Travaux Pratiques de Microbiologie – S3 2022-2023 PDF

Travaux Pratiques de Microbiologie – S3 Techniques microbiologiques de base Année universitaire: 2022 – 2023 1 Séance 1  Objectifs  Observation et mise en évidence de micro- organismes sur une série d’é...

Travaux Pratiques de Microbiologie – S3 Techniques microbiologiques de base Année universitaire: 2022 – 2023 1 Séance 1  Objectifs  Observation et mise en évidence de micro- organismes sur une série d’échantillons d’origine naturelle.  Initiation aux techniques d’étude et de culture des micro-organismes. 3 1- Observations de cultures microbiennes dans la nature Vidéo Vidéo poivron Vidéo Vidéo Observez et notez l’aspect des différents échantillons. La présence des micro- organismes sur votre échantillon peut-elle être perceptible aisément à l’œil nu. 4  Questions  Comment expliquez-vous la présence des microorganismes sur les différents milieux ?  Est-ce que ce sont toujours les mêmes germes qui colonisent les différents produits ? 5  Des bactéries sur milieu de culture Des champignons Levure Une cyanobactérie : Synechocystis sp. La levure boulangère 6 2- Poste de travail et Règles de sécurité Film "Poste de travail" 7 Lancer le film 8 Mise en évidence des sources de contaminations en Microbiologie 9  Questions Dans un laboratoire de Microbiologie, on manipule toujours dans une zone aseptique autour du bec bunsen (voir documents relatifs au « Poste de travail » et déposés sur la plateforme), Cependant, il y a des sources de contamination possibles à éviter même devant un poste de travail. Une contamination c’est la présence de germes étrangers à ceux qu’on est entrain d’étudier. D’où peuvent venir ces contaminations? = voir exemples A,B,C et D Comment peut-on les mettre en évidence? Et comment peut – on les éviter ? 10  3- Sources de contamination : Ensemencement Sources de N° Matériel Manipulations contamination Paillasse Ouvrir la boite de Pétri, toucher en déposant Peau de la main 1 et 7 Boite de Pétri divisée soigneusement un doigt à la surface de la gélose en deux secteurs a : doigt non lavé b : après lavage au savon Peau de la main 2 et 8 Boite de Pétri divisée a : doigt non lavé en deux secteurs b : après utilisation de la solution hydroalcolique Peau de la main 3 et 9 Boite de Pétri divisée a : doigt non lavé en deux secteurs b : après lavage à l’eau de Javel Cheveux 4 et 10 Boite de Petri n°4 Ouvrir la boite de gélose nutritive et le tube de bouillon nutritif, déposer des cheveux sur ces milieux de culture. Agiter les cheveux sur la gélose nutritive de façon à faire tomber des cheveux et des pellicules. Air 5 et 11 Boite de Petri n°5 Laisser la boite ouverte pendant 5 min loin du bec Bunsen, puis la refermer Air 6 et 12 Boite de Petri n°6 Idem 5, mais près du bec Bunsen 11  Exemple A: La main = source de contamination ? Comment le vérifier ? Manipulation 1:  On prend une boite de Pétri contenant la gélose nutritive et on la partage en deux quadrants par marquage du fond de la boite.  Dans le premier quadrant, on dépose l’empreinte d’un doigt non lavé. Dans le deuxième quadrant, on dépose l’empreinte d’un doigt lavé avec un antiseptique:  Le savon pour les étudiants étudiants 1 et 7.  Une solution hydro-alcoolique pour les étudiants 2 et 8  Une solution d’eau de Javel pour les étudiants 3 et 9.  