Tema 7 y 8 DIyS 2022 PDF

DINÁMICA INTRACELULAR Y SEÑALIZACIÓN INTRODUCCIÓN Tema 7. El tráfico intracelular. Métodos para su estudio. Comunicación entre compartimientos. Secuencias señal y zonas señal que especifican localización en proteínas. BLOQUE 1 Tema 8. Transporte regulado. El poro nuclear y las nucleoporinas. Transp...

DINÁMICA INTRACELULAR Y SEÑALIZACIÓN INTRODUCCIÓN Tema 7. El tráfico intracelular. Métodos para su estudio. Comunicación entre compartimientos. Secuencias señal y zonas señal que especifican localización en proteínas. BLOQUE 1 Tema 8. Transporte regulado. El poro nuclear y las nucleoporinas. Transporte regulado, el tráfico de proteínas entre citosol y núcleo. Receptores del transporte nuclear. Bases moleculares del transporte citoplasma-núcleo (importación) y del transporte núcleo-citoplasma de proteínas (exportación). Tráfico viral entre núcleo y citoplasma. BLOQUE 2 Tema 9. Transporte transmembrana. Bases moleculares del transporte de proteínas a las mitocondrias y los cloroplastos. Translocadores proteicos y chaperonas. Destinación de proteínas sintetizadas en la mitocondria. Importación de proteínas a los peroxisomas. Tema 10. La vía secretora. Translocación de proteínas al retículo endoplásmico rugoso (RER). Modificaciones pos-traduccionales y control de calidad en el RER. Plegamiento de proteínas y chaperonas moleculares. Degradación en el RER (ERAD). La respuesta a proteínas desplegadas (UPR). BLOQUE 3 Tema 11. Tráfico vesicular. Tipos de vesículas recubiertas. Clatrina, COPI y COPII. Proteínas de cubierta y proteínas adaptadoras. Mecanismos de formación y desprendimiento de vesículas. Regulación del tráfico vesicular y de mantenimiento de la diversidad de los compartimientos. Tema 12. El tránsito desde el RE al aparato de Golgi. El paso de cis a trans en el aparato de Golgi. Clasificación de proteínas en la red del trans Golgi. Transporte de la red del trans Golgi a los lisosomas. Exocitosis. Enfermedades lisosomales. Tema 13. Endocitosis mediada por receptor. Endocitosis como medio de entrada de patógenos en la célula. Endosomas tempranos y tardíos. Dominios lipídicos y caveolas. Endocitosis como medio de entrada de patógenos en la célula. Nanomedicina. Exocitosis. Exosomas. BLOQUE 4 Tema 14. El sistema lisosómico de degradación de proteínas. Degradación por autofagia. Diferentes tipos de autofagia. Degradación de proteínas y enfermedades humanas. Tema 15. Proteólisis no lisosomal en eucariotas. Proteasoma e inmunoproteasoma: estructura, mecanismos, sustratos y funciones. Ejemplos de regulación de procesos clave vía proteasoma. Calpaínas. TEMA 7. INTRODUCCIÓN AL TRÁFICO INTRACELULAR Rojo: tráfico regulado Azul: tráfico transmembrana Verde: tráfico vesicular 3 Figure 12-6 Molecular Biology of the Cell Señales de clasificación de proteínas 1. secuencia (péptido) señal 2. región señal 3. oligosacáridos de glucoproteínas 4 Table 12-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) TEMA 8. TRANSPORTE A TRAVÉS DEL PORO NUCLEAR 1. EL DESARROLLO Y LA ESTRUCTURA DEL PORO NUCLEAR 2. EL TRANSPORTE REGULADO Secuencias señal y su estudio Receptores del transporte nuclear El ciclo de ran El transporte citoplasma-núcleo de proteínas (importación) El transporte núcleo-citoplasma de proteínas (exportación) Direccionalidad del proceso 3. TRÁFICO VIRAL ENTRE NÚCLEO Y CITOPLASMA VIH1 y la célula huésped. VIA EVOLUTIVA PROPUESTA PARA EL NÚCLEO Y EL RER *topología (ciencia del lugar) The origins of mitochondria, chloroplasts, ER, and the cell nucleus could explain the topological relationships of these intracellular compartments in eucaryotic cells. (A) A possible pathway for the evolution of the cell nucleus and the ER. In some bacteria the single DNA molecule is attached to an invagination of the plasma membrane, called a mesosome. Such an invagination in a very ancient procaryotic cell could have spread to form an envelope around the DNA while still allowing access of the DNA to the cell cytosol (as is required for DNA to direct protein synthesis). This envelope is presumed to have eventually pinched off completely from the plasma membrane, producing a nuclear