TEMA 11: Modificación de la secuencia de ADN: Aproximaciones (PDF)

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TEMA-11.pdf Wisconsiners Ingeniería Genética 3º Grado en Bioquímica y Ciencias Biomédicas Facultad de Ciencias Biológicas Universitat de València Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética wisconsiners TEMA 11: Modificación de la secuencia de DNA: aproximaciones mediante genética directa 1. Genética directa vs Genética inversa Para el análisis funcional de mutaciones tenemos dos tipos de estrategias: la genética directa y la genética inversa. Lo que queremos es un análisis funcional para identificar el papel de un gen dentro de la célula. Se puede usar una estrategia que vaya del fenotipo al genotipo que es la estrategia directa o al revés, ir del genotipo al fenotipo, que es la estrategia inversa. 1.1 Genética inversa o reversa (tema 12) En este caso conozco los genes que forman el genoma de la célula, pero no siempre la secuencia me da información funcional sobre la proteína. Entonces a partir del gen, de forma dirigida puedo mutarlo dentro de esa célula y ver qué le pasa al organismo cuando dicho gen muta, ver cuál es el fenotipo mutante. Como vemos, nos dirigimos del genotipo al fenotipo. 1.2 Genética directa. En este caso, el análisis funcional se basa en crear mutaciones aleatoriamente en el genoma de una célula y luego, de la colección de mutantes que se obtiene, se aplica un criterio de selección. Previamente se debe pensar en qué proceso vamos a centrarnos y hay que pensar qué les tendría que pasar a los mutantes con defectos en el proceso que quiero estudiar, predigo el fenotipo de las proteínas de los genes implicados. De la colección de mutantes se seleccionan aquellos que tengan este fenotipo concreto. Después se clona o, de cualquier forma, se identifica el gen mutado que determina el fenotipo que buscamos. Como vemos, nos dirigimos del fenotipo al genotipo. En este tema vamos a ver la aproximación directa, analizando cómo es posible introducir mutaciones aleatorias en los diferentes organismos modelo como son Saccharomyces cerevisiae, C. elegans, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, y Arabidopsis thaliana. Esta técnica se puede realizar en todos los organismos modelo en biología, pero obviamente, no es lo mismo en los invertebrados que en los vertebrados. A modo de ejemplo tenemos una colección de estudios que llevaron a Premios Nobel gracias a estrategias de este tipo en organismos eucariotas invertebrados que han aportado importante información sobre procesos celulares básicos. BCB 1 de 8 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8770878 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética wisconsiners 2. Tipos de mutagénesis aleatoria (genética directa) Podemos introducir mutaciones en el genoma utilizando dos abordajes: mutagénesis química y mutagénesis insercional. También debemos diferenciar entre organismos con genomas sencillos, como procariotas o levaduras, y organismos con genomas complejos, como los mamíferos. 2.1 Mutagénesis química Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Se utilizan mutágenos que modifican las bases del ADN y su codificación, como podría ser el tabaco, pero obviamente como dice el gran Paquito no podemos dar de fumar a los ratones y tampoco son mutágenos de ese estilo, sino que son más agresivos. El mutágeno más habitual usado en microorganismos es el EMS (etilmetanosulfonato) que provoca mutación puntual GC-AT, para animales superiores como ratones funciona mejor la ENU (etilnitrosourea). Hay otros mutágenos más concretos y sofisticados que implican deleciones, usados sobre todo en plantas, pero que en muchos casos implican radiaciones por lo que se tienen que llevar a cabo en instalaciones específicas. Las radiaciones usadas son UV, irradiación gama que genera mutaciones puntuales o deleciones (< 1Kb) e irradiación de neutrones rápidos en las que se dan grandes deleciones, rearreglos cromosómicos. En la imagen vemos que algunos de los efectos de estos mutágenos, son cambios en la base nitrogenada que implican un cambio en el apareamiento de las bases como hemos visto en muchas ocasiones en diversas asignaturas. ‣ Mutagénesis en levadura (haploide) Cabe decir, que no es igual tener la colección de mutantes que provienen de un microrganismo, en un eppendorf en el que es más manejable, que cuando están en un ser vivo. Además, la levadura tiene una ventaja y es