La boite sera incubée pendant 24h à 37 °C, 12  Exemple B: Voies Rino-Pharyngées (VRP)= source de contamination ? Comment le vérifier ? Manipulation 2:  On prend une boite de Gélose Nutritive stérile;  On l’ouvre dans la zone d’asepsie;  On parle et on tousse dans le milieu gélosé (boite ouverte);  Enfin, on ferme cette boite et on l’incube à 37°C pendant 24H. 13  Exemple C: Cheveux = source de contamination ? Comment le vérifier? Manipulation 3:  On prend une boite de Gélose Nutritive stérile  On se gratte les cheveux sur le milieu de culture  On arrache un cheveu et on le dépose sur le milieu de culture (GN).  On incube la boite GN à 37°C pendant 24 h. 14  Exemple D: Air = Source de contamination ? Comment le vérifier ? Manipulation 4:  On prend deux boites de Gélose Nutritive stériles, L’une est marquées (air), l’autre (zone aseptique: ZA)  La boite (air) est laissée ouverte à l’air en dehors de la zone d’asepsie pendant (5 mn)  La boite (ZA) est laissée ouverte dans la zone d’asepsie, près du bec Bunsen pendant ( 5 mn).  Après, les deux boites sont incubées à 37°C pendant 24H. 15  4- Transferts bactériens 4A- Ensemencement d’un milieu liquide Protocole expérimental Mélange polymicrobien NB : Vous disposez pour la manipulation d’un mélange polymicrobien, de l’anse et un tube contenant le bouillon nutritif. 16  4- Transferts bactériens 4B- Ensemencement d’un milieu solide Protocole expérimental NB : Vous disposez pour la manipulation d’un mélange polymicrobien, de l’anse et une boite de gélose nutritive. 17 4B- Ensemencement d’un milieu solide NB : Vous disposez pour la manipulation du tube à hémolyse M 5- Techniques d’isolement bactérien A- Faire un isolement par la méthode des quadrants à partir du mélange M = (Ec + Sa). B- Réaliser un 2ème type d’isolement par l’utilisation de milieux sélectifs et différentiels. 19 5- Techniques d’isolement bactérien 5A- Isolement sur milieu solide (G.N.) par la méthode des quadrants Objectif séparer les cellules de microorganismes les uns des autres à partir d’un mélange polymicrobien :  Obtenir des culture pure  Vérifier la pureté d’une culture microbienne 20  Principe: Epuisement de la semence: les cellules microbiennes prélevées à l’aide d’une anse stérile à partir du mélange microbien, sont ensemencées par des stries serrées à la surface du milieu gélosé, et à la fin de la manipulation il reste quelques cellules au bout de l’anse de platine. Celles-ci seront isolées dans le dernier quadrant de la boite de gélose. Epuisement de la semence Colonies jointives Colonies isolées 21  Protocole expérimental 1 2 4 3 1 -2 1 -2 Quadrants striés Suspension bactérienne 22 1 2 3 4 2-3 Quadrants striés 1 -2 Quadrants striés 2-3 Quadrants striés 23  24h incubation-37°C Etuve = incubateur 3-4 4 Quadrants striés 24  Illustration: Film "Les microbes"  5- Techniques d’isolement bactérien 5B- Isolement bactérien en utilisant un milieu sélectif et différentiel Objectifs * Réaliser un isolement par l’utilisation d’un milieu sélectif et différentiel (bactéries ou groupes connus) Exemple : Milieu de Chapman * Apprendre à faire la lecture de milieux sélectifs et différentiels 26  Isolement sur milieu sélectif et différentiel "Milieu Chapman" Aspect du milieu Mode d’ensemen- Sélectivité / Caractères avant utilisation cement composition recherchés L'ensemencement Ce milieu contient un On peut étudier la doit être massif, en inhibiteur : forte fermentation du stries serrées : concentration en mannitol par chlorure de sodium virage au jaune de (NaCl : 75 g.l-1), l’indicateur coloré, le rouge ce qui permet un de phénol isolement sélectif de Staphylococcus tolérant les fortes concentrations en NaCl 27  Protocole expérimental : - Divisez chaque boite de Pétri en 3 secteurs. - Ensemencer chaque section par à l’aide d’une anse de platine par l’une des colonies (A, B et M : mélange) striation. Gélose nutritive