compartment surrounded by a double membrane. As illustrated, the nuclear envelope is organized by a fibrous shell called the nuclear lamina and is penetrated by communicating channels called nuclear pore complexes. Because it is surrounded by two membranes that are in continuity where they are penetrated by these pores, the nuclear compartment is topologically equivalent to the cytosol. The lumen of the ER is continuous with the space between the inner and outer nuclear membranes and topologically equivalent to the extracellular space. Formación de la barrera entre núcleo y citoplasma Segregación entre núcleo y citoplasma en el último ancestro común eucariota (LECA). Incorporación de nucleoporinas-FG (barrera de difusión y desarrollo del transporte activo). protocoatomero Sistema de endomembranas que conectan con el genoma y el sistema de protocoatomeros que estabilizan y curvan la membrana. HOT TOPIC Formación de los complejos de los poros nucleares en lugares de protocoatomeros. Difusión libre. FG-nups Jaula nuclear Lusk and King (2018) Curr Opin Cell Biol 44:44-50. Anillo externo Anillo interno Defectos en la compartimentalización: enfermedades 1. ESTRUCTURA DEL PORO NUCLEAR Estructura octagonal, simétrica 125 millones Da, 200 nm altura, 120 nm diámetro (16 ribosomas) Constituido de nucleoporinas (Nup), 50% con repeticiones FG (fenilalanina-glicina) Estructura flexible, capacidad de dilatación desde 9 nm a 42 nm. Architecture of the NPC. Shown is a model of a prototypical NPC from a side view (left) and top view (right), with dimensions from yeast (in red) or Xenopus (in green). The NPC exhibits 8-fold rotational symmetry, but is asymmetric about the plane of the nuclear envelope. A central framework region serves as a scaffold for the complex, with 8 filaments extending into the cytoplasm to form the cytoplasmic fibrils and 8 more extending into the nucleoplasm and terminating in a ring to form the nuclear basket. The center of the NPC is likely filed with disordered FG nucleoporin domains forming a meshwork 2. EL TRANSPORTE REGULADO Tráfico nuclear: Las repeticiones FG de las nucleoporinas < 5 kD -- difusión libre 17 kD -- 2 min 44 kD -- 30 min región hidrofóbica > 60 kD -- no puede entrar por difusión- transporte activo Asociaciones reversibles y rápidas formando una malla: pequeñas moléculas solubles en agua pueden pasar Transportadores tienen regiones hidrofóbicas en la superficie que se unen reversiblemente a las repeticiones FG. Pueden penetrar la malla. Recordatorio: Organización de la Célula Señal de importación nuclear (NLS, Nuclear Localization Signal) Kalderon et al., Cell 1984. Alan Smith, Mill Hill labs (London, UK) SV40: antígeno T grande núcleo antígeno T grande mutado citoplasma NLS del antígeno T largo Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val 7 residuos, carga+ Estudio del transporte nuclear Los componentes citosólicos se pueden estudiar usando células permeabilizadas con digitonina. 1) Permeabilización de las células con digitonina. Envoltura nuclear se mantiene intacta. 2) Lavados para eliminar los componentes citosólicos y obtención de núcleos competentes. 3) Adición de componentes citosólicos definidos y proteína marcada. Factores necesarios para la importación de una proteína con una NLS clásica Importina-α: interacciona con la NLS Importina-β1: interacciona con la importina-α y las nucleoporinas Ran-GTPasa: dos estados: unido a GDP o GTP NTF2 (nuclear transport factor 2): recicla Ran-GDP al núcleo. Los péptidos señal se pueden estudiar mediante ensayos de transfección 1) Construcción de un cDNA codificando una proteína de fusión (señal-proteína citosólica) 2) Transfección en células 3) Localización 4) Mutagénesis Los péptidos/secuencias señal son necesarios y suficientes para el direccionamiento de proteínas La electroporación Se abren poros transitorios en la membrana plasmática Secuencias señal para el transporte nuclear Vía transportina Vía importina β NLS ricas en lisinas (K) Vía exportina (CRM1) NES rica en aa con cadenas laterales no polares, sobre todo leucinas Las secuencias señal para el núcleo se pueden encontrar en cualquier parte