Separación de Proteínas: SDS-PAGE y Western Blot 2023 PDF

Separación de proteínas: SDSPAGE y Western blot Noviembre - 2023 Flujo de trabajo para realizar electroforesis de proteínas Cargando… Métodos comúnmente usados para romper células y tejidos -1) Presión de cizallamiento líquido (por ejemplo, prensa francesa) Disminución rápida de la presión a...

Separación de proteínas: SDSPAGE y Western blot Noviembre - 2023 Flujo de trabajo para realizar electroforesis de proteínas Cargando… Métodos comúnmente usados para romper células y tejidos -1) Presión de cizallamiento líquido (por ejemplo, prensa francesa) Disminución rápida de la presión al transferir la muestra desde una cámara a alta presión a través de un orificio a una cámara a baja presión. Rápido y eficiente, también para grandes volúmenes - Causa calentamiento de la muestra (se requiere enfriamiento) 2) Ultrasonido Disrupción de las células mediante sonido de alta frecuencia. Simple - Causa calentamiento de la muestra, que puede ser difícil de controlar mediante enfriamiento - Ruidoso - No adecuado para grandes volúmenes 3) Molienda con perlas de vidrio Agitación de las células con finas perlas de vidrio. + Útil para células que son más difíciles de romper (por ejemplo, levaduras) - Un tanto lento y ruidoso 4) Shock osmótico Cambio de un medio osmótico alto a uno de baja osmolaridad. + Simple, económico. Solo útil para la disrupción de células con paredes menos robustas (por ejemplo, células animales) 5) Congelación y descongelación repetidas Disrupción de las células mediante la formación repetida de cristales de hielo; generalmente combinado con lisis enzimática. Simple, económico + Produce fragmentos de membrana grandes - Lento - Puede dañar proteínas sensibles y disociar complejos de proteínas de membrana - Bajo rendimiento 6) Lisis enzimática Frecuentemente utilizada en combinación con otras técnicas, como congelación y descongelación o shock osmótico; la lisozima es comúnmente utilizada para romper las paredes celulares de las bacterias + Suave + Produce fragmentos de membrana grandes Lento - Bajo rendimiento Cargando… ¿En qué matriz se separan las proteínas y cual es el principio que rige la separación de las mismas? ¿Cuales son los componentes del gel y cómo se prepara? Reacción de polimerización de la acrilamida. Utilizando la amina TEMED como iniciador, la acrilamida forma largas cadenas de poliacrilamida, entrecruzadas con la bisacrilamida, que aporta reticulación al polímero, regulando su rigidez y porosidad. Estructura molecular del gel de poliacrilamida Características y funciones de los geles discontinuos Gel teñido con Coomasie Blue Migración de las proteínas dependiendo de la concentración del gel Cargando… Geles en condiciones no desnaturalizantes Western blot Corresponde a una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una célula, tejido, órgano o fluido corporal. La técnica es dependiente de la reacción de un anticuerpo con una proteína que está inmovilizada en una membrana. La técnica es usada para identifica una proteína blanco en una mezcla compleja de proteínas y además medir sus niveles de expresión. Uso de anticuerpos como herramienta diagnóstica • La molecula de interes es injectada en un animal (ratón, conejo, cabra) • Estos, fabrican anticuerpos contra ésta molécula • Los anticuerpos se purifican (anticuerpo primario) Uso de anticuerpos como herramienta diagnóstica • Los anticuerpos obtenidos en el primer animal ahora son injectados en un Segundo modelo animal • Este Segundo animal produce entonces anticuerpos contra el primer anticuerpo (anticuerpo secundario) • Este anticuerpo secundario es purificado y conjugado a un substrato colorimetrico o a una enzima 5 2 1 4 3 Evaluación de la generación de anticuerpos contra la rabia en caninos Cargando…