realitzar la major part, sinó tot el protocol d'extracció afectat a l'interior de cabina microbiològica. e) Si s'estan realitzant postes apunt de mètodes de forma conjunta amb procediments ja implantats, segregar l'aplicació dels mateixos per evitar confusions i errors dels analistes. f) Realitzar una reunió amb tot l’equip del Laboratori de PCR per a identificar punts crítics o de risc i proposar assaigs de control específics per a identificar la causa de les contaminacions, prioritzar-los i definir millores. 7 REGISTRE I GESTIÓ DE MOSTRES - Internes: Les mostra interna control (MIC) s’identifiquen al LAB-1195 o s’indicarà la seva composició juntament amb la data i les inicials de qui es responsabilitza de la seva preparació. El codi d’identificació serà: MIC – any - núm d’ordre correlatiu - Externes: Veure XX/1/006 8 REGISTRE DE PRODUCTES I REACTIUS Tots els productes que es facin servir al laboratori de PCR tindran una carta de control per producte on hi constarà el nom o descripció, el fabricant , la referència fabricació, la presentació (si aplica), i referència del laboratori (si se n’hi ha donat). També aplica a primers i oligonucleòtics de síntesi. A Aquests fulls com a mínim s’hi registrarà seguin l’orde de recepció: Lot i caducitat, dates de recepció, inici i final així com les inicials de qui registri dita informació, i també si es realitzen alíquotes, quantes i de quina magnitud.. 9 BIBLIOGRAFIA - AFNOR XP 90-471:avril 2010. Détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (RT-PCR). XX/1/0035 Edició: 5 Data: 10/04/2019 Pàg. 9 de 10 Laboratori - AFNOR XP T 90-471:avril 2006. Détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). - UNE-EN ISO 22174:2005. Microbiologia de los alimentos para consumo humano y animal – Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de patógenos en los alimentos. XX/1/0035 Edició: 5 Data: 10/04/2019 Pàg. 10 de 10