de la proteína Receptores de importación nuclear Transportina Receptores que se unen directamente a la carga ej. Transportina (otros nombres: Importina β2 o carioferina β2) Importina α: proteína adaptadora que se une a las dos proteínas Importina β1 Receptores que se unen a través de proteínas adaptadoras a la carga (ej. Importina β1 (carioferina β1 – se une a la importina α, “vía clásica” ) (A) Many nuclear import receptors bind both to nucleoporins and to a nuclear localization signal on the cargo proteins they transport. Cargo proteins 1, 2, and 3 in this example contain different nuclear localization signals, which causes each to bind to a different nuclear import receptor. (B) Cargo protein 4 shown here requires an adaptor protein to bind to its nuclear import receptor. The adaptors are structurally related to nuclear import receptors and recognize nuclear localization signals on cargo proteins. They also contain a nuclear localization signal that binds them to an import receptor. El ciclo de Ran Distribución asimétrica de RanGEF y Ran GAP → gradiente de RanGTP → unidireccionalidad del transporte ALTA CONCENTRACIÓN (proteína liberadora de nt de guanina) ALTA CONCENTRACIÓN (factor de intercambio de Ran-nt) Unido a cromatina Ntf2: nuclear transport factor2 recicla Ran-GDP al núcleo) El ciclo de Ran Modelo como la unión de Ran-GTP puede causar la disociación de la carga de receptores de importación Distribución asimétrica Ran: proteína G monomérica que funciona como un interruptor molecular (A) Nuclear transport receptors are composed of repeated a-helical motifs that stack into either large arches or snail-shaped coils, depending on the particular receptor or adaptor. Cargo proteins and Ran-GTP bind to different regions at the inside faces of the arches. In a co-crystal of a nuclear import receptor bound to Ran-GTP, a conserved loop (red) of the receptor becomes covered by bound Ran-GTP, which, in the Ran-free state of the receptor, is thought to be important for signal sequence binding. (B) The cycle of loading in the cytosol and unloading in the nucleus of a nuclear import receptor. El transporte citoplasma-núcleo (importación) Ran-GDP alto Ran: proteína G monomérica Ran-GAP (proteína liberadora de nucleótidos de guanina) NTF2: recicla RanGDP al núcleo) Ran-GEF (factor de intercambio de Rannucleótido) Ran-GTP alto Regulación de la importación A y B: la NLS debe ser reconocible por el receptor de la importación C: la fosforilación incrementa la afinidad por el receptor de importación El transporte núcleo-citoplasma (exportación) Dependiente de Ran y de una Señal de Exportación Nuclear (NES). o Mediante carioferinas (unas 20 en mamíferos) o Se exportan: proteínas, ribonucleoproteínas heterogéneas nucleares (hnRNPs) y algún complejo mRNA-hnRNPs, subunidades ribosómicas, tRNAs o Modo de exportación: directo (NES en la proteína) o indirecto (a través de la asociación con otra proteína que contenga una NES) Independiente de Ran (Biosíntesis de macromoléculas y su regulación) Mediante transportador mRNP “complejo proteína ribonuclear mensajero” oSe exporta: la mayoría de los RNA mensajeros maduros Exportación de una proteína con una NES por la exportina (CRM1) Ran-GAP (proteína liberadora de nucleótidos de guanina) NES: nuclear export signal (10aa) rica en leucinas complejo trimolecular Ran-GEF (factor de intercambio de Rannucleótido) La direccionalidad del proceso La GTPasa Ran es responsable del desensamblaje del complejo de importación/ exportación y de la direccionalidad del proceso Fig 12-12, 12-13 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2015) 22 RESUMEN 1) El poro nuclear es una estructura flexible compuesta por nucleoporinas. Se caracterizan por diferentes motivos estructurales y secuencias. El 50% tienen repeticiones FG. 2) Las importinas y las exportinas pertenecen a la familia de las carioferinas. La importina β importa proteínas con una NLS clásica mediante la proteína adaptadora importina α, la transportina importa proteínas con una señal PY-NLS y la exportina (CRM1) exporta proteínas con una NES. Los complejos se translocan a través del poro nuclear haciendo contacto con las repeticiones FG. 3) La importación y la exportación nuclear requieren la participación de Ran, una GTPasa que existe en diferentes conformaciones: unida al GTP o unida al GDP. El núcleo es rico en Ran-GTP, el citoplasma es rico en Ran-GDP. Es esa distribución diferencial de Ran confiere dirección al transporte nuclear. 