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UNIDAD 3. EXPRESIÓN GÉNICA: TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN (CONTINUACIÓN DEL PARCIAL 1, APARTADO 3.1) PROMOTOR → Secuencia del propio DNA que indica a partir de donde se debe empezar a transcribir un gen, es decir, su posición. Las SECUENCIAS CONSENSO son secuencias muy conservadas en las cuales el pro...

UNIDAD 3. EXPRESIÓN GÉNICA: TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN (CONTINUACIÓN DEL PARCIAL 1, APARTADO 3.1) PROMOTOR → Secuencia del propio DNA que indica a partir de donde se debe empezar a transcribir un gen, es decir, su posición. Las SECUENCIAS CONSENSO son secuencias muy conservadas en las cuales el promotor siempre suele ser igual: si está subrayado pueden variar → Región -10 = TATAAT → Región -35 = TTGACT ARN POLIMERASA O TRANSCRIPTASA (CARACTERÍSTICAS) ○ ATP, GTP, UTP, CTP ○ Requiere Mg2.+ ○ No necesita cebador ○ El molde es DNA (NO 2. TRANSCRIPCIÓN EN CÉLULAS RNA) ○ Síntesis 5’ → 3’ PROCARIOTAS 2.1 INICIACIÓN → 3 pasos ○ v = 40 nucleótidos / s ○ Puede actuar como helicasa ○ Error = 10-4/10-5; mayor que en la replicación pero minimizado por el nª de copias Es una holoenzima y el factor σ ayuda al reconocimiento. 1. Unión del promotor → ɑ y σ reclutan la enzima central hacia el promotor. Complejo cerrado 2. Desnaturalización del promotor → Complejo abierto El factor σ70tiene la región σ2 en la región -10. Esta presenta dos recesos que fijan cada uno una base de la cadena no plantilla. Es energéticamente favorable romper pdh y unir la base por lo que no hay que hidrolizar ATP. La RNA pol permanece estacionaria y atrae hacia ella DNA aguas abajo hasta que se produce el ESCAPE DEL PROMOTOR, en la que σ se separa. En el sitio de inicio se inserta el primer rNTP complementario a la cadena de DNA. 3. Se forma el complejo de transcripción lineal → RNA pol + DNA molde + primer rNTP 2..2 ELONGACIÓN → el enzima recorre el gen completo añadiendo rNTP hasta la señal de terminación 2.3 TERMINACIÓN → las secuencias de terminación suelen tener 40 pb y son importantes en procariotas, ya que el siguiente gen en dirección 5’ puede estar muy cerca. La secuencia de terminación SÍ se transcribe a RNA, y hay dos tipos de terminación: 1. Terminación intrínseca → secuencia autocomplementaria rica en G-C. Se transcribe y sus 1 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2 bases se aparean formando una horquilla (estructura tallo-asa). Sigue una secuencia rica en A que induce la terminación de la transcripción, la liberación del transcrito y se cierra la doble hélice. 2. Terminación dependiente de RHO → RHO es una proteína hexamérica grande que interactúa físicamente con el transcrito y facilita la terminación. 2.4 REVISIÓN DE LA RNA POL La pol de elongación sintetiza, revisa y corrige errores en el transcrito: 1. Edición pirofosfolítica → la enzima cataliza la eliminación de un ribonucleótido incorrecto reincorporando Ppi. 2. Edición hidrolítica → RNA pol retrocede 1 o más nucleótidos y escinde el error. 3. TRANSCRIPCIÓN EN CÉLULAS EUCARIOTAS ○ Ocurre dentro del núcleo ○ Regulación compleja con intensificadores y silenciadores ○ Pre-RNA → hnRNA (nuclear heterogéneo) → mRNA (splicing) ○ Hay 3 tipos de RNA pol → tipo I (rRNA, nucleolo), tipo II (mrNA y snRNA, nucleoplasma), tipo 3 (tRNA, RNA 5S, nucleoplasma) La RNA pol II forma un complejo preiniciación (PIC) con GTF y el promotor. Destaca en este complejo el TFIID (factor de transcripción para la RNA polimerasa IID), el cual está compuesto por: 10 TAFs (TBP associated factors)y por TBP (TATA binding protein) que distorsiona el DNA. El ESCAPE DEL PROMOTOR requiere la fosforilación de la “cola” de la polimerasa y de la hidrólisis de ATP. El inicio de la transcripción in vivo requiere más proteínas (activadoras y represoras) y que se forma el complejo mediador → formada por muchas subunidades, algunas conservadas desde las levaduras hasta los humanos. Se forman bucles para poner en contacto proteínas con el PIC. Además, hay factores que estimulan el alargamiento y la revisión del RNA por la RNA pol. La RNA pol alargadora debe encargarse de las histonas, para lo cual se utilizan FACT, facilita la transcripción cromatídica). 