que posee un ciclo haploide. La mayor parte de mutaciones se verán en homocigosis siendo recesivas entonces en levadura, tenemos siempre una copia del alelo y se puede ver el fenotipo mutante más fácilmente, no tenemos el problema de la heterocigosis. Como se ve en el ejemplo del artículo de los ejercicios de clase, el procedimiento para detectar genes implicados en la glucólisis es el siguiente: se cogen células Wild Type, añadimos un mutágeno como puede ser el EMS, se mutagenizan y obtenemos algunas mutaciones no letales, entonces se hace un plaqueo. Se siembra la colección de mutantes en una placa que tiene como fuente de carbono el etanol donde pueden crecer en principio, aunque tengan mutada la utilización de la glucosa. BCB 2 de 8 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8770878 ¡Este verano, consigue 2 meses de inglés por 1€! - Matricúlate ahora en MyES Ingeniería Genética Banco de apuntes de la  Ingeniería genética wisconsiners Después hago un replica plate, se transfieren a una placa con glucosa como fuente de carbono, si tienen una mutación en algún gen relacionado con la glucólisis no podrán usar este medio, no crecerán (selección negativa). Por lo tanto, ya he obtenido un fenotipo mutante de interés, que está en relación con el proceso que quiero analizar. Tras esto, se podrá analiza el gen. En organismos más complicados el proceso también es posible, pero es más laborioso. ‣ Mutagénesis en C.elegans (diploide) Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Otra forma de identificar genes a partir de mutantes, es mediante el uso de C.elegans el cual es un nematodo que se cultiva en placas y del cual se conoce la filogenia de sus células. Se analizaron los mutantes unc con falta de coordinación. Se mutagenizaron los individuos y se observaron aquellos que se movían de forma diferente, que tenían el fenotipo mutante deseado. Lo que se supuso es que el mutante unc tenía un defecto en un gen que codificaba para funciones nerviosas y por ello se movía de forma extraña. Veremos más adelante que lo que se hace es clonar el gen que provoca este efecto asumiendo que es un gen recesivo. Pero, en este organismo tenemos el problema de que solo veremos los fenotipos recesivos cuando estén en homocigosis ya que es diploide. La ventaja es que el organismo es hermafrodita (puede autofecundarse), de forma que en la F2 se obtienen mutaciones en homocigosis pudiendo así observar el fenotipo. Lo que ocurre es que un parental con esperma mutado y otro con óvulo mutado se cruzan y generan un descendiente F1 heterocigoto que por autofecundación puede originar individuos homocigotos mutados. ‣ Mutagénesis en mamíferos (diploide) Si por ejemplo uso ratones o animales más complejos como son los mamíferos, debo ir haciendo cruces y hasta la F3 no obtendría estos mutantes ya que necesitaría dos individuos en la G2 (cada uno procedente de un cruce G1 distinto) que fueran mutantes heterocigotos para poder conseguir en la G3 un mutante homocigoto: 2.2 Mutagénesis insercional Esta mutagénesis consiste en hacer que elementos móviles se inserten en el genoma, en un gen, irrumpiéndolo e inactivándolo, de esta forma se puede obtener un fenotipo mutante y así poder analizarlo. ‣ Mutagénesis con transposones Algunos de estos elementos móviles son los transposones. Al final de los mismos tenemos unas secuencias terminales invertidas repetidas (elementos cis) que son las que reconoce la transposasa (expresada en trans) para llevar acabo el salto de la molécula dadora de DNA al target. La ingeniería genética hace uso de la irrelevancia de BCB 3 de 8 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8770878 ¡Este verano, consigue 2 meses de inglés por 1€! - Matricúlate ahora en MyES  Ingeniería genética wisconsiners las secuencias que flanquean las repeticiones terminales. De esta forma, podemos construir transposones modificados con secuencias que permitan seleccionar las células donde se han producido la inserción (marcadores de selección), es decir, la ventaja es que solamente se necesitan las secuencias repetidas terminales para que se dé el proceso y en la parte intermedia del transposon podemos añadir cualquier secuencia, cualquier gen (puede ser un marcador que permita saber en qué gen se inserta el elemento transponible, resistencia a antibióticos etc.). En el caso de levaduras los transposones más utilizados son los bacterianos (aunque también hay otros como el famoso Sleeping Beauty