Chapman (Témoin) A B A B M M A : Staphylococcus aureus, B : Escherichia coli, M : Mélange des 2 souches A et B. 28  Protocole expérimental : Gélose nutritive Chapman (Témoin) A C A C M M A : Staphylococcus aureus, C : Bacillus subtilis, M : Mélange des 2 souches A et C. 29  Composition des milieux de culture Milieu de Chapman (g/l) Gélose nutritive (g/l) - Peptone (source de C et N) 10 - Peptone 20 - Mannitol (Sucre: Source de C) 10 - Extrait de viande 2 - NaCl 75 - NaCl 5 - Rouge de phénol 0,025 - Agar-agar 15 - Extrait de viande 1 - Eau distillée qsp 1 litre - Agar-agar 15 - Eau distillée q.s.p. 1 litre Milieu Chapman : Agent sélectif : NaCl à 75 g/l Agents différentiels : Mannitol : Sucre Rouge de phénol : Indicateur de pH 30  Virage du rouge de Phénol en fonction du pH Dégradation du Mannitol : Mannitol +  production d’acides  Virage du rouge de phénol en jaune (Colonies jaunes) 31 Séance 2 RESULTATS OBTENUS 33  Sources de contamination : Lecture Après 24 heures d’incubation à 37°C La main = source de contamination ? Résultats: Avant incubation Après incubation à 37°C pendant 24h Amas de colonies Aucune colonies 34  La main = source de contamination ? Interprétation Le quadrant 1: (Doigt non lavé) Il y a présence d’un amas de colonies. Donc, le doigt (= main) non lavé(e) contient des microorganismes (Main = source de contamination). Conclusion: Il ne faut jamais toucher un matériel stérile (pipettes, anse, un milieu de culture …etc) par la main. Le quadrant 2: (Doigt lavé) à la solution hydro-alcoolique: absence de colonies. La solution antiseptique a éliminé les microorganismes. Conclusion: Il faut bien laver la main par un antiseptique (ex: Alcool, solution hydro-alcoolique , ……..) avant de manipuler en microbiologie. 35  Voies Rino-Pharyngées (VRP)= source de contamination ? Résultats: Avant incubation Après incubation à 37°C pendant 24H n Différents types de colonies 36  Voies Rino-Pharyngées (VRP)= source de contamination ? Interprétation  Après incubation , la boite contient Boite après incubation différents types de colonies;  Donc la voie rhino-pharyngée contient des microorganismes.  La VRP peut être considérée comme une source de contamination possible à éviter;  Conclusion: En microbiologie, il ne faut pas parler, ni tousser devant/sur les milieux de cultures au moment de la manipulation. Différents types de colonies 37 Cheveux = source de contamination ? Résultats: Avant incubation Après incubation à 37°C pendant 24H Différents types de colonies autour du cheveu 38  Cheveux = source de contamination ? Interprétation:  Après 24 h d’incubation, il y a développement d’un grand nombre de colonies, même autour du cheveu (=développement continu).  Donc, les cheveux contiennent des microorganismes et peuvent être considérés comme une source de contamination;  Conclusion: le manipulateur doit se relever les cheveux ou mettre un bonnet au moment de la manipulation. 39  Air = Source de contamination ? Résultats: Boite (zone aseptique ZA) Boite (air) après incubation à 37°C pendant 24h après incubation à 37°C pendant 24h Différents types de colonies Aucune colonies 40  Air = Source de contamination ? Interprétation:  La boite (air) contient des colonies multicolores  Donc, L’air contient des microorganismes (air= source de contamination).  Conclusion: il ne faut jamais ouvrir les milieux de culture dans l’air (en dehors de la zone d’asepsie), ni laisser les outils stériles à l’air sans les protéger contre cette source de contamination.  La boite (ZA) ne contient pas de colonies:  Donc, la zone d’asepsie est bien décontaminée par la flamme bleue du bec bunsen.  