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VM Versuch 1: Wachstum und Biofilmbildung bei Bakterien: Versuch 1, Teil I: Wachstum von Mikroorganismen In diesem ersten Versuch werden wir versuchen Zwei Stämme (MC4100 und HfrG6), die in einer Kultur gewachsen sind, durch einen Verdünnungsaustrich (oder auch zwei) voneinander zu tr...

VM Versuch 1: Wachstum und Biofilmbildung bei Bakterien: Versuch 1, Teil I: Wachstum von Mikroorganismen In diesem ersten Versuch werden wir versuchen Zwei Stämme (MC4100 und HfrG6), die in einer Kultur gewachsen sind, durch einen Verdünnungsaustrich (oder auch zwei) voneinander zu trennen. Micrococcus luteus von einer Luftkeimplatte zu isolieren. Wachstumskurven von E. coli in reichem Medium und in Minimalmedium zu erstellen und zu zwei Zeitpunkten eine Lebendzellzahlbestimmung durchzuführen. 2  Herstellung einer E. coli Mischkultur aus HfrG6 und MC4100 und anschließender Verdünnungsausstrich Setzen sie eine 5ml Übernachtkultur der beiden E. coli Stämme MC4100 und HfrG6 im Reagenzglas an. Sterilkontrolle nicht vergessen. Inkubieren sie diese bei 37°C im Rollinkubator (Bereits am Montag geschehen). Mischen sie 500µl der beiden Übernachtkulturen in einem 1,5ml Eppendorfgefäß. Tauchen sie die sterilsierte Impföse in das Eppendorfgefäß ein und streichen sie die die Wikipedia Zellen auf einer MacConkey-Platte in der 3-Strichtechnik aus. Bitte die Impföse nur leicht auf den Agar legen (s.u.). 1)Zickzack im 1. Drittel der Platte, Öse sterilisieren! 2)Zickzack im 2. Drittel, die ersten Züge überstreichend, Öse sterilisieren! 3)Zickzack im letzten Drittel, die zweiten Züge überstreichend Ziel ist es, eine weiße und eine rote Einzelkolonie auf der Platte zu haben, die dann nochmals am folgenden Tag ausgestrichen wird. PortalUniFreiburg.de 3 Isolierung von Reinkulturen aus einer Mischkultur Die Mischkultur, die sie auf der vorhergehenden Folie ausgestrichen haben, hat zwei E. coli Stämme enthalten: MC4100 und HfrG6 Der entscheidenen Unterschied dieser Stämme ist, das HfrG6 lac+ ist, d.h. das lac-Operon ist vorhanden, während in MC4100 das lac-Operon deletiert ist. Bitte informieren sie sich hier über die Zusammensetzung von McConkey Platten: https://www.spektrum.de/lexikon/biologie/macconkey-platten/40444 Wie rechts könnte nun ihre Platten aussehen: Wenn die Vereinzelung gelungen ist , sehen sie rote und weiße Kolonien. Diese sollten dann nochmals auf MacConkey Platten ausgestrichen werden, um zu sehen, ob es sich auch tatsächlich schon um eine Reinkultur handelt. http://gulig.med.ufl.edu/Virtual-Micro- Lab/case1-mac.htm  Reinkultur Wenn sie eine Reinkultur isoliert haben, sollte ihre Platte so aussehen: Zwischen den roten Kolonien keine weißen Kolonien und umgekehrt. Bei den roten Kolonien ist es viel schwerer, weiße Kolonien dazwischen zu entdecken, so dass man da am besten zur Sicherheit einen dritten Ausstrich durchführen würde. Das Ziel ist damit erreicht: Sie haben HfrG6 und MC4100 voneinander getrennt. https://microbeonline.com/macconkey-agar-mac-composition-preparation-uses-and-colony-characteristics/ 5 Isolierung von Micrococcus luteus von einer Luftkeimplatte Im Basismodul hatten wir bereits eine Luftkeimplatte angesetzt. Das wollen wir so wieder tun, d.h. eine LB-Platte etwa 30min lang geöffnet an einem Platz ihrer Wahl aufstellen, in oder außerhalb des Gebäudes. Danach erfolgt eine Inkubation für mindestens 2 Tage bei Raumtemperatur. Dies sollte zum Wachstum verschiedener Luftkeime auf der Platte führen. 