que me cago en sus mismísimos muertos usado en mamíferos). Utilizamos una versión modificada del transposón que sólo conserva las secuencias (repeticiones) terminales, podemos introducir diferentes elementos que faciliten el uso del transposón, como el marcador URA3 o lacZ, secuencias loxP, etc. La transposasa actúa en trans reconociendo las secuencias terminales. El procedimiento consiste en introducir en E.Coli genotecas de levadura en vectores. En el ejemplo lo que se hace es colocar el transposón mTn dentro del vector en una secuencia flanqueada por secuencias Not (su enzima de restricción reconoce 8 pb, por lo tanto, una enzima muy infrecuente, específica). Después, se mete esta genoteca en una cepa de E.Coli que posee la transposasa. De las transposiciones que se den, algunas serán en el trozo de cromosoma correspondiente al de los plásmidos, por lo tanto, se dará irrupción de genes, por tanto, obtengo una genoteca mutagenizada gracias a los transposones que se han insertado aleatoriamente. Entonces se recuperan estos plásmidos, se digiere con Not y se obtienen fragmentos de DNA de levadura con estos transpones. Finalmente se introducen los fragmentos a una cepa de levadura y por recombinación homóloga se sustituye la secuencia endógena de la levadura por la secuencia mutada obtenida por transposición de E.Coli. BCB 4 de 8 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8770878 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética wisconsiners ‣ Mutaciones con transposones en retrovirus Otro vector pueden ser los retrovirus que se integran casi aleatoriamente en los genomas. Infecto unas células con retrovirus modificados genéticamente y con suerte se me inserta dentro de un exón, rompiendo el gen y generando un fenotipo mutante asociado a esa inserción. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. ‣ PCR: amplificación de secuencias desconocidas No explicó mucho porque ya lo hemos dado anteriormente pero básicamente se trata de identificar una secuencia desconocida que se ha insertado en un determinado vector. Para ello se utiliza la PCR inversa. Lo que ocurre es que se usa una enzima de restricción con dianas que flanquean una secuencia que conocemos. Después el fragmento obtenido se recirculariza mediante la acción de ligasas y por uso de esta PCR, utilizando cebadores complementarios a la secuencia conocida, podemos amplificar la región que queremos identificar y de la que no sabemos su secuencia. 2.3 Mutagénesis química vs mutagénesis insercional Ambos tipos de mutagénesis presentan sus ventajas e inconvenientes frente a la otra. Por un lado, la mutagénesis insercional se corresponde con mutaciones que afectan a la funcionalidad del gen por lo que con mucha probabilidad obtengo un mutante nulo. Además, si el gen es esencial, no será fácil identificarlo con esta estrategia porque se matará al organismo con mucha probabilidad, no será posible identificar el gen. Con el abordaje químico los cambios son más sutiles y obtengo mutantes condicionales, mutantes con función en unas condiciones concretas (por ejemplo, cuando suba la temperatura esa mutación que cambia solo un aminoácido deja de ser funcional), me da más variabilidad de fenotipo (alelo variable: fuerte, intermedio y débil). Por otro lado, si inserto un fragmento de DNA del que sé la secuencia, mediante esta técnica de PCR puedo analizar BCB 5 de 8 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8770878 ¡Este verano, consigue 2 meses de inglés por 1€! - Matricúlate ahora en MyES  Ingeniería genética wisconsiners fácilmente dónde se ha insertado y determinar la mutación de qué gen es consecuencia el fenotipo que observo. La identificación de los mutantes es fácil, pero en el caso de la química solo sé que gen está mutado cuando clone el gen que me complementa esa mutación, es más laborioso, requiere de herramientas de mapeo genético y población segregante. La ventaja de la mutagénesis química es que es simple generar un gran número de mutaciones, a diferencia de la insercional en la que el proceso es más complicado. Sin embargo, la mutagénesis química tiene mayor coste y complejidad en tiempo del proceso. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 2.4 Mamíferos: limitaciones (diapo de otro tema) En el caso de una levadura es muy sencilla la mutación de genes, cogemos una cepa y le ponemos un mutágeno en una concentración del 3%. Podemos medir la tasa de supervivencia ya que habrá mutaciones letales que no permitan la supervivencia de la columna. Se plaquea y se cuenta para ver cómo de profunda ha sido la mutagénesis con respecto al control. En el caso de la mutagénesis química/(ENU) o insercional (transposones) en mamíferos es poco efectiva ya que sólo una pequeña fracción del genoma corresponde a exones codificantes. Los exones suponen un porcentaje muy pequeño del genoma, a diferencia de levaduras, por tanto, es complicado introducir mutaciones aleatorias que inactiven genes ya que la mayor parte se van a producir secuencias diferentes a los exones, por eso la mayoría de mutaciones van dirigidas. La mutagénesis química en mamíferos a nivel de organismo es más compleja por lo que lo normal es que se use la insercional. ‣ Gene trap (GT) o trampa génica Para solucionar este problema vamos a usar un vector de inserción que se inserte en el genoma, que se pueda detectar en qué células se ha insertado y que tenga la posibilidad de disrumpir un gen que codifica una proteína. La trampa génica es un método de generación aleatoria de mutaciones insercionales en células madre embrionarias (células ES). La mutación se genera insertando el vector Gene Trap en el genoma de las células. La construcción lleva un gen marcador que nos indica en qué células se ha producido la inserción. En este caso tenemos a la derecha del dibujo un vector que incluye un gen lacZ sin promotor (ya que en este ejemplo veremos que usa el promotor endógeno del gen) y un gen marcador de resistencia a neomicina (Neo) bajo el control de su promotor hβ-actin promoter. Si se introduce en el gen de la izquierda, ¿cómo detectamos donde se ha integrado el fragmento de DNA? Mediante el marcador ya que cuando se haya integrado, la célula se volverá resistente a la neomicina, por lo tanto, su expresión indica que se ha insertado en el genoma, pero no dónde lo ha hecho. Siempre que tengamos neomicina indicará que el fragmento se ha insertado. El problema es que, en el caso de los genes, no se puede controlar donde se integra el fragmento, de forma que será más probable que se integre en un intrón que en un exón, por lo tanto, no tendrá efecto sobre la proteína, no se interrumpe la secuencia, no se obtiene el fenotipo. BCB 6 de 8 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8770878 ¡Este verano, consigue 2 meses de inglés por 1€! - Matricúlate ahora en MyES  Ingeniería genética wisconsiners Para resolver esto se crearon las construcciones de vectores gene trap en los que se introduce un sitio aceptor de splicing (SA) y además sitios dadores de splicing (creo que son los pA) de forma que, aunque se integre en un intrón del gen, obtendremos un transcrito con la interrupción de la secuencia. La expresión del gen donde se ha integrado el GT genera un transcrito truncado y por lo tanto la pérdida de función del gen. Es decir, tenemos la posibilidad de tener un fenotipo. Además, el splicing entre el exón del gen y la secuencia codificadora del reporter da lugar a una proteína de fusión ”reportera” cuya actividad podemos utilizar para diferenciar las células donde la inserción se ha producido en el gen (serán β-gal positivo) de aquellas donde la inserción se ha producido en una región extragénica (serán β-gal negativas, sin el promotor del gen no se podrá expresar esta proteína). Los vectores tipo “trap” pueden introducirse en células ES (células madre embrionarias) en el genoma por electroporación o por infección con retrovirus. A partir de estas células se pueden obtener animales transgénicos. 3. Identificación de genes a partir de mutantes Cuando ya tenemos los mutantes formados con el fenotipo observable, toca identificar el gen responsable de las mismas (yo imagino que seguimos en el contexto de la genética directa ya que vamos del fenotipo al genotipo). Las mutaciones pueden ser tanto dominantes como recesivas y ambas se pueden identificar por clonación, aunque las mutaciones dominantes son más complicadas de clonar por lo que nos limitaremos a identificar los genes recesivos mutados por complementación del fenotipo de un mutante en dicho gen (clonar por complementación de una mutación recesiva). 