UNIDAD 6: TÉCNICAS DE VALORACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD CELULAR PDF

Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico UNIDAD 6: TÉCNICAS DE VALORACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD CELULAR. Ciclo: Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico. Módulo: Técnicas de Inmunodiagnóstico. Docente: Laura María Ros Alcobas Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técn...

Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico UNIDAD 6: TÉCNICAS DE VALORACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD CELULAR. Ciclo: Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico. Módulo: Técnicas de Inmunodiagnóstico. Docente: Laura María Ros Alcobas Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico 1. ESTUDIO DE LOS LINFOCITOS: Los linfocitos son células responsables de la inmunidad específica o adquirida. Por esta razón, su estudio es importante en la valoración del sistema inmune. Estos estudios incluyen tanto pruebas de funcionalidad como de cuantificación de linfocitos. Para poder realizar un gran número de pruebas inmunológicas in vitro se requieren preparaciones purificadas o enriquecidas de linfocitos de sangre periférica. Entre ellas vamos a encontrar: Recuento de linfocitos T y B por métodos manuales. Pruebas de respuesta proliferativa hacia mitógenos (sustancia que induce proliferación celular) en cultivo. Determinación de antígenos HLA (human leukocyte antigens). Estudio de la respuesta al cultivo mixto de linfocitos, y otros procedimientos de utilidad tanto en el laboratorio clínico de rutina como en el de investigación. Por ello, se han desarrollado diferentes métodos de separación de los linfocitos del resto de componentes de la sangre, aunque el más usado hoy en día es la centrifugación de la muestra sobre un gradiente de densidad discontinuo. Para ello, vamos a llevar a cabo una centrifugación de la muestra sanguínea sobre una solución de densidad definida como es el Ficoll-Hypaque. 1.1 SEPARACIÓN DE LINFOCITOS POR CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE FICOLL. El Ficoll es un polímero de carbohidrato sintético de sacarosa y epiclorhidrina mezclado con sustancias químicas. La mezcla va a presentar una densidad mayor que la de los linfocitos, pero menor que la de los eritrocitos y granulocitos por eso hace que se hundan los eritrocitos y los granulocitos, mientras que las células mononucleares, es decir, los monocitos y los linfocitos, van a flotar. Además, provoca la aglutinación de los eritrocitos. El diatrizoato de sodio→ es un compuesto que, mezclado con el Ficoll, forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad, por lo que provee de la densidad óptima para la separación de las células y la osmolaridad necesaria para mantener su viabilidad. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Es por ello que, tras haber realizado la centrifugación de la muestra de sangre periférica, podremos obtenerlas células mononucleares fácilmente. El fundamento físico consiste en que, tras someter a centrifugación la muestra sanguínea junto al Ficoll, se van a separar las partículas en función de su densidad. Al centrifugar dicha muestra de sangre, cada componente de la sangre (granulocitos, eritrocitos, monocitos, linfocitos, etc), se desplazará hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazará más. La centrifugación de la sangre total hace que: Los granulocitos, más densos que el medio de separación, pasen a través de él y queden depositados en el fondo del tubo. Los eritrocitos se aglutines en contacto con el Ficoll y se depositen en el fondo del tubo. Las células mononucleares (linfocitos y monocitos) se queden en la interfase entre el plasma y el medio de separación, debido a que tienen una densidad menor. Por tanto, tras la centrifugación se observan tres fases en el tubo: Banda superior: Corresponde al plasma. Banda intermedio: de color blanco, contiene las células mononucleares. Banda inferior: de color rojizo, que es un sedimento formado por eritrocitos y granulocitos. Para obtener mejores resultados en esta separación, se puede adquirir la solución comercializada como solución Ficoll-Histopaque que está ajustada a una densidad de 1.077g/ml. Dicha técnica permite iniciar cultivos de estas poblaciones. Así se puede obtener la población de linfocitos y monocitos fácilmente. Estas poblaciones aparecen mezcladas pero los linfocitos son más numerosos. Permite recuperar alrededor de un 50% de los linfocitos presentes en la muestra, con Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico una viabilidad mayor del 90% (determinada mediante exclusión del azul tripán, que se explicará más adelante). No obstante, los mononucleares que se obtienen por esta técnica (>90% linfocitos) deben ser lavados con una solución balanceada de sales (SSB) o con el medio que se va a utilizar en la prueba particular, con el fin de eliminar restos del reactivo, de plasma y de plaquetas que pudieran quedar. 