6 Micrococcus luteus Bitte informieren sie sich über diese Spezies unter: https://de.wikipedia.org/wiki/Micrococcus_luteus Ihre Luftkeimplatte könnte wie die Platte rechts aussehen. Eine M. luteus Kolonie ist zitronengelb und glänzend, vielleicht die mit dem Pfeil gekennzeichnete Kolonie, wir werden es nie erfahren. Bild: Dr. A. Quentmeier, TU Dortmund. Rechts unten ist M. luteus schematisch gezeigt: Warum sind die Bakterien hier dunkelviolett gefärbt? Wie nennt man zwei oder vier zusammenhängende Kokken? Warum können sie M. luteus nicht auf unter Schutzatmosphäre verpackten Hackfleisch nachweisen? 7 https://de.cleanpng.com/png-bjx7ca/ Micrococcus luteus unter dem Lichtmikroskop Im Phasenkontrast sollten sie ein Bild wie rechts oben sehen, wenn sie M. luteus isoliert haben. Sie sehen die zusammenhängenden Kokken recht gut. http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/shapimag.htm#Colony%201 Das Bild darunter zeigt dieselbe Spezies, mit Kristallviolett gefärbt. http://www.napavalley.edu/people/srose/PublishingImages/Micrococcus%20luteus%20-%20Gram%20Stain.jpg 8 Wachstumskurven von E. coli in reichem Medium und in Minimalmedium Die Unterscheidung von reichem Medium und Minimalmedium Stammlösungen Benötigte (auch definiertes Medium genannt) ist wichtig: Menge auf Wir verwenden LB (Lysogeny Broth) als reiches Medium: Es 200ml besteht aus 10g Trypton (verdautes Muskelfleischextrakt), 5g 10xM9 NaCl und 5g Hefeextrakt auf 1l Medium. Als Minimalmedium verwenden wir M9 mit 0,2% Glucose als 200mM MgS04 Kohlenstoffquelle: Die Salze werden in 10-facher Konzentration angesetzt: 10x M9: 128 g Na2HPO4.7H2O, 30 g KH2PO4, 5 g NaCl, 10 g NH4Cl. 10mM CaCl2 Man benötigt außerdem noch 200mM MgS04 ,10mM CaCl2 und 20% Glucose als Stammlösungen. Die Endkonzentrationen im 20% Glucose fertigen Medium sollen 2mM MgS04 , 0,1mM CaCl2 und 0,2% Glucose sein. Steriles destilliertes Wasser Bitte füllen sie nebenstehende Tabelle für das Ansetzen von 200ml M9-Medium mit 0,2% Glucose aus. 9 Reiches Medium vs. Minimalmedium Aus den Anleitungen zur Herstellung der beiden Medien lassen sich folgende Schlüsse ziehen: Reiches Medium: Enthält Hefeextrakt und Fleischextrakt, d.h. sehr viele unterschiedliche Komponten von Zellen, also organische Moleküle: Proteine, Aminosäuren, Nukleotide, Fettsäuren, Fette, Einfachzucker, Mehrfachzucker, Stoffwechselprodukte aller Art, Phospolipide usw. Minimalmedium: Enthält nur unterschiedliche Salze und eine einzige organische Substanz: Glucose. In welchem Medium erwarten sie ein schnelleres Wachstum und warum? 10  Vorbereitungen: Übernachtkultur Bevor wir eine Wachstumskurve aufnehmen, müssen wir am Tag zuvor eine Übernachtkultur ansetzen, in demselben Medium, in dem wir dann das Wachstum verfolgen wollen. Das hat den Sinn, dass die Bakterien bereits an Medium und Temperatur angepasst sind und das Wachstum nach dem Beimpfen sofort wieder aufnehmen können. Außerdem kann man mit einer bereits vorhandenen Flüssigkultur die Kolben mit einer bestimmten Optischen Dichte animpfen. Das ist auch dann wichtig, wenn wir das Wachstum verschiedener Stämme in dem selben Medium verfolgen wollen, um zu sehen, ob z.B. eine Mutante schlechter wächst als der Wildtypstamm. Das Prinzip des Animpfens einer Kultur ist hier dargestellt: https://www.youtube.com/watch?v=rydQVvo8rM0 In dem Video hat die Dame eine Einzelkolonie angeimpft. Warum tun wir das nicht, wenn wir einen bereits vorhandenen Stamm animpfen wollen? Je nach dem, viele Kulturen wir aus der Übernachtkultur animpfen wollen, können wir alternativ auch in Reagenzgläsern animpfen. Welchen unverzeihlichen Fehler hat die Dame in dem Film begangen? Hier ist es nicht ganz so schlimm, da sie hoffentlich frisch autoklaviertes Medium verwendet hat. 11  Animpfen der Erlenmeyerkolben aus Übernachtkulturen Bitte sehen sie sich folgenden, sehr gelungenen Film