3.1 MODIFICACIONES POST-TRANSCRIPCIONALES Son clave para el transporte del RNA del núcleo al citoplasma. Consisten en añadir la caperuza (7-metil guanosina) al extremo 5’ que protege de nucleasas e indica el inicio de la traducción, y en el extremo 3’ se añade la cola de poli-A. 2 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2 Los genes eucariotas están formados por exones (regiones con info) e intrones (regiones sin info). Los intrones se eliminan por splicing → corte endonucleotídico de los extremos del intrón, su eliminación y ligamiento de los exones por RNA ligasas, Los genes eucariotas empiezan y terminan por exones y hay 3 tipos de intrones: ○ Grupo I → reacción autocatalítica. El intrón es la fuente de actividad enzimática para su propia eliminación. Hay 2 reacciones de transesterificación. Ocurre en ribozimas ○ Grupo II → reacción autocatalítica. Ocurre en mRNA / tRNA de mitocondrias y cloroplastos. ○ Grupo III → se forma el espliceosoma: conjunto de pequeños nRNA - snRNA y proteínas con función catalítica. Ocurre en pre-mRNA de eucariotas. 3.2 REGULACIÓN EN EUCARIOTAS Elementos en cis (unidos al DNA) Caja TATA (-30/-24) → AUG codifica para metionina. Codón de inicio Elementos en trans (similar σ en procariotas) Caja CAAT (-70/-80) Elemento BRE (-23/-27) Elementos INR (+2 / +4) Factores de transcripción genéricos (GTF) → se unen a TATA Activadores transcripcionales Silenciadores transcripcionales 4. EL CÓDIGO GENÉTICO ○ Lineal, basado en mRNa ○ Codones → subud. tripletes ○ 1 codón → 1 aa (no ambiguo) ○ 1 aa → varios codones (degenerado) ○ Señales de inicio y fin ○ Se lee de forma continua ○ No hay codones solapantes ○ Universal (raras excepciones) Hay 61 codones asignados a aa: → UAA, UAG, UGA son codones de terminación → Solo el triptófano tiene 1 codón (UGG). El resto de aa tiene entre 2 y 6 codones Se observa un patrón de degeneración, en el cual diferentes codones que especifican el mismo aa solo difieren en la tercera letra. De esto deriva la hipótesis del tambaleo: los 2 primeros ribonucleótidos son más importantes que el tercero para atraer el tRNA, mientras que el tercero puede establecer un par de Watson y Crick o por un pequeño desplazamiento, un par distinto. La naturaleza ordenada del código indica que aa químicamente similares comparten 1 o 2 bases intermedias en los diferentes tripletes que lo codifican, lo que amortiguan el efecto potencial de mutaciones sobre la función de la proteína. 3 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2 El código genético no es solapante → ribonucleótidos que corresponden a un polipéptido forman parte de 1 solo codón. Los genes pueden estar solapados → mRNA puede tener varios puntos de iniciación. ORF (open reading frame) → región codificadora de proteínas de cada mRNA compuesta por una hilera de codones no superpuestos contiguos. 4.1 HISTORIA DEL CÓDIGO GENÉTICO Brenner y Crick, en los 60, supusieron que la información debía estar codificada en tripletes de los cuatro nucleótidos. La primera evidencia sólida de esto fue el trabajo experimental de Crick, Barnett, Brenner y Watts-Tobin, para lo cual usar un mutágeno (acridina proflavina) y observaron las diferencias en la traducción cuando había inserciones y/o deleciones. Nirenberg y Matthaei descubrieron los los homopolímeros y heteropolímeros de RNA gracias a la síntesis proteica in vitro, gracias a la polinucleótido fosforilasa (produjeron mRNA) En 1964, Nirenberg y Leder realizan la técnica de unión al triplete (in vitro) → Una secuencia de 3 ribonucleótidos se une a un ribosoma y el codón atrae a un tRNA gracias al anticodón. Los tRNA unidos a distintos aa, se incuban en un filtro de nitrocelulosa y se observa que se retienen los ribosomas pero no el tRNA. Se analiza un tRNA con aa unido a un mRNA-ribosoma y se asigna un aa al codón. Como el código genético es degenerado más de codón especifica para el mismo aa. Khorana descubre los copolímeros con repeticiones, que son moléculas largas de RNA formadas por secuencias cortas de 2, 3 o 4 ribonucleótidos que se repiten muchas veces. 