1.2 SEPARACIÓN DE POBLACIONES: Existen diversas técnicas que permiten separar poblaciones de linfocitos: o Separación celular inmunomagnética: utiliza partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos. Dependiendo del tipo de linfocito que se quiera separar se usan unos anticuerpos u otros. Las partículas mangnéticas retienen las células que tienen el antígeno correspondiente mientras que las demás quedan libres. Cabe destacar que una de las principales técnicas de separación células inmunomagnética es la MACS (Magnetic Activated Cell Sorting). o Técnicas de inmunotoxicidad: se separa una población determinada provocando la lisis de las células que no pertenecen a ella mediante la adición de anticuerpos y proteínas del complemento. o Panning para linfocitos: usa placas que se unen selectivamente, por ejemplo, a los linfocitos B. o Citometría de flujo: en la que una de sus aplicaciones es la caracterización de las distintas subpoblaciones de linfocitos. o Filtración con columnas de lana de nailon: es una técnica para obtener linfocitos T libres de linfocitos B y monocitos/macrófagos. Se basa en que los linfocitos B y los monocitos/macrófagos se adhieren a la lana de nailon mientras que los linfocitos T no lo hacen. Utiliza una columna o jeringa llena de lana de nailon, a través de la cual se hace pasar la muestra gota a gota. Los linfocitos B y monocitos/macrófagos se adhieren a la lana y quedan retenidos, mientras que los linfocitos T atraviesan la columna y se pueden recoger. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico 1.3 TÉCNICAS DE AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN, CULTIVO, PRESERVACIÓN Y CONGELACIÓN DE LÍNEAS CELULARES DE LINFOCITOS T. El cultivo de los Linfocitos T puede ser requerido para llevar a cabo diferentes pruebas, como puede ser la valoración de la respuesta mitogénica, por ejemplo. Para llevar a cabo el cultivo de Linfocitos, lo primero es el aislamiento, es decir, obtener una muestra de sangre y aislar las células mononucleares a través del gradiente de Ficoll. Una vez conseguidos los Linfocitos T, se realizar el cultivo de linfocitos T en el medio correspondiente según la prueba que se desee realizar. Respecto a las técnicas de congelación de líneas celulares de linfocitos T, es necesario hay que destacar que, para la congelación, se recomienda que la concentración deseada para dicha congelación sea de entre 7 – 15x 106 cel/ml; por lo que es probable que se necesite realizar una dilución. 1.4 TÉCNICAS DE VALORACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR. La capacidad de los linfocitos para dividirse y llevar a cabo la mitosis in vitro se ha usado como un criterio a la hora de evaluar la funcionalidad de los mecanismos de activación celular y proliferación durante las respuestas inmunológicas del organismo. Los linfocitos pueden ser inducidos a dividirse en un determinado cultivo usando una gran variedad de estímulos. La respuesta mitogénica de los linfocitos podrá ser cuantificada mediante una serie de técnicas basadas en la incorporación de la timidina triada (3H-T) al ADN celular. No obstante, podremos emplear otras técnicas como puede ser medir la actividad de las enzimas intracelulares o mitocondriales mediante técnicas colorimétricas. La estimulación mitogénica que se emplea en los cultivos puede ser de diferentes tipos, así: Activación por medio de antígenos del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) alogénicos en la técnica del cultivo mixto de linfocitos. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Activación por un antígeno exógeno en pacientes que han sido expuestos a dicho antígeno previamente. Activación por mitógenos policlonales como pueden ser algunos anticuerpos monoclonales dirigidos contra proteínas de superficie que son las que originan señales para la proliferación, ejemplos: anti-CD3. Dentro de este grupo vemos que existen algunos que tienen cierto grado de selectividad hacia una población de linfocitos en concreto, Linfocitos T o Linfocitos B, por lo que pueden ser usados con mayor especificidad para evaluar el estado funcional de dicha población en un individuo. Así, tendremos dos mitógenos que van a ser selectivos para los Linfocitos T de los seres humanos: o La fitohemaglutinina o a concanavalina A ¡TEN EN CUENTA! → Los mitógenos son factores que actúan sobre el ciclo celular, estimulando la división celular. Son mitógenos habituales la fitohemaglutinina/PHA (PHA es una lectina de origen vegetal extraída de especies de Phaseolus) y la concanavalina A/ Con A (es una lectina de origen vegetal extraída de Canavalia ensiformis). Destaca la técnica de valoración de la proliferación mediante un contador de emisiones beta cuyo fundamento es el siguiente: Cuando realizamos un cultivo de linfocitos T con un número constante de elementos celulares y en presencia del mitógeno (fitohemaglutinina), dichos linfocitos empezarán a llevar a cabo la mitosis. Si en ese medio añadimos timidina radiactiva, ésta se incorporará al ADN que se sintetiza de nuevo siempre de una manera proporcional a la actividad mitótica de los linfocitos T. Después podremos medir la radiactividad incorporada en esas nuevas células si recogemos dichas células mediante una membrana empleando un instrumento llamado “cosechador de células”. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico El proceso es el siguiente: 1. Los linfocitos en estudio se cultivan solos (control) y en otro cultivo en presencia del mitógeno durante 48-72 horas. 2. En este punto se agrega la timidina radioactiva, y 6 horas más tarde se cosechan las células en filtros porosos, los cuales son llevados a un contador de emisiones beta para obtener las lecturas correspondientes. 3. A continuación, procederemos a la lectura de la radioactividad que emite la timidina en las células que se cosechan al final de cultivo mediante un contador de emisiones beta. 4. Habremos realizado un cultivo control de células sin mitógeno pero con timidina marcada, de manera que la relación entre la cantidad de timidina incorporada en el control y la timidina medida en el cultivo con el mitógeno nos dará el Índice de estimulación del reactivo. 5. Ahora podremos calcular el índice de estimulación de cada muestra. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Ejemplo de la comparativa entre la proliferación de dos poblaciones de linfocitos T, una sometida a un mitógeno. Arriba tenemos un ejemplo de la cinética de la incorporación de timidina tritiada en pruebas de respuesta mitogénica a la fitohemaglutinina (PHA). Como podemos apreciar, la incorporación máxima se obtuvo con 72 horas de cultivo. Hay que tener en cuenta que la respuesta a mitógenos policlonales o a los aloantígenos, hace que el pico de proliferación sea más rápido, como consecuencia de que se van a estimular un gran número de células de la muestra, sin importar su especificidad. Sin embrago, en la evaluación de la respuesta mitogénica a un antígeno específico como puede ser el toxoide tetánico, la proliferación es más lenta, con un máximo en 5-7 días, ya que solo se estimula una baja proporción de los linfocitos presentes en la muestra. Para la evaluación de la inmunidad celular a través de la citometría de flujo, se han desarrollado una serie de colorantes que se integran de una forma muy estable en los linfocitos. Con cada división mitótica se disminuirá a la mitad la cantidad de colorante de cada linfocito. Entonces se procede a medir la fluorescencia emitida por cada célula y así se puede calcular el número de divisiones celulares. 1.5 ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS LINFOCITOS B. Los Linfocitos B intervienen en la respuesta inmuno adaptativa y humoral, esencialmente como células presentadoras de antígeno y como productoras de anticuerpos y citocinas. La alteración en el número y en la funcionalidad de estos Linfocitos se puede ver reflejada en la alteración en la funcionalidad de los linfocitos T, repercutiendo en la aparición de numerosas enfermedades Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico relacionadas con el sistema inmunológico, por lo que es importante llevar a cabo estudios de la funcionalidad de los Linfocitos B. Los linfocitos pueden ser inducidos a dividirse en cultivo in vitro mediante una gran variedad de estímulos. Esta capacidad para realizar mitosis in vitro se ha utilizado como criterio para evaluar su funcionalidad. Estas determinaciones in vitro reflejan los mecanismos de activación celular y proliferación a lo largo de las respuestas inmunológicas que se producen in vivo en el organismo del paciente. La determinación de la producción de anticuerpos es un parámetro de evaluación de la funcionalidad de los linfocitos B y contribuye también significativamente al diagnóstico de diversas inmunodeficiencias. Además, en el seguimiento y control de pacientes que reciben tratamientos inmunosupresivos fuertes a causa de ser receptores de un trasplante, o en pacientes con neoplasias tratadas mediante quimioterapia y/o radioterapia, etc., la evaluación de linfocitos T y B puede proveer de una información muy útil para regular la dosificación del tratamiento. También es importante llevar a cabo la cuantificación de los linfocitos B en otras patologías concretas como puede ser el caso de leucemiaslinfocíticas agudas de tipo B. Habitualmente se cuantifican los niveles de las inmunoglobulinas IgG, IgM e IgA. Para su cuantificación sérica existen numerosos métodos estandarizados; el más habitual es la inmunodifusión radial, aunque también se emplea turbidimetría. En los casos de inmunodeficiencia con fallo selectivo en la producción de IgM se recomienda la determinación de la presencia de anticuerpos naturales o isohemaglutininas. Para la cuantificación de anticuerpos específicos la técnica de elección es el método de ELISA indirecto. También es interesante la medición de subclases de inmunoglobulinas frente a distintos tipos de antígenos. Por ejemplo, los niveles disminuidos de IgG2 frente a polisacáridos de la cápsula de neumococo o meningococo son indicativos de infecciones por bacterias encapsuladas. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Además, se puede determinar la presencia de inmunoglobulinas en los sobrenadantes procedentes de cultivos in vitro de linfocitos estimulados con antígenos o mitógenos. Para ello, se emplea la técnica ELISA utilizando un antígeno específico de los anticuerpos que se quiere detectar. Entre otras opciones, para el estudio de las poblaciones de los Linfocitos B podremos llevar a cabo las mismas técnicas que hemos observado para los Linfocitos T, de manera que se puede proceder a: Aislamiento y purificación de los Linfocitos B. Cultivos de los linfocitos B. Estudios de recuento y valoración de la proliferación celular mediante citometría de flujo: para ello, los linfocitos B van a serevaluados normalmente mediante el uso de antiCD19. Contador de partículas beta. 1.6 ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS LINFOCITOS B. Cuando los linfocitos T sensibilizados frente a un antígenos se cultivan en presencia de ese antígeno o de un agente mitógeno, responden transformándose en linfoblastos, que se dividen activamente. La proliferación de los linfoblastos implica una síntesis de ADN, lo cual se puede medir mediante la tasa de incorporación de timidina tritiada a las células. Este fundamento se aplica para estudiar la funcionalidad de los linfocitos T mediante estudios de proliferación en respuesta a mitógenos. Procedimiento: 1. Separar los linfocitos mediante centrifugación con medio Ficoll-diatrizoato y recogerlos. 2. Lavar varias veces los leucocitos separados con medio de cultivo celular. 3. Efectuar un recuento y ajustar a una concentración del orden de 5x106 cel/min mediante adición de más o menos cantidad de medio (dilución). 4. Dispensar en placas de microtitulación de 96 pocillos. 5. Incorporar a los pocillos solución de antígeno problema a la concentración adecuada. Dejar algunos pocillos sin antígeno (controles). Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico 6. Incubar durante 72h a 37ºC y en atmósfera de CO2. 7. Añadir timidina trtiada a los pocillos e incubar de nuevo la placa durante 16h mínimo. 8. Recoger las células sobre los filtros de fibra de vidrio y depositarlas en viales que contengan líquido de centelleo. La radioactividad presente en el líquido se podrá medir con un contador de centelleo. 9. Establecer la tasa de proliferación viendo la relación entre la radioactividad expresadas por las células estimuladas in vitro con el antígeno problema y las células control no estimuladas. Por tanto, existen diferentes métodos para poder llevar a cabo el estudio de la funcionalidad de los linfocitos T, clave para comprobar el estado de la respuesta inmunológica celular. Así, tenemos: La evaluación de la respuesta proliferativa por estimulación (proceso anterior). Evaluación de la citotoxicidad. Evaluación de la producción de citocinas. Evaluación de citotoxicidad: Con los análisis de evaluación de la citotoxicidad linfocitaria podremos medir la capacidad de los linfocitos para poder destruir a las células diana en aquellas reacciones en las que no está presente el complemento. Podremos llevar a cabo el estudio de tres procesos de linfocitotoxicidad: Estudio de la linfólisis dependiente de anticuerpos (AML). → Para poder desarrollar esta técnica, lo primero es incubar a las células NK con las células diana con antígenos en su superficie y, además, añadir en la incubación un anticuerpo IgG que va a ir dirigido frente al antígeno de la célula diana. Con esto conseguimos que las inmunoglobulinas G Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico queden unidas a las células diana, ya que tienen la afinidad frente al antígeno que presenta en su superficie. Las células asesinas van a ser receptoras con una afinidad muy elevada para la porción Fc de la inmunoglobulina G. Entonces van a reconocer a la IgG y van a reaccionar con el anticuerpo que recubre a la célula diana, produciéndose la destrucción de esta. Estudio de la linfólisis mediada por células (CML) →se incuban los linfocitos T citotóxicos con unas células diana marcadas con cromo radiactivo. Se emplea para la determinación de los linficitos T CD8+. Se basa en la capacidad de los linfocitos T de lisar las células diana que expresen el antígeno. Los linfocitos T citotóxicos podrán interactuar con las células diana y éstas se romperán produciendo la liberación del cromo radiactivo (51Cr), que podrá medirse y darnos una idea de la funcionalidad que han desarrollado estos linfocitos T citotóxicos. Algo parecido podremos hacer con el marcaje de las células proliferantes, como es el caso del marcaje de las células tumorales con timidina radiactiva. Dicha timidina marcada se incorporará al ADN en la replicación. Las células T citotóxicas atacarán a las células tumorales marcadas y entonces se fragmentará el ADN de dichas células y se liberará al sobrenadante. En este punto, nosotros podremos medir la liberación de ADN marcado y la cantidad de timidina radiactiva que queda retenida en el ADN cromosómico. Con esta prueba obtenemos una medida muy rápida y sensible de la actividad de los Linfocitos T citotóxicos. Estudio de la citotoxicidad mediada por productos linfocitarios. Evaluación de la producción de citoquinas: Recordamos que las citocinas son producidas por los linfocitos y macrófagos activados. Van a ser unas proteínas que se ocupan de regular la función de algunas células puesto que se encargan de la comunicación intercelular, van a poder inducir la activación de receptores específicos de membrana, regulan el crecimiento y la modulación de las inmunoglobulinas, etc. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Estas citocinas, pueden ser medidas por la citometría de flujo y así se puede aprovechar para evaluar la respuesta inmunológica celular. Para ello, vamos a estimular las células durante unas 4 o 6 horas, añadiendo al medio una serie de reactivos que van a bloquear el transporte de membranas. Por ejemplo, podremos añadir BrefeldinaA o Monensina y así conseguiremos bloquear la secreción de las citocinas. Este procedimiento se realiza mediante de la técnica de ELISA tipo Sándwich con dos anticuerpos. Un primer anticuerpo monoclonal producido frente a la citoquina que se va a determinar y un segundo anticuerpo monoclonal anti-citoquina, marcado con biotina. 1.7 CUANTIFICACIÓN DE SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS T POR CITOMETRÍA DE FLUJO. Dentro del ámbito de la inmunología y la hematología, la citometría nos ha permitido llevar a cabo un análisis y una caracterización detallada de los componentes sanguíneos; pudiéndola aplicar en la caracterización de los leucocitos en estados de inmunodeficiencia y en algunas enfermedades onco-hematológicas. En el caso de los linfocitos T, la cuantificación de sus poblaciones puede ser vital a la hora de llevar a cabo el seguimiento y/o el tratamiento de numerosas patologías. Así es el caso de: La evaluación del estado inmunológico de los pacientes infectados por el virus de inmunodeficiencia humana (HIV), que nos va a incluir el control periódico de sus cifras de linfocitos T, en especial la subpoblación CD4+ (T cooperadores), cuyas disminuciones muestran correlación con la aparición de los signos y síntomas característicos del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Enfermos trasplantados o con determinadas neoplasias que se someten a radioterapia y/o quimioterapia, en la que se va a reducir considerablemente la población del sistema inmunológico. 2. COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC): Todas nuestras células tienen en la superficie de su membrana proteínas encargadas de unirse a diferentes sustancias que posteriormente van a ser presentadas a los Linfocitos T como antígenos, para que estos las analicen y actúen en consecuencia. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Se las conoce con el nombre de antígenos de histocompatibilidad, HLA (human leukocyte antigens: antígenos leucocitarios humanos). Los HLA tienen un papel primordial en la activación y control de los fenómenos inmunitarios del ser humano (tanto en los humorales como en los celulares). Su determinación y estudio (tipaje de los HLA) es fundamental en el trasplante de órganos y tejidos (de ellos depende la aceptación o rechazo de órganos, de células madre hematopoyéticas, de transfusiones de plaquetas o de hematíes, etc), en el conocimiento e identificación de poblaciones celulares y en la detección, estudio y emisión de pronóstico de enfermedades infecciosas y autoinmunes. 2.1 FUNCIÓN DE LOS HLA: Los antígenos HLA de Clase I, se encuentran en las membranas de todas las células nucleadas del organismo. Mientras que los antígenos HLA de Clase II, se encuentran en la membrana de algunas células que van a formar parte del sistema inmunológico, sobre todo en las células presentadoras de antígenos, linfocitos B y en algunos linfocitos T activados. Así, podremos destacar que los Linfocitos T CD8+, Linfocitos citotóxicos/supresores, sólo van a reconocer a antígenos en el contexto de las moléculas de clase I del MHC. En cambio, los Linfocitos TCD4+, linfocitos cooperadores, sólo reconocerán a los antígenos en el contexto de las moléculas de clase II del MHC. Es por ello, que podríamos resumir que la principal función del MHC es la de llevar a cabo el control de la respuesta inmunológica. Hay que destacar que los Linfocitos B van a poder reconocer a los antígenos sin necesidad de usar o valerse del MHC y, además, las células NK tampoco dependerán del MHC. 2.2 FUNCIÓN DE LOS HLA CLASE I: En primer lugar, entrarán a formar parte de la respuesta inmunológica adaptativa. La presentación del antígeno por las moléculas de clase I va a permitir que los linfocitos T puedan detectar y crear una respuesta citotóxica frente al material extraño, como pudiera ser el caso de los virus o aquellas proteínas que son anormales por provenir de células malignas. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Esto ocurre porque en el citosol de las células, los antígenos intracelulares, van a ser degradadas en diferentes fragmentos peptídicos y dichos fragmentos van a ser transportados al retículo endoplásmico. Una vez allí, estos fragmentos se unen en la parte superior de las moléculas de clase I que acaban de ser sintetizadas, transportándose a la superficie de la célula. Una vez que se encuentran estos fragmentos en la superficie celular, los Linfocitos T CD8+ van a reconocer al péptido procesado junto a la molécula de clase I y dependiendo del proceso de reconocimiento dichos linfocitos T CD8+ comenzarán el proceso de lisis de dicha célula infectada. Otra de las funciones de las moléculas del complejo I es llevar a cabo la función protectora en la respuesta inmunológica innata. En este caso, las moléculas del complejo I van a hacer una función de prevención y contención de la lisis de las células diana que podrían llevar a cabo las células asesinas naturales (Células NK). Estas células NK no requieren la activación previa mediante el reconocimiento de los péptidos a las moléculas de clase I. Estas células NK pueden lisar a aquellas células diana que han perdido la capacidad de expresar las moléculas HLA clase I en su superficie celular, por lo que juegan un papel importante para poder eliminar a las células que han sido infectadas por virus o aquellas células que han sufrido una transformación neoplásica y que consiguen disminuir la expresión de las moléculas de Clase I para evitar ser reconocidas y posteriormente destruidas por los Linfocitos T citotóxicos. 2.3 FUNCIÓN DE LOS HLA CLASE I: Podemos resumir la función de las moléculas de Clase II definiéndolos como receptores antigénicos en la respuesta inmune. Se van a unir a fragmentos peptídicos antigénicos procesados que pertenecen a antígenos exógenos como pueden ser bacterias o virus. Estos antígenos exógenos van a entrar en la célula por medio de endocitosis. Una vez dentro, van a ser degradados en fragmentos peptídicos en los endosomas de la célula. Se van a unir a las moléculas de clase II nuevas. Cuando ya está unido el fragmento peptídico antigénico con la molécula de Clase II, va a ser transportado a la superficie de la célula para poderse llevar a cabo la presentación y posterior reconocimiento por parte de las células T circulantes. Los receptores de los linfocitos T CD4+ van a interaccionar con el complejo formado por las moléculas de clase II y el fragmento antigénico, produciéndose así, la activación de la respuesta. La célula T efectora será específica para el péptido antigénico que activó el proceso de presentar inicialmente al antígeno. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Las células T que han sido activadas por este reconocimiento del complejo fragmento antigénico-molécula de Clase II van a poder desarrollar varias acciones: La Célula T CD4+ podrá ayudar a los Linfocitos B a diferenciarse en las células plasmáticas productoras de anticuerpos. La Célula T CD4+ puede ayudar a otros Linfocitos T a diferenciarse en células citotóxicas o células supresoras. La Célula T puede comportarse como célula citotóxica y acabar directamente con la célula diana o como célula supresora debilitándola respuesta inmune. La célula T podrá producir moléculas de gran importancia como es el caso del Interferón IFN-yj que se encarga de aumentar la respuesta inmunológica y puede aumentar la expresión de las moléculas MHC en las células diana. (Los interferones son proteínas producidas por el sistema inmunológico que puede impedir la replicación del patógeno que ataca a la célula diana). La célula T activada producirá factores de crecimiento, tales como la Interleucina-2 que favorecerán la transformación de las células hematopoyéticas para incrementar el proceso de maduración de otros Linfocitos. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico 2.4 ESTUDIOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD: ▪ Actividad citotóxica de los linfocitos T (CD8+) Este método se basa en la actividad citotóxica de los Linfocitos T CD8+ frente a una determinada célula blanco. Dichos Linfocitos T CD8+ acabarán con la célula blanco y podremos medir esa actividad si incorporamos alguna sustancia a dicha célula blanco, las incubamos junto a los Linfocitos T CD8+ y se mide la cantidad de la sustancia añadida a las célula blanco. Esta sustancia puede ser el cromo 51 que se incorpora a la célula blanco y luego medimos la cantidad de cromo 51 liberado mediante un contador de partículas gamma. A mayor cantidad de Cromo 51, mayor actividad citotóxica. Técnicas de Inmunodiagnóstico ▪ G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Métodos serológicos de tipificación de los antígenos leucocitarios Los métodos serológicos de tipificación se venían usando desde hace décadas, principalmente para fines de selección de donantes en diversos tipos de trasplante. También han tenido utilidad histórica en medicina legal, como pueden ser las pruebas de establecimiento de paternidad, casos forenses, etc. No obstante, el HLA-DP normalmente no se definirá mediante serología, aunque se siguen usando los ensayos serológicos de microcitotoxicidad para las especialidades de Clase