zur Messung der Optischen Dichte von Bakterien an: LB mit M9 mit https://www.youtube.com/watch?v=_5_tlot3rvs 0,02 0,06 Aus den Übernachtkulturen werden nun 30ml Kulturmedium beimpfen beimpfen im 100ml Kulturkolben angeimpft, die LB Kultur mit einer OD600 OD600 der 3,5 1,3 (also Messung der Absorption bei 600nm) von 0,02, die M9- Übernachtkultur Kultur mit einer OD von 0,06. Verdünnungsfaktor Jeder Student/in impft entweder eine M9 oder eine LB Kultur an. Volumen der Bitte füllen sie nebenstehende Tabelle aus. Korrekterweise Übernachtkultur, um müssen sie nach dem Animpfen ein Gesamtvolumen von 30ml 30ml Kultur anzu- haben und die Bakterien nicht einfach zu den 30ml Medium impfen dazugeben. Sie können die Formel: V1 x OD6001 = V2 x OD6002 verwenden. 1 ist ihre Übernachtkultur und 2 der 30ml Erlenmeyerkolben, der angeimpft werden soll. 12 Bestimmung der OD600 entlang der Wachstums- kurve in reichem und Minimalmedium Sie haben die Kulturen also angeimpft und sie schütteln im Wasserbad bei 37°C. Sie messen nach zu bestimmten Zeiten die Absorption (OD600) bei 600nm im Photometer, wie in dem Video auf Folie 12 gezeigt. Sie könnten dann, wenn sie sehr lange gemessen hätten, was für sie als hoch- motivierte Studenten selbstverständlich gewesen wäre, die Werte auf der nächsten Seite erhalten haben: https://www.fishersci.no/shop/products/stainless-steel-water-bath-shakers/11349874 13 Wachstumskurven in LB und Minimalmedium M9: Nr. Zeit (h) OD600 LB: Nr. Zeit (h) OD600 1 3 0,15 1 1 0,08 2 4 0,23 2 1,5 0,15 3 5 0,32 3 2 0,31 4 6 0,45 4 3 0,78 5 7 0,62 5 3,5 1,4 6 8 0,85 6 4 1,9 7 9 1,1 7 5 2,7 8 10 1,2 8 5,5 3,1 9 10,5 1,3 9 6 3,4 10 11 1,2 10 6,5 3,8 Bitte erstellen sie eine Grafik mit dem Wachstum beider Kulturen und ermitteln sie grafisch die Verdopplungszeit beider Kulturen während des logarithmischen Wachstums. Einige Erläuterungen finden Sie auf den nächsten beiden Folien. 14 15 Typische Wachstumskurve für eine Bakterienpopulation in einer statischen Kultur In der Lag Phase passen sich an die neuen Bedingungen an. Sie werden ja aus einer stationären Kultur nun in ein neues Medium überführt mit reichlich Nährstoffen. Besonders in LB ist die Lag Phase kaum sichtbar, da die Zellen sofort anfangen zu wachsen. Besonders wenn aus LB in Minimalmedium angeimpft wird, dauert die Lag Phase recht lange. Typische Wachstumskurve einer bakteriellen Population. Ein Lebendkeimzahlzählung misst die Zellen in der Kultur, die zur Vermehrung fähig sind. Die Trübung oder optische Dichte ist eine quantitative Messung der Lichtstreuung durch eine flüssige Kultur. Aus: Madigan, M. T., Martinko, J. M., Stahl, D. A., Clark, D. P. (eds.) Brock Mikrobiologie. 13. Aktualisierte Auflage. PEARSON Deutschland GmbH. 2013 16 Bestimmung der Generationszeit mithilfe einer halblogarithmischen Graphik In ihrem Schaubild können sie nicht die absolute Zellzahl auf der y-Achse auftragen, sondern stattdessen die OD600. Sonst ändert sich aber nichts. Sie müssen die Steigung der Gerade während des logarithmischen Wachstums bestimmen. Wie lange dauert es, bis sich die OD600 verdoppelt hat? Berechnung der Wachstumsparameter. Methode zur Schätzung der Generationszeiten (g) exponentiell wachsender Populationen mit Generationszeiten von (a) sechs Stunden und (b) zwei Stunden, die man auf halblogarithmischen Graphen eingezeichnet hat. Die Steigung einer jeden Kurve ist gleich 0,301/g und n ist gleich der Anzahl von Generationen, die in der Zeit t entstanden sind. Alle Zahlen sind in der wissenschaftlichen Schreibweise ausgedrückt; das heißt 10.000.000 ist 1 ´ 107, 60.000.000 ist 6 ´ 107 und so weiter. Aus: Madigan, M. T., Martinko, J. M., Stahl, D. A., Clark, D. P. (eds.) Brock Mikrobiologie. 