Tema 3 Biomol PDF - Biología Molecular
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Universidad Europea de Madrid
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Este documento trata sobre la replicación del ADN. Explica los procesos en procariotas y eucariotas. Incluye información sobre el experimento de Meselson y Stahl para demostrar la replicación semiconservativa.
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tema-3-biomol.pdf jescudero7 Biología Molecular 1º Grado en Biomedicina Facultad de Ciencias Biomédicas y de la Salud Universidad Europea de Madrid Reservados todos los derechos. No se permite la explotación econó...
tema-3-biomol.pdf jescudero7 Biología Molecular 1º Grado en Biomedicina Facultad de Ciencias Biomédicas y de la Salud Universidad Europea de Madrid Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. REPLICACION DEL ADN ÍNDICE: 1. Introducción: dogma central 2. Características 3. Enzimas y factores implicados 4. Replicación en procariotas (E. coli) ▪ Iniciación (inicio, ensamblaje del primosoma y entrada de la holoenzima: ADN Pol III) ▪ Elongación (ADN Pol IIII, ADN Pol II y ligasa) ▪ Terminación 5. Replicación en eucariotas 6. Síntesis de telómeros 7. Replicación en virus 8. La replicación del ADN como diana terapéutica DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR CARACTERÍSTICAS ▪ Cada cadena del ADN servirá de molde para la formación de una cadena hermana. ▪ Se trata de un mecanismo idéntico en todos los organismos. ▪ Es semiconservativa. ▪ La zona donde comienza se llama punto de origen. ▪ Avanza de forma bidireccional. ▪ Progresa en dirección 5’,3’. ▪ Es semidiscontinua. ▪ Hay muchas enzimas implicadas. EXPERIMENTO DE MESSEHSON Y STAHL: para demostrar que la replicación era semiconservativa: se realizó un cultivo de E. coli durante varias generaciones en un medio con 15N; al extraer ADN de estas células y centrifugarlo, las moléculas de ADN se situaban en el punto donde su densidad igualaba la del medio. El ADN de estas células tenía una mayor densidad que el de otras cultivadas con 14N. Posteriormente, las células de E. coli que solo contenían 15N en su ADN se colocaron en un medio con 14N y se les permitió que se replicaran una sola vez; se extrajo el ADN de estas células y se comparó con el preparado con 14N y con el preparado con 15N, encontrando que su densidad era prácticamente el promedio; dado que una replicación conservadora hubiera producido iguales cantidades de ADN de mayor y menor densidad, se descartó que la replicación siguiera el mecanismo conservador. Posteriormente, se extrajo ADN de células que habían crecido por varias generaciones en un medio con 15N, y se les permitió que realizaran dos replicaciones en un medio con 14 N. Al analizar estas células se encontró que contenían cantidades iguales de ADN con dos densidades distintas, una igual a la obtenida tras a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6448984 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. una sola replicación en un medio con 14N, mientras que la otra correspondía al ADN producido exclusivamente con 14 N; este resultado era consistente con una replicación semiconservadora. Hay un solo origen de replicación (procariotas), demostrado mediante microscopia electrónica; se trata de una replicación bidireccional, yendo en los dos sentidos gracias a las horquillas de replicación que se encuentran en ambos extremos. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. La replicación avanza siempre en un sentido fijo, es decir, se lee en sentido 3,5 y se sintetiza en sentido 5,3. La hebra conductora/continua/líder es la que se sintetiza en la misma dirección del movimiento de la horquilla y la hebra retardada/discontinua/retrasada es la que va opuestamente a la dirección del movimiento de la horquilla, esta hebra genera fragmentos de Okazaki, los cuales son pequeños fragmentos (de ARN o primer y ADN) que se sintetizan en el sentido 5,3 contrario al movimiento de la horquilla y, debido a eso, la polimerasa retrocede hasta la horquilla (lazo) y sintetiza otro pequeño fragmento, y así sucesivamente; esto ocurre simultáneamente en ambas horquillas de replicación. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6448984 Esta cuenta de ING es como la opinión de tu ex: NoCuenta. Biología Molecular Banco de apuntes de la ENZIMAS Y FACTORES PROTEICOS IMPLICADOS Un replisoma (sistema ADN replicasa) es el conjunto de enzimas y proteínas que participan en la replicación. Polimerasa: polimerización (síntesis) y corrección de errores. Helicasa: separación de cadenas, rotura de puentes de H, gasto de ATP; creación de la burbuja de Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. replicación. Topoisomerasa: rompe los superenrollamientos y elimina las tensiones en el ADN. SSBs (single stranded binding proteins): estabilizan las cadenas separadas. Primasa: sintetiza primers o cebadores (aportan un extremo 3’ OH libre a la Pol). Ligasa: sella cortes o mellas (rellena los huecos que se crean entre los segmentos de Okazaki). Para el proceso de replicación se requiere de: Sustratos (dNTPs: desoxinucleotidos trifosfatos): dATP, dGTP, dCTP y dTTP. Cofactores (oligoelementos): Mn2+ o Mg2+. Molde o plantilla: hebra parental. Cebador (primer): 3’ -OH libre (molécula de ARN emparejado con la hebra parental de forma complementaria y antiparalela). El primer (cebador) es necesario pues la polimerasa no es capaz de iniciar la síntesis desde cero, es decir, no es capaz de incorporar el primer nucleótido, por lo que comienza a sintetizar seguida al cebador. Este es sintetizado por la primasa y proporciona el extremo 3’ OH a la Pol. La procesividad es el número de nucleótidos que es capaz de añadir la polimerasa antes de disociarse (la procesividad es mayor en la hebra continua que en la discontinua) REPLICACIÓN DEL CROMOSOMA DE E. COLI (proc) La replicación se da en tres fases (diferentes reacciones y enzimas implicadas): iniciación, elongación y terminación. El proceso de inicio de la replicación requiere de: DnaA protein: reconoce secuencias de origen y abre mínimamente el lugar de origen en puntos específicos. DnaB protein (helicasa): desenrolla y separa las hebras de ADN DnaC protein: necesario para la unión de DnaB en el punto de origen. HU: similar a las histonas, proteína de unión al ADN y estimula la iniciación. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6448984 Esta cuenta de ING es como la opinión de tu ex: NoCuenta. FIS: proteína de unión al ADN y estimula la iniciación. IHF: proteína de unión al ADN y estimula la iniciación. Primasa (DnaG protein): sintetiza primers de ARN. SSBs: se une al ADN monocatenario (ss) y estabilizan las hebras sencillas. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. DNA girasa (DNA topoisomerasa II): alivia la tensión generada por el desenrollamiento del ADN y elimina los superenrollamientos. Dam metilasa: metila secuencias GATC en el oriC (5’). 1 INICIACIÓN Estructura del origen de replicación (oriC): 245pb (pares de bases) y posee secuencias consenso muy conservadas evolutivamente: ▪ Aparece una zona DUE (ADN relajado o laxo) donde se abre la hebra ligeramente. ▪ 5 sitios R y 3 sitios I donde se une la DnaA (proteína clave en el proceso de inicio de la replicación) ▪ Sitios IHF y FIS donde se unen factores que estimulan la replicación (no son indispensables) 1.1 FASE PREVIA (INICIO) 1. Ocho moléculas de DnaA unidas a ATP se unen a zonas R e I del oriC. 2. El ADN se desnaturaliza en la zona DUE dependiente de DnaA. 3. El DnaC-ATP ayuda a DnaB (helicasa) a unirse al ADN (forma una apertura en el anillo hexamérico del DnaB). 4. Se unen dos helicasas en las hebras desnaturalizadas. Al replicarse, el material genético se ancla a la membrana plasmática (para no estar disperso en el citoplasma); además, hay una lenta hidrólisis del ATP por proteína DnaA (la forma activa este en ATP y la inactiva en ADP); la metilación del ADN del oriC se da gracias a la acción de las metilasas Dam. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6448984 Esta cuenta de ING es como la opinión de tu ex: NoCuenta. La ADN polimerasa III (en procariotas se nombran con números y en eucariotas con letras añade desoxirribonucleótidos al griegas) Hebra cebador o primer. conductora La helicasa, conectada a la polimerasa, Hebra rezagada separa las hebras de ADN, rompiendo los puentes de hidrógeno; cada una de estas hebras pasa por uno de los núcleos de la polimerasa (α, ε, θ) y, en las subunidades α, se sintetizan las hebras nuevas (se añaden los nucleótidos); los núcleos de polimerasa están unidos a la helicasa por los brazos tau (τ); a su vez, están unidas a las subunidades δ (delta), δ’ y γ (gamma), y este complejo recibe el nombre de complejo de carga de la abrazadera o complejo γ, el cual mantiene las abrazaderas β abiertas hasta que se una la molécula de ADN y carga las abrazaderas β en la hebra rezagada en cada fragmento de Okazaki; las abrazaderas β (terminaciones de los núcleos de polimerasa) sujetan las moléculas de ADN para la síntesis. - Subunidad α: polimerización - Subunidad ε: corrección de exonucleasa 3’-5’ - Subunidad θ: estabilizar sub. ε - Subunidad τ : unión y dimerización de enz. central - Subunidad γ: cargador de pinzas - Subunidad δ: abridor de pinzas - Subunidad δ‘: cargador de pinzas - Subunidad χ: interacción con SSB - Subunidad ψ: interacción con γ y χ - Subunidad β: abrazadera de ADN 2 ELONGACIÓN ▪ Un lazo en la hebra rezagada aproxima los dos puntos de polimerización. ▪ Cada núcleo de la polimerasa sintetiza una hebra distinta. ▪ El cebador del fragmento de Okazaki anterior se aproxima a las subunidades núcleo. ▪ El primosoma se forma de nuevo para la síntesis de otro primer (se disocia tras formar el primer). El fragmento de Okazaki 1 ya está sintetizado y la Pol III de la hebra retardada ya está sintetizando el fragmento de Okazaki 2. La primasa se asocia temporalmente a DnaB para sintetizar un nuevo primer para el fragmento de Okazaki 3. El complejo de carga de la abrazadera coloca una nueva abrazadera en el nuevo primer para el frag. de Okazaki 3. El core de Pol III continua con la síntesis del fragmento de Okazaki 2 y, al acabarla, se encuentra con el primer del fragmento de Okazaki 1. La nueva abrazadera está en el primer 3 y la abrazadera que ha participado en la síntesis del fragmento 2 se disocia. La abrazadera ocupa su posición en el core de la Pol III y comienza la síntesis del fragmento de Okazaki 3. Una vez completada la síntesis del fragmento de Okazaki, la replicación se detiene y el núcleo se separa de la abrazadera, la cual se deshecha y es retenida por el complejo cargador de la abrazadera, hasta que llegue el siguiente fragmento de Okazaki. Para que la abrazadera β esté abierta se necesita la hidrólisis de 3 moléculas de ATP. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6448984 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. La ADN Pol I elimina ribonucleótidos del cebador y los reemplaza por desoxirribonucleótidos, se da el traslado de la mella y la ADN ligasa sella la mella. Traslado de la mella o corte: fragmento de ADN o ARN a reemplazar: se polimeriza en extremo 3’OH por la polimerasa, se degrada en extremo 5’P por la exonucleasa; el corte o mella se traslada; la polimerasa se disocia y la mella queda a la espera de Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. que otra enzima la selle. ▪ Exonucleasa: quita nucleótidos en los extremos. ▪ Endonucleasa: quita nucleótidos en el interior. ▪ ADN polimerasa I: madura los fragmentos de Okazaki y repara el ADN. ▪ Fragmento pequeño: contiene actividad exonucleasa 5’-3’. ▪ Fragmento grande/Klenow: elimina el dominio que contiene la actividad exonucleasa 5’-3’, se obtiene por tratamiento enzimático, conserva la actividad de polimerización y de corrección de errores con la actividad exonucleasa 3’-5’: ▪ La actividad exonucleasa se localiza por delante de la actividad polimerasa en el desplazamiento de la E a lo largo del ADN; una forma tautomérica imino de la citosina se aparea con la A y se incorpora a la cadena en crecimiento. Errores en el apareamiento: son reparados por la polimerasa I: sustituye los nucleótidos incorporados incorrectos pues la geometría de los pares de bases incorrectos es muy diferente a la de los pares de bases A-T y C-G. Los tautómeros son isómeros naturales de las BN que se diferencian en la posición del grupo funcional (A y C: amino-imino; G y T: ceto-enol): si la actividad exonucleasa 3’-5’ de la polimerasa no actúa, se fija la mutación. Mecanismo de reacción de la ADN ligasa: el fosfato debe ser activado por adenilación; las ligasas de las bacterias utilizan NAD+ como fuente del grupo activador AMP. 1. Se adenila la ADN ligasa (AMP-enzima). 2. El AMP se transfiere desde la enzima al 5’P de la mella (estado activado/adenilado). 