Sénescence Partie 1 PDF

PAB- Bio cell Pr Pretet Binôme 75: Gaspina 25/10/2024 de 10h à 12h La sénescence réplicative pt1 (Tout ce qui est en italique n’a pas été mentionné cette année mais aide à la compréhension) La sénescence réplicativ...

PAB- Bio cell Pr Pretet Binôme 75: Gaspina 25/10/2024 de 10h à 12h La sénescence réplicative pt1 (Tout ce qui est en italique n’a pas été mentionné cette année mais aide à la compréhension) La sénescence réplicative intervient dans les mécanismes clés de la régulation de la vie de la cellule. Une cellule a des capacités de prolifération qui ne sont pas infinies, il y aura un arrêt au bout d’un moment, c’est ce que l’on appelle la sénescence réplicative. C'est un phénomène physiologique qui fait référence au vieillissement. Objectifs Généraux : Comprendre ce qui limite la multiplication cellulaire Objectifs Spécifiques : définir la sénescence réplicative, comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires (voies de transduction mis en jeu) et explorer ce qu’il se passe quand il y a des anomalies de sénescence réplicative. L’objectif du cours est de comprendre ce qui limite la réplication des cellules. De plus, on verra une petite partie des mécanismes aboutissant au cancer. On retrouve des mécanismes communs entre le cycle cellulaire et la sénescence réplicative. On peut retrouver des anomalies dans la sénescence réplicative qui permettent d’expliquer certaines pathologies. I. Quelques constats à propos de la sénescence La sénescence réplicative est un mécanisme, un concept, qui a pu être développé grâce aux premières expériences de mise en culture de cellules au début du 20 ème siècle. Cela s’est beaucoup développé lors de la deuxième moitié du 20 ème siècle. Quand on prend un fragment de tissu chez un individu et qu’on le met en culture dans un milieu performant (MEC si cellules adhérentes), on constate qu'il y a 3 phases dans la culture de cellules normales : Phase 1 : Phase de culture primaire à partir d’un explant C’est la mise en culture de cellules dans un milieu adapté avec MEC à partir d’un explant (biopsie : prélèvement d’un fragment de tissus). On dissocie les cellules les unes des autres en éliminant les systèmes jonctionnels. On les place alors en culture dans un milieu propice (MEC, FC, éléments nutritifs, etc…) qui leur permettent de proliférer (on les cultive à 37°C°). Ce n’est pas si simple car le microenvironnement d’où les cellules viennent est difficile à mimer. Phase 2 : phase de prolifération et d’inhibition de contact Les cellules prolifèrent, elles vont se répartir sur le fond du système de culture. Quand la boite sera entièrement tapissée, les cellules vont arrêter de proliférer : c'est l'inhibition de contact (caractéristique des cellules normales). Les cellules ont un système via les jonctions mécaniques qui leurs indiquent qu’il n’y a plus de places. Les cellules vont alors s’arrêter en G0. On peut faire une sub-culture ou un passage cellulaire : on peut dissocier les cellules les unes des autres et les dissocier de la MEC (grâce notamment à un mélange de trypsine (enzyme protéolytique qui clive les molécules d’adhérences) et l'EDTA (chélateur de calcium : piège le calcium qui joue un rôle dans l’adhérence). On replace ces cellules en culture mais à une densité moindre (par exemple 1⁄4 des cellules) et elles vont reproliférer et recoloniser le fond de la boîte → re-inhibition de contact (on peut effectuer cette manœuvre plusieurs fois). Le doublement de population : c’est quand toutes les cellules se sont divisées. Nb : Si on avait des cellules cancéreuses, elles s'empilent les unes sur les autres au lieu d’avoir Page 1 sur 9 PAB- Bio cell Pr Pretet Binôme 75: Gaspina 25/10/2024 de 10h à 12h inhibition de contact. Phase 3 : Sénescence réplicative : ralentissement du doublement de population (dp) → arrêt de prolifération. On se rend compte que le temps mis par les cellules pour occuper la surface va augmenter ; il y a un ralentissement du doublement de population jusqu'à l'arrêt complet avant d’occuper tout l’espace disponible (même si on réalise une sub-culture). A un moment, les cellules auront de la place, des