13. Aktualisierte Auflage. PEARSON Deutschland GmbH. 2013 17 Lebendzellzahlbestimmung Sie sollen zum Zeitpunkt t = 0 und 2-3 Stunden nach Animpfen eine Lebendzellzahlbestimmung durchführen. Damit soll die tatsächliche Zahl der Bakterien zu diesen Zeitpunkten bestimmt werden. Dabei werden die Zellen so verdünnt, dass nach Ausplattieren auf einer LB Agarplatte ein Auszählen von Kolonien möglich ist. Die Zahl der Bakterien auf der Platte sollte also etwa zwischen 50 und 250 Bakterien sein, denn aus jedem Bakterium wächst über Nacht eine Kolonie heran, so dass die Anzahl der Kolonien gleich der Anzahl der ausplattierten Bakterien ist. Das gilt aber nur dann, wenn die Bakterien auch Kolonien bilden. 18  Lebendkeimzahlbestimmung nach serieller Verdünnung einer Probe aus der Kulturflüssigkeit Hier ist das Prinzip der Lebendzellzahlbestimmung gezeigt. Um einen “sinnvollen“ Verdünnungsfaktor zu ermitteln, muss man ungefähr wissen, welche OD600 ungefähr mit welcher Zellzahl korreliert. In LB gilt etwa: Eine ausgewachsene Kultur hat etwa eine OD600 von 4-5 und eine Zellzahl von ganz grob 109 Bakterien pro ml. Welche Verdünnungen würden sie durchführen, um auf den Platten dann auszählbare Kolonienanzahlen zu erhalten? Wählen sie drei Verdünnungsstufen., die sie ausplattieren. 109 Zellen pro ml 107 Zellen pro ml 1:100 …wie geht’s weiter? Bedenken sie, dass sie zum Schluss nur 100µl ausplattieren können, so dass sie 100 Kolonien auf der Platte erwarten, wenn sie von einer Verdünnung mit 103 Zellen/ml 100µl ausplattieren. Verfahren der Lebendkeimzählung unter Verwendung serieller Verdünnungen des Präparats und des Gussplattenverfahrens. Man kann einfach Wasser nehmen, um eine sterile Flüssigkeit für eine Verdünnungslösung zu erhalten, aber eine ausgewogene Salzlösung oder ein Wachstumsmedium können ein höheres Ergebnis ergeben. Der Verdünnungsfaktor verhält sich reziprok zu der Lösung. Für das Oberflächenplattierungsverfahren (siehe Abbildung 6.10) können weitere Verdünnungsschritte erforderlich sein, um Proben von 0,1 ml aufzutragen. Aus: Madigan, M. T., Martinko, J. M., Stahl, D. A., Clark, D. P. (eds.) Brock Mikrobiologie. 13. 19 Aktualisierte Auflage. PEARSON Deutschland GmbH. 2013  Ausplattieren Diese Technik haben wir bereits im BM kennengelernt: 100µl der Verdünnung auf die LB-Platte pipettieren Den Drigalski Spatel in Ethanol tauchen, kurz durch einem Bunsenbrenner ziehen, der Ethanol verbrennt, dabei den Spatel leicht nach unten halten, damit der brennende Alkohol nicht über die Finger läuft. Wenn der Alkohol abgebrannt ist, Spatel an der Innenseite des Deckels der Agarplatte abkühlen, dann die 100µl ausplattieren. Hier ist der Cell spreader, wie der Drigalski Spatel im Englischen heißt, vorgeführt: Https://en.wikipedia.org/wiki/Cell_spreader Welche beiden Fehler (zumindest könnten die Abläufe optimiert werden) macht der Demonstrator? 20 Biofilme Da wir noch einen kleinen Versuch zur Curlisynthese bei E. coli machen, muss ich ganz kurz Biofilme einführen, denn die Curli sind ein wichtiger Bestandteil der bakteriellen Matrix, einer zähen Substanz aus Polysacchariden und eben Curli, die die Bakterien auf Oberflächen produzieren, um sich an dieser festzuheften, aber auch um sich mit den anderen Bakterien zu vernetzen. Diese Matrix schützt die Bakterien auch gegen schädliche Einflüsse wie Antibiotika, bakterioziden Substanzen u.