3. El -OH 3’ de la mella ataca el P en 5’ y libera el AMP, formando un enlace fosfodiéster que sella la mella. 3 TERMINACIÓN Las dos horquillas se encuentran en una región terminal y hay múltiples copias de la secuencia Ter (hay dos grupos de secuencia Ter con orientaciones opuestas): ▪ Atrae y facilita la unión de proteínas Tus, formando el complejo Tus-Ter, el cual detiene la horquilla de replicación. ▪ Evita la sobrerreplicación. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6448984 Esta cuenta de ING es como la opinión de tu ex: NoCuenta. La replicación entre las horquillas deja los dos cromosomas circulares encadenados o catenados y la Topoisomerasa IV de tipo II corta transitoriamente las dos hebras de uno de los cromosomas. E. coli tiene 5 polimerasas: ▪ ADN polimerasa I: función de limpieza en la replicación, recombinación y reparación. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. ▪ ADN polimerasa II: implicada en un tipo de reparación. ▪ ADN polimerasa III: enzima principal de la replicación. ▪ ADN polimerasa IV y V: implicadas en reparaciones. REPLICACIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL Modelo de desplazamiento de hebra: la replicación del ADN mitocondrial requiere de: ▪ ARN pol mt: síntesis de un ARN cebador. ▪ ADN pol γ: elongación de la hebra naciente de ADN. ▪ SSBmt: se anclan a la hebra sencilla. ▪ Topoisomerasa I. ▪ Helicasa mt Twinkle: enzima/proteína de unión al ADN mt y la ADN pol γ. Hay dos orígenes de replicación: OriH (bucle D) y OriL y la replicación es continua en ambas cadenas a partir de dichos puntos. - Trascribe fragmento en LSP. - Transición ARN-ADN en OH. - ARN cebador precursor se escinde por una endonucleasa. REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS La replicación en eucariotas es similar a la bacteriana: es semiconservativa, bidireccional y semidiscontinua. Se da en la fase S del ciclo celular y desde diferentes puntos fijos. Los replicones en la eucromatina se inician antes que en la heterocromatina. Los orígenes de replicación/ARS (secuencias de replicación autónomas) no están bien definidos. El número de replicones utilizados en cualquier ciclo está estrictamente controlado; en el desarrollo embrionario se activan más orígenes que en células adultas a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6448984 Esta cuenta de ING es como la opinión de tu ex: NoCuenta. que presentan un crecimiento más lento. En eucariotas hay muchos más orígenes de replicación y la velocidad en eucariotas es mayor que en procariotas. El ensamblaje del complejo pre-replicativo requiere la presencia de: ▪ ORC: complejo de reconocimiento del origen. ▪ CDC6: ATPasa análoga a DnaC, cell division cycle (se separa del complejo Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. mediante hidrólisis de ATP). ▪ MCM: varias proteínas del mantenimiento forman un complejo hexámero (MCM2 a MCM7), son análogas a DnaB. ▪ CDT1: requerida por complejo MCM2-7 (se separa del complejo mediante hidrólisis de ATP). Hay varias polimerasas en la horquilla de replicación, las cuales son menos procesivas y actúan con más fidelidad: ▪ ADN pol α: actividad primasa. ▪ ADN pol δ: asociada a PCNA; actividad exonucleasa 3’-5’ correctora de pruebas; síntesis de las hebras conductora y rezagada. ▪ ADN pol ε: reemplaza a ADN pol δ en reparación del ADN. La proteína RP-A recubre el ADN de cadena sencilla, se requiere una abrazadera (PCNA) y su complejo de carga (RFC). La terminación de la replicación requiere la síntesis de los telómeros (extremos del cromosoma). Las células eucariotas tienen muchas polimerasa que actúan con alta fidelidad: alfa, delta, épsilon y gamma; las tres primeras pueden actuar en replicación nuclear y reparación de ADN dañado, la gamma actúa en la replicación mitocondrial y la beta actúa en la reparación por escisión de base. DIFERENCIAS ENTRE LOS FACTORES EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6448984 Esta cuenta de ING es como la opinión de tu ex: NoCuenta. SÍNTESIS DE LOS TELÓMEROS Los telómeros se sintetizan al terminar la replicación eucariota, pues en los extremos de los cromosomas, al extraer/degradar el fragmento de ARN, se queda un hueco y, de este modo, los cromosomas se acortarían en cada división. No hay molde