I, es decir, para el HLA-A y el HLA-B. De hecho, los antígenos de clase I se denominan serológicamente definidos ya que se determinarán mediante pruebas que usan anticuerpos. En cambio, los antígenos de Clase II, se llaman definidos por linfocitos, ya que se van a determinar principalmente mediante técnicas de cultivo de dichas células, a excepción de los antígenos DR y DQ que sí pueden ser tipificados mediante serología. Así, para el HLA-C y para los de clase II (HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP), estos métodos están siendo sustituidos por el análisis basado en el ADN. Los análisis basados en el ADN tienen una mayor resolución y son empleados para determinar el tipo de HLA de individuos no emparentados y para miembros de una familia, sobre todo en aquellos casos en los que la serología no nos ofrece garantías suficientes porque los padres no estén disponibles, por ejemplo. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Hay que recordar que el complejo HLA es altamente polimórfico en la población y es fundamental para determinar el rechazo o la aceptación de un trasplante o de un injerto. Si vamos a desarrollar el método serológico de tipificación, los linfocitos que nos van a permitir realizar estos ensayos de tipificación serológica de HLA, se deben obtener de muestras de sangre total periférica sedimentándola con un gradiente de Ficoll-Hypaque para separar los eritrocitos por densidad de centrifugación. Aquellos linfocitos separados de la sangre periférica del paciente podrán ser usados para la tipificación del HLA-A, HLA- B y HLA-C. Si queremos desarrollar la tipificación serológica del HLA-DR y del HLA-DQ, necesitaremos enriquecer los linfocitos B o usar una técnica de fluorescencia de dos colores que nos permita diferenciar al mismo tiempo las células B y las células T que no están separadas. ▪ Método de microlinfocitotoxicidad. Se trata de la técnica más sencilla para llevar a cabo la determinación de los antígenos HLAA, HLA-B y HLA-C (Clase I). También se ha conocido como la técnica de Terasaki. Para desarrollarla se van a emplear una serie de placas de plástico que van a poseer una serie de pequeños hoyos en los que se van a llevar a cabo las reacciones claves. Las técnicas de tipificación serológica tuvieron un gran avance gracias al desarrollo de los anticuerpos monoclonales contra los antígenos de histocompatibilidad, pero ya hemos señalado Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico que estas técnicas están siendo desplazadas por las técnicas de genética molecular que tipifican las moléculas de HLA con base al ADN. ▪ Método de detección de anticuerpos citotóxicos En el suero no suelen detectarse anticuerpos dirigidos contra moléculas ajenas del sistema HLA, pero algunas personas van a producir este tipo de anticuerpos en el caso de que se pongan en contacto con células de otros individuos, lo que ocurre cuando se procede a trasplantes de órganos, transfusión de sangre y paso de células fetales a la embarazada. Entonces, en este caso, la destrucción celular nos va a indicar la presencia de anticuerpo dirigido contra el HLA correspondiente en el suero analizado. 2.5 APLICACIONES DE LOS ESTUDIOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD: A continuación, estudiaremos las siguientes aplicaciones de los estudios de histocompatibilidad: Técnicas de tipificación y su relación con los trasplantes Aplicación de las técnicas de tipificación de HLA en las pruebas de paternidad Aplicaciones de los estudios de histocompatibilidad en los estudios de poblaciones ▪ o Variaciones étnicas o Poblaciones y enfermedades Técnicas de tipificación y su relación con los trasplantes: Ya hemos detallado en los apartados anteriores, la gran importancia que tienen los HLA en el éxito o fracaso de un trasplante. A día de hoy, la supervivencia a largo plazo tanto de órganos como de injertos de células progenitoras, constituye uno de los retos más importantes de la medicina. Actualmente, el trasplante renal es la elección de la mayor parte de pacientes que se encuentran en la fase terminal de la enfermedad renal. Además, el trasplante de corazón, de pulmón, de hígado o de células progenitoras hematopoyéticas, está creciendo tanto en receptores como en éxito. El principal problema que podemos encontrarnos en el trasplante tanto de órganos sólidos como de células hematopoyéticas reside en la posibilidad de un rechazo debido a causas y procesos inmunológicos, de manera que la probabilidad de éxito de un aloinjerto o de un alo-trasplante Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico estará directamente relacionada con la capacidad de detener la reacción inmune, lo cual podrá realizarse de diferentes maneras: Encontrar la concordancia de histocompatibilidad entre donante y receptor. Llevar a cabo una terapia inmunosupresora del receptor. Lograr que el receptor no responda a los aloantígenos del donante y desarrolle tolerancia. Como vemos, la histocompatibilidad juega un papel fundamental y el estudio del tipado se convierte en