Conclusion: En Microbiologie, pour éviter TOUTE contamination, il faut toujours travailler dans la zone d’asepsie. 41  Transferts bactériens RESULTATS Obtention de colonies Obtention d’un trouble 42  Développement microbien en milieu liquide/gélosé Bouillon nutritif (Milieu liquide) Milieu gélosé en boite de Petri Trouble Types Types Colonies 43  Choix de l’utilisation d’un milieu liquide ou gélosé Milieu liquide Milieu gélosé - Obtention d’un trouble -Obtention de colonies: La colonie est une masse de cellules issue de la prolifération d’une ou plusieurs cellules initiales. - Croissance plus rapide - Étude des aspects macroscopiques - Permet une étude de la - Dénombrement croissance de souches pures par la mesure de la DO; densité optique Isolement 44 Technique d’isolement : Méthode des quadrants RESULTAT Colonies jointives Colonies isolées 1 -2 3-4 2-3 45 Aspect macroscopique des colonies 46  Technique d’isolement : Isolement sur milieu sélectif et différentiel Lecture des résultats : Milieu Chapman Milieu vire Milieu vire en jaune en rouge pH acide pH alcalin 47  Lecture des résultats : Milieu Chapman A : Staphylococcus aureus, B : Escherichia coli, M : Mélange des 2 souches A et B. A : Staphylococcus aureus, C : Bacillus subtilis, M : Mélange des 2 souches A et C. 48  IDENTIFICATION BACTERIENNE Objectif Apprendre à identifier et à reconnaitre des caractères biochimiques de différentes espèces bactériennes.  Recherche d’enzymes Caractère Protocole Résultat Interprétation recherché expérimental -Sur une lame propre - Catalase + : La catalase est une enzyme et sèche déposer une - Apparition d’un dégagement respiratoire, goutte d’eau gazeux: bulles oxygénée à 10 oxydoréductase volumes, - Catalase - : pas de bulles 1-Catalase - A l’aide d’une qui catalyse pipette Pasteur boutonnée, ajouter 2 H2O2 → O2 + 2 H2O. l’inoculum bactérien - Observer immédiatement. La recherche de Le test consiste à mettre en 2-Oxydase l'oxydase est un test évidence la capacité que possède la fondamental pour bactérie à oxyder un réactif l'identification desba incolore (la NN-diméthyl- cilles à Gram négatif paraphénylène diamine) en un dérivé rose violacé. On prépare une culture pure sur de la Colonie 3- Amylase Présence de gélose amidonnée : (GN + 1% d’amidon Amylase+ l’amylase (Striation). Auréole claire Couleur violette  Caractère Protocole expérimental Ensemencement recherché 4-Bouillon Dégradation Bouillon contenant Goutte à l’anse lactosé du lactose et lactose+peptones+ éléments production minéraux+ Rouge de phénol de gaz 5-Hugh et Voie On ensemence 2 tubes à la fois. Piqure centrale Leifson métabolique: L’un sera rempli d’huile de oxydatif/ vaseline stérile= tube fermé (TF), Fermentatif l’autre ouvert (TO) TO TF 6-Clarck et Type de Bouillon peptone glucose Ensemencement Lubs fermentation intense et incubation Acétoine/ acides mixtes + 48h 7-Citrate Prototrophie Milieu en pente contenant du Striation de Simmons citrate comme seule source de carbone+ bleu de bromothymol Rappel : Virage d’indicateurs acido-basiques en fonction du pH Les étudiants auront à identifier 6 souches bactériennes pures : A, B, C, D, E et F Une souche par grande paillasse, c’est-à-dire :  Binômes 1 et 2 : auront à leur disposition la souche A  Binômes 3 et 4 : auront à leur disposition la souche B  Binômes 5 et 6 : auront à leur disposition la souche C  Binômes 7 et 8 : auront à leur disposition la souche D  Binômes 9 et 10 : auront à leur disposition la souche E  Binômes 11 et 12 : auront à leur disposition la souche F Chaque quadrinôme (grande paillasse) dispose d’une culture pure (sur GN) de la souche à identifier et d’une gamme de milieu d’identification ensemencés, composée de :  Milieu de Hugh et Leifson  Milieu au citrate de Simmons  Bouillon lactosé  Milieu de Clark et Lubs (VP).  