4) El transporte nuclear es un proceso altamente regulado. Video importación y exportación https://www.youtube.com/watch?v=rjaudsjiGV8 3) TRANSPORTE VIRAL A TRAVÉS DE LOS POROS NUCLEARES Un ciclo vital vírico sencillo La propagación vírica depende de la maquinaria de la célula huésped Pasos en la replicación: 1) Entrada en la célula huésped 2) Desensamblaje de la partícula vírica infectiva 3) Copia del genoma 4) Síntesis de las proteínas víricas por la maquinaria de traducción de la célula huésped 5) Ensamblaje de estos componentes en partículas víricas hijas. El genoma vírico codifica 3 tipos de proteínas: 1. para replicar el genoma 2. para empaquetar el ácido nucleico 3. para modificar la estructura de la célula o la función celular para incrementar la replicación de los viriones. 4. en algunos casos para modular o alterar los mecanismos de la defensa inmunitaria. Figure 24-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) El virus de la inmunodeficiencia VIH 1983 Luc Montagnier y Franҫoise BarréSinoussi (Robert Gallo) 2008 Premio Nobel para Montagnier y Barré-Sinoussí por aislar el virus. Lentivirus, retrovirus, no oncogénico Virus esférico con varias capas proteicas, Nucleocápside Material genético: RNA DNA (provirus) Infecta linfocitos T4 por su receptor CD4, monocitos y macrófagos. Harald zu Hausen Luc Montagnier Franҫoise BarréSinoussi El ciclo de replicación del VIH1 Rojo: proteínas virales Negro: proteínas celulares Hot topic Los tres modelos actuales de la perdida de la nucleocápside viral 1 2 3 1) Pérdida de la cápside en el citoplasma y transcripción reversa (RT). Translocación del ADN a través del NPC. 2) Anclaje al poro nuclear, perdida de la cápside y RT en la vecindad del NPC. 3) Es el más nuevo y más sorprendente. Pasos: (1) viaje de la nucleocápside por MT; (2) anclaje al NPC y translocación de la nucleocápside intacta; (3) Inicio de la RT y terminación en las motas nucleares; (4) pérdida de la cápside cerca del sitio de integración y integración del ADN viral en el genoma. Shen et al. (2021) Maduración del mRNA mRNA recubierto de las proteínas adecuadas que indican su estado de maduración El genoma complejo del HIV RRE: elemento de respuesta a Rev 9 genes , RNA polimerasa del huésped, transcrito de 9 kb, esplicing alternativo da lugar a 30 mRNAs diferentes Figure 7-102 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) La exportación de RNA viral mediada por Rev Proteínas virales reguladoras (Rev, Tat) Proteínas virales estructurales y enzimas Complejo mRNARev-Exportina 1 Figure 7-103 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) ¿Cómo se trate el SIDA hoy? Medicamentos antirretrovirales usados en el tratamiento. Medicamentos antirretrovirales están destinados a suprimir el HIV1, aliviar síntomas y prevenir infecciones, pero no lo curan ni lo erradican. Shukla and Chauhan (2019) Factores de la célula huésped que restringen ciertos pasos en el ciclo del replicación del virus. Sin embargo mutaciones en el VIH1 son capaces de anular su efectividad. La situación actual Bibliografía básica Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts and Walter. (2016). Biología molecular de la célula 6ª ed. Capítulo 12.Transporte de moléculas entre el núcleo y el citosol. Capítulo 7: El transporte regulado de RNA viral. Capítulo 24. Propagación vírica. Lodish, Berk, Kaiser, Krieger, Bretscher, Ploegh, Amon and Martin. (2016) Molecular Cell Biology. 8th ed. Chapter 13.6 Transport in and out of the Nucleus. Chapter 10.3 HIV Rev Protein. Bibliografía específica Lusk and King (2018) The nucleus: keeping it together by keeping it apart. Curr. Opin Cell Biol. 44:44-50. Shen et al. (2021) import of HIV1. Viruses 13:2242. Shukla and Chauhan (2019). Host-HIV1 interactome: a quest for novel therapeutic intervention. Cells 8:1155.