un recurso indispensable antes de realizar el trasplante. Esto se debe a que las moléculas codificadas por el MHC representan la mayor barrera genética del éxito del aloinjerto. Una vez que se descubrió esta circunstancia, los estudios de tipificación del HLA empezaron a usarse para optimizar la compatibilidad entre donante y receptor. Se ha estudiado la influencia de los antígenos de HLA en la supervivencia de los injertos. Para ello, se estudia y se busca la concordancia entre donante y receptor, mediante las técnicas de tipificación descritas en esta unidad, buscando la mayor concordancia posible. Para ello, incluye la evaluación de al menos tres locus, el HLA-A, el HLA-B y el HLA-DR. Los individuos concordantes, en cualquier resolución, para los tres locus se denominan 6/6 concordancias o discordancias. Cuando se asegura esta concordancia aumenta la probabilidad de supervivencia y de ahí la importancia de las técnicas de tipificación de HLA. El nivel de concordancia alélico para las moléculas de HLA clásicas puede optimizar el resultado de todos los injertos, tanto de órganos vasculares como de células progenituras hematopoyéticas. ▪ Aplicación de las técnicas de tipificación de HLA en las pruebas de paternidad: Antes de que se produjese la extensión y modernización de las pruebas de ADN, las pruebas de paternidad se solían hacer mediante dos técnicas: o Estudio de los antígenos eritrocitarios. o Determinación mediante métodos serológicos de HLA-A y HLA- B. En la actualidad, aún se siguen usando los marcadores DOA1 detectados por PCR como pruebas de paternidad. El sistema HLA estará localizado en el brazo corto del cromosoma 6 humano, conteniendo varios locus: HLA-A,-B,-C,-DR,-DP y DQ. Actualmente ya se tienen las secuencias completas del ADN de las regiones de HLA-A y HLA-B. Por ello, el sistema HLA es un factor muy importante en las pruebas de paternidad y de ahí la relación de las diferentes técnicas de tipificación del HLA y las pruebas para demostrar la paternidad. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Desde los organismos oficiales se recomienda que el tipado de HLA para las pruebas de paternidad requieran todos los antígenos HLA-A y HLA-B conocidos hasta la fecha y que, si el laboratorio en cuestión cuenta con los sueros necesarios, se haga el tipado de otras especialidades de HLA ya conocidas. Esta prueba de paternidad basada en el tipado de HLA presenta diferentes problemas: Los resultados y su interpretación pueden llegar a complicarse por un entrecruzamiento entre los locus A y B. Puede haber problemas a la hora de encontrar cuatro marcadores diferentes. Podrían aparecer lo que se denomina como “blancos”, que serán alelos no definidos por los reactivos de los que se dispone y esta circunstancia dependerá de la raza de la persona analizada y de si la persona es homocigótica para el marcador B o A. Pueden que se dé una reacción cruzada de los antisueros con los marcadores o que los antígenos no se expresen completamente. Todo esto hace que cada vez se use más las pruebas de ADN. ▪ Aplicaciones de los estudios de histocompatibilidad en los estudios de poblaciones: Los estudios de histocompatibilidad también pueden aplicarse a los estudios de poblaciones ya sea para explicar la variabilidad genética entre diferentes etnias o para poder establecer una serie de relaciones entre la incidencia de una determinada patología en las diferentes poblaciones. ▪ Variaciones étnicas: Si se analizan los datos que se han ido acumulando acerca del estudio de la población mundial, queda demostrado que las frecuencias de los alelos del HLA son muy diferentes entre los distintos grupos étnicos. Existe una gran variabilidad entre los haplotipos del MHC y el desequilibrio de los alelos entre las diferentes etnias y grupo de poblaciones. De hecho, tanto la frecuencia de los alelos como de los haplotipos puede influir en el número medio de donantes voluntarios que hacen falta para cualquier paciente, en función de su pertenencia étnica. ▪ Poblaciones y enfermedades: Ya hemos expuesto en apartados anteriores, la importancia de la genética de los HLA y su relación demostrada con el desarrollo de determinadas patologías. Técnicas de Inmunodiagnóstico G.S Técnico de Laboratorio Clínico y Biomédico Existen una gran cantidad de patologías en las que se ha determinado su riesgo de incidencia en función de las diferentes poblaciones y de su polimorfismo. Por polimorfismo genético entendemos el fenómeno que se da cuando en la existencia en la misma población existen dos o más alelos en un gen, cada uno con una frecuencia importante. Esto es debido a que las poblaciones presentan una gran variabilidad en frecuencias de los alelos del HLA y puede relacionarse un determinado patrón genético poblacional con la mayor o menor incidencia de una determinada enfermedad que está directamente relacionada con los haplotipos de MHC de dicha población. Podemos ver algunos ejemplos; así el MHC se ha asociado con una variedad de enfermedades infecciosas como es el caso de la malaria.