Eau oxygénée : H2O2 Des tests biochimiques (Besoin en oxygène et oxydase) ont déjà été réalisés sur les souches à identifier. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 1. D’autres tests, cités ci- dessus, ont aussi été réalisés et incubés. Les étudiants auront à faire leur lecture et compléter le tableau 1. Tableau 1 : Caractères biochimiques de certaines souches bactériennes Souches Besoin en Voie Oxydase Catalase Ferm. VP Citrate à identifier O2 d’attaque Lactose du glucose A Aéro- - anaérobie B Aéro- - anaérobie C Aéro- - anaérobie D Aéro- - anaérobie E Aérobie + stricte F Aéro- - anaérobie Questions :  Compléter, pour chaque souche bactérienne à identifier le tableau 1. Autrement dit, faites la lecture de la gamme de milieux d’identification dont vous disposez. Consulter le cahier de « Notes de TD- identification bactérienne »  En se basant sur les caractères biochimiques de souches connues (Tableau 2), construisez une clé dichotomique pour identifier la souche à votre disposition. Des tests biochimiques (Besoin en oxygène et oxydase) ont déjà été réalisés sur les souches à identifier. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 1. D’autres tests, cités ci- dessus, ont aussi été réalisés et incubés. Les étudiants auront à faire leur lecture et compléter le tableau 1. Tableau 1 : Caractères biochimiques de certaines souches bactériennes Souches Besoin en Voie Oxydase Catalase Ferm. VP Citrate à identifier O2 d’attaque Lactose du glucose A Aéro- - anaérobie B Aéro- - anaérobie C Aéro- - anaérobie D Aéro- - anaérobie E Aérobie + stricte F Aéro- - anaérobie  Tableau 2: Caractères biochimiques de certaines souches bactériennes connues Souches /caract. Besoin en O2 Voie d’attaque Oxydase Catalase Ferm. VP Citrate bioch. du glucose Lactose Pseudomonas Aérobie Oxydative + + - X + aeruginosa stricte Aeromonas Aéro- Fermentative + + - + V hydrophila anaérobie Escherichia coli Aéro- Fermentative - + + - - anaérobie Klebsiella Aéro- Fermentative - + + + + pneumoniae anaérobie Proteus vulgaris Aéro- Fermentative - + - - + anaérobie Yersinia Aéro- Fermentative - + - + - enterocolitica anaérobie Enterobacter Aéro- Fermentative - + V + + anaérobie Citrobacter Aéro- Fermentative - + + - + anaérobie V : variable Résultats de la clé dichotomique : Souche A : Escherichia coli Souche B : Citrobacter Souche C : Proteus vulgaris Souche D : Klebsiella pneumoniae Souche E : Pseudomonas aeruginosa Souche F : Yersinia enterocolitica L’identification d’une bactérie donnée peut se faire par la recherche de caractères biochimiques du métabolisme glucidique et protidique, en ensemençant une galerie d'identification : une "galerie" est un ensemble de milieux de culture, pouvant se présenter: - soit en tubes (macro-galerie) - soit en système miniaturisé (micro- galerie) Une galerie API (analytical profile index) est un ensemble de petits tubes prêts à l’emploi permettant l'identification de micro- organismes par la réalisation rapide et facile de tests biochimiques miniaturisés. Galerie API 20E d'E.coli  Synthèse Echantillon naturel Isolement sur Milieu sélectif et différentiel Colonies isolées Réisolement et Purification des colonies (Techniques des quadrants) Colonies pures Caractérisation macroscopiques et microscopiques (dont Coloration de Gram : Voir Plateforme) Identification biochimique (voir TD), moléculaire … 61