5. LA TRADUCCIÓN Es la síntesis de proteínas que utiliza la secuencia de mRNA como fuente de info. Es una serie lineal de aa cuya secuencia ha sido dictada por el código genético. 5.1 ELEMENTOS QUE PARTICIPAN EN LA TRADUCCIÓN 1. RNA DE TRANSFERENCIA (tRNA) Es un RNA pequeño con bases modificadas post-transcripcionalmente que potencian la eficacia de los pdh durante la traducción. Tiene forma de trébol (2D) o de L (3D), en 5’ tiene una G y en 3’ tiene CCA. Para cargar el aa en el tRNA se emplea la AMINOACIL ARNt TRANSFERASA. Hay 4 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2 normalmente 20 (1 por aa) y el proceso ocurre en 2 pasos: → Transferir AMP a aa generando enlace éster de alta E → Transferir aa adenilado a un tRNA. El extremo -OH del tRNA rompe el enlace éster. Isoaceptor → tRNA diferente que carga el mismo aa Formar el aminoacil-ARNt depende de la forma, el tamaño, y los grupos químicos: si son parecidos la aminoacil-tRNA tiene un receso de edición. Esta enzima presenta una gran especificidad, ya que la RNA sintetasa reconoce el anticodón y el tallo aceptor, el cual tiene una base discriminatoria específica a cada aminoácido 2. RIBOSOMAS (y factores asociados) 1. FASE DE INICIACIÓN → AUG codifica N-formilmetionina 3. mRNA 5.2 PASOS DE LA TRADUCCIÓN EN PROCARIOTAS 1.1. mRNA se une a la sub. pequeña junto con los factores de iniciación IF 1, 2 y 3. En el proceso participa la secuencia Shine-Dalgarno: secuencia consenso (AGGAGG) complementaria a una secuencia 3’ del RNA 16S (secuencia anti-Shine-Dalgarno). IF1 se coloca en el sitio A IF3 se coloca en el sitio E → impide unión de sub. grande 1.2. tRNAfmet se une al codón correspondiente del sitio P liberando IF3. IF2 es unido al tRNA gracias a GTP 1.3. Se coloca la subunidad grande liberando IF1 e IF2 gracias a GTP 1.4. Se forma el COMPLEJO DE INICIACIÓN → ribosoma 70S + mRNA + tRNAfmet tRNA) 2. FASE DE ELONGACIÓN → basada en la reacción peptidil-transferasa 2.1. EF-Tu inserta tRNA en el sitio A (vamos a llamar 2 a este 2.2. tRNA 2 gira sobre sí mismo para permitir el enlace (catalizado por rRNA 23S) 2.3. tRNA 1 sin aa pasa al sitio E y después sale del ribosoma (?) 2.4. mRNA se transloca 3 bases a la izquierda gracias a EF-G (dependiente de GTP) 2.5. tRNA 2, que tiene el péptido, pasa al sitio P 2.6. Se repite con todos los codones hasta el codón de terminación 5 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2 El mRNA libre se puede asociar a otro ribosoma para formar un POLISOMA 3. FASE DE TERMINACIÓN 3.1. Aparece en el sitio A un codón de terminación/de stop/ sin sentido → UGA, UAA, UAG 3.2. Entra RF1 o RF2 en el sitio A, lo cual desencadena la separación del péptido gracias a RF3 (unido a GDP) 3.3. Sale RF 1/2 y el GDP de RF3 se transforma en GTP 3.4. Sale RF 3 con GDP + Pi y se une al sitio A el RRF, es el factor de reciclaje ribosómico que imita a un tRNA 3.5. Se mete EF-G al sitio A provocando la salida de los tRNA de los sitios E y P 3.6. Sale EF-G gracias a IF 3, el cual se une al sitio E 3.7. Se desensambla el ribosoma, sale el mRNA y el polipéptido se pliega para forma la proteína. 5.3 DIFERENCIAS EN EUCARIOTAS ○ La transcripción y la traducción tienen lugar en compartimentos diferentes. ○ Múltiples oportunidades para la regulación de la expresión génica. ○ Ribosomas más grandes y complejos con mayor nº de factores. 2 poblaciones de ribosomas: citoplasmático o asociados al retículo endoplásmico rugoso (eER) ○ mRNA disponible más tiempo antes de su degradación y este es procesado (caperuza) ○ mRNA se encuentra poliadenilados (cola PoliA) ○ Tienen la secuencia de Kozak, en vez de la de Shine-Dalgarno → 5’- A/G_ _AUGG - 3’. Facilita la unión del mensajero a la subunidad pequeña ○ tRNAmet en vez de tRNAfmet como primer aa En eucariotas hay modificaciones post-traduccionales que son importantes en la función de la proteína. Estas pueden ser: 1. Eliminación/modificación del aa correspondiente al extremo N-terminal 2. Modificación de los residuos de los aa. Las más comunes son metilaciones y acetilaciones. 3. Recorte de las cadenas polipeptídicas 4. Eliminación de secuencias señalizadoras → dirigen a la proteína a donde debe actuar 5. Formación de complejos con metales 6 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2