ä. 21  Die Entstehung eines bakteriellen Biofilms 5 m Bewegliche Einzelzellen bilden Klebemoleküle (Adhesine) an ihrer Oberfläche Sie heften sich damit an eine Oberfläche und beginnen sich zu vermehren Sie wachsen zu Mikrokolonien heran Die Zellen kommunizieren über kleine Moleküle, die sie in ihre Umgebung abgeben ‘Biofilmreifung‘: Die Bakterien produzieren eine schützende und stützende Matrix aus speziellen Polysacchariden und Proteinen Die Kolonie wächst zu einer Makrokolonie mit komplexer Architektur, ‘Versorgungsstraßen‘ und Arbeitsteilung - dem reifen Biofilm Reife Biofilme geben auch wieder Zellen ab oder können sich sogar wieder auflösen 22 Versuch 1, Teil II: Curlibildung Von gram negativen Bakterien wie E. coli sekretiert Zusammen mit Zellulose und anderen Komponenten der extrazellulären Matrix sind diese für die Anheftung der Bakterien an Oberflächen und für Zell-Zell-Kontakte im Biofilm verantwortlich Curli sind Komponenten der bakteriellen Außenmembran Wer mehr über Curli wissen möchte, der sei auf folgenden Artikel verwiesen: Curli Biogenesis and Function von Michelle M. Barnhart und Matthew R. Chapma, das pdf ist auf blackboard zu finden. Perov S, Lidor O, Salinas N, Golan N, Tayeb- Fligelman E, et al. (2019) Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens 15(8): e1007978. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1007978 https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1007978 23  Mit freundl. Genehmigung von Diego Serra und Regine Hengge Curli bei E. coli Rechts eine schematische 24,000x Darstellung des Curliaufbaus und des Transportsystems für Curli. Curli bestehen aus 2 Proteinen: CsgA und CsgB. Oben sieht man Stationär- phasenzellen, die in Curli eingebettet sind. Bitte beachten sie: Die Bakterien sind eher eiförmig als stäbchenförmig. Woran liegt das? https://sites.lsa.umich.edu/chapman-lab/research/ 24 Platten gießen Das Gießen von Platten mit Teeextrakt ist nicht ganz trivial, denn das Sterilfiltieren (bitte dazu folgenden Film ansehen: https://www.youtube.com/watch?v=Z51yJ4M0ReM) von Teeexakt wäre am besten, so hätte wir steriles Teeextrakt, das wir direkt zu dem Plattenmedium zugeben könnten. Leider enthält es zu viele große Bestandteile, so dass der Filter sofort „dicht“ ist und keine Flüssigkeit mehr hindurchgedrückt werden kann. Deshalb werden werden 200ml LB-Agar ohne NaCl autoklaviert oder in der Mikrowelle bereits vorhandener erhitzt (ohne NaCl zeigt sich der Phänotyp der Makrokolonien besser), dann wird für 10min ein Teebeutel direkt in den LB-Agar gehalten. Danach wird noch Kongorot und Commassie-Lsg zugegeben (2ml einer 20mg/ml Kongorot und 10mg/ml Commassie-Lsg auf 1l), diese färbt die Curli rot an. 25 Stämme W3110 (Wildtyp, bildet Curli) AR3110 (Wildtyp, bildet Curli und Cellulose) NS339 (csgD::kan) kann keine Curli ausbilden, da der Aktivator für die Strukturgene der Curli fehlt. 26 Durchführung Aus Übernachtkulturen der Stämme werden 3µl auf die verschiedene Platten getropft: LBon Platten ohne Tee, LBon Platten mit Grünem Tee, Schwarzem Tee, Früchtetee oder anderen. Wichtig dabei ist, dass die Tropfen auf die Platten aufgesetzt werden und nicht aus der Pipettenspitze auf die Platten fallen. Dann gibt es kleine Spritzer, die dann auch zu Kolonien heranwachsen, was für die Gesamtästhetik der Platte und auch die Auswertung ungünstig ist. Bei 28°C werden die Platten mehrere Tage inkubiert. Denn bei 37°C ist die Curlibildung inhibiert. 27 Ergebnisse Zwei wesentliche Erkenntnisse sollten aus der Auswertung der Platten gezogen werden können: W3110 Besonders grüner und schwarzer Tee hemmt das Wachstum der Kolonien die Curlibildung, die Kolonien bleiben weiß Als Beispiel dienen bereits veröffentlichte Bilder, teilweise sieht man auch den Effekt des Polyphenol EGCG, das das wirkungsvollste Polyphenol in diesen Tees im Bezug auf die Hemmung der Curlibildung ist. AR3110 Serra et al. (2016): Molecular Microbiology: Volume 101, Pages 136-151 28