3.1 Identificación de genes a partir de mutantes en levadura Si era fácil introducir mutaciones en organismos modelo haploides pues también lo será clonar el gen que ha sido mutado y me produce el fenotipo que yo quiero. En el caso de levadura los genes tienen 3 letras y uno o más números. Si las letras están en minúscula son mutantes (yfg) mientras que si es mayúscula corresponden con el wild type (YFG). Además, como puedo tener distintos alelos en diferente forma, el número indica el alelo en el que está la mutación. Si las mutaciones que identifico están en el mismo grupo de complementación, estarán en el mismo gen, es decir, compartirán número, por ejemplo 1-1, 1-2, 1-3. El objetivo de la mutagénesis es obtener mutantes con un fenotipo concreto. Se transforma la levadura con una genoteca de DNA de fenotipo silvestre de forma que alguno de los plásmidos llevará un fragmento de DNA que incluirá el gen YFG con su promotor. Esto se complementará y la complementación se traducirá en una desaparición del fenotipo mutante, se obtienen el fenotipo silvestre (recordemos que la mutación es recesiva). Lo que estamos haciendo es meter la secuencia original a cambio de la mutada para devolver el fenotipo silvestre y demostrar que es ese gen el que al mutar da el fenotipo mutado que observamos. Como ya vimos, hay diferentes tipos de plásmidos que son YIp, YEp e YCp pero, ¿cuál se debe usar para estos experimentos de clonación por complementación? En el caso es Yip es integrativo, por lo tanto, cuesta mucho de introducir, debería introducirse en la célula y después recombinar, es poco eficiente. YEp se caracteriza por tener varias copias del plásmido recombinante gracias a tener más de un origen de replicación. Por último, YCp solamente tiene una copia por tener solo un origen de replicación. Aquí el tamaño no importa, ni el número. Normalmente, las copias de un gen que tienes en una célula es solo 1, entonces lo normal es que se complemente con un plásmido con una única copia. De hecho, cuando trabajamos con estos plásmidos que están en 30 o 40 copias podemos hacer otras relaciones genéticas diferentes porque a veces otro gen que no es el que has mutado (no es BCB 7 de 8 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8770878 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética wisconsiners ifg), puedes suprimir su mutación con un exceso de este otro gen (ifg) ya que te anula el fenotipo igualmente como ocurre con las ciclinas. Al poner las ciclinas en un vector de este tipo con 30-40 copias, son capaces no de complementar la mutación, sino de suprimir mutaciones de la quinasa CDC-28 (esto aparece en temas siguientes se supone). Por ejemplo, los mutantes de CDC-28-1 son termosensibles, no crecen a 37ºC. Se transforman las colonias con una genoteca y buscamos colonias que ahora sí que crezcan a 37ºC, es decir, colonias en las que se haya producido esta Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. complementación. Otro ejemplo es el caso del ciclo celular el cual no quiso explicar porque dijo que en años anteriores había sido un poco lío, pero se corresponde con las prácticas de proli. Básicamente consiste en observar los fenotipos (la forma de la célula) durante el ciclo celular. 3.2 Identificación de genes a partir de mutantes en C.elegans En C.elegans es relativamente fácil meter mutaciones y además se podían obtener homocigotos recesivos en la F2. También se puede realizar esta clonación por complementación, aunque de una forma más laboriosa en cósmidos (vectores de mayor tamaño). Se forman genotecas genómicas que se introducen en estos cósmidos que se pueden fraccionar e inyectar por microinyección dentro de los huevos de estos gusanos. Estos DNAs se mantienen por la formación de concatámeros (una especie de microcromosoma: extrachromosomal arrays) que contienen a estos genes y se pueden replicar, por lo tanto, cada minicromosoma estará formado tanto por la copia del gen wild type como por el gen marcador. Si en la fracción de genoma que hemos inyectado, se encuentra el gen que complementa la mutación, se va a expresar en estos minicromosomas y se revertirá el fenotipo. De esta forma el gen puede ser identificado por su capacidad para complementar el fenotipo mutante. 3.3 Identificación de genes a partir de mutantes en mamíferos También se puede clonar por complementación en células de mamífero, pero es mucho más complejo. La S2P es una proteína que se activa por proteólisis en el Golgi y se clonó por complementación en células de mamíferos. Esto se explica en la colección de artículos del tema, pero es una práctica poco habitual. BCB 8 de 8 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8770878 ¡Este verano, consigue 2 meses de inglés por 1€! - Matricúlate ahora en MyES