disponible para el apareamiento del cebador: no se puede replicar, por lo que los cromosomas se acortarían en cada generación celular. La síntesis la lleva a cabo la telomerasa (ARN y proteínas), realizando muchas copias en tándem. La región de cadena sencilla está protegida por proteínas de union específicas (eucariotas inferiores). En eucariotas superiores se forma el lazo T: el extremo de cadena sencilla plegado y apareado con una secuencia complementaria en la región de doble cadena del telómero y protegen el extremo 3’ del cromosoma de las nucleasas y E reparadoras de roturas. Posibles estructuras teloméricas: ▪ Quadruplex de Guanina (extremo 3’ de cadena rica en G). ▪ Bucle T (por insercion del extremo 3’ de la cadena rica en G y generacion de bucle D). La pérdida de la telomerasa es la responsable del envejecimiento pues produce el acortamiento gradual de los telómeros y, de esta forma, la muerte de la linea celular; en el hombre, las células germinales mantienen la actividad telomerasa (mantienen la longitud de los telómeros), las células somáticas carecen de telomeras (los telómeros se acortan gradualmente) y, en el caso de las células tumorales, sí que se mantiene la actividad telomerasa; cuanto mayor sea la longitud de los telómeros, menor será la edad del individuo. REPLICACIÓN VÍRICA Clasificación Baltimore: los grandes grupos de virus se forman tomando como referencia el genoma vírico: constituido por ADN o ARN y pudiendo ser ss o ds; además, si el ARN de los ss puede actuar como ARNm, se dice que poseen polaridad +, en cambio, si necesitan ser copiados a ARNm, se consideran con polaridad -; en ds (tanto de ADN como ARN), una cadena se considera + si tiene el mismo sentido o polaridad que el ARNm del virus, y – si tiene sentido o polaridad opuesta (complementaria del ARNm del virus). ▪ dsDNA: deben entrar en el núcleo del huésped (usan las polimerasas del huésped), a excepcion de Adenovirus y Herpesvirus (con replicasas propias) y Poxvirus (no replica en el núcleo). ▪ ssDNA: replican en el núcleo, pasan a dsDNA durante la replicación mediante las polimerasas del huésped. (ej: Bacteriófago M13) a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6448984 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. ▪ dsRNA (genoma segmentado): es poco conocido y se da a partir de cada hebra (ej: Reovirus). ▪ ssRNA (+): replican en el citosol y pueden ser utilizados directamente por los ribosomas y para la síntesis de proteínas (ej: Polivirus). ▪ ssRNA (-): se da en el citosol, no puede ser leído directamente por el ribosoma, necesita una ARNpol dependiente de ARN para obtener la cadena complementaria (se usa como colde del ARNm+) (ej: Virus de la rabia). ▪ ssRNA (+): la transcriptasa reversa/inversa o retrotranscriptasa convierte el ARN+ en ADN, el Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. cual viaja al núcleo donde se integra en el genoma del huésped por acción de la integrasa. (ej: retrrovirus como VIH) Los retrovirus poseen una ADN polimerasa dependiente de ARN presente únicamente en algunos virus de ARN; dicha enzima, la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa, cataliza tres reacciones diferentes: ▪ Síntesis de ADN dependiente de ARN. ▪ Degradación de ARN. ▪ Síntesis de ADN dependiente de ADN. Además, tiene la máxima actividad con ARN propio, requiere un cebador (ARNt, secuencia en 3’ complementaria al ARN vírico), sintetiza el ADN en 5’-3’ y no posee capacidad exonucleasa 3’-5’ correctora de pruebas (hay una alta tasa de mutación lo que da luegar a nuevas cepas). Algunos retrovirus contienen un gen que provoca que la célula crezca anormalmente, dichos genes reciben el nombre de oncogén. LA REPLICACIÓN DEL ADN COMO DIANA TERAPÉUTICA El Aciclovir es un fármaco inhibidor de polimerasas que actúa contra el virus del herpes simple; inhibe la replicacion en varias etapas (es sustrato de la timidina quinasa vírica que lo fosforila y el compuesto fosforilado es inhibidor competitivo de la polimerasa del herpes) y tiene mayor afinidad por la polimerasa vírica que la celular; ademas, carece de extremo 3’OH, por lo que si se incorpora al ADN actúa como terminador. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6448984 Esta cuenta de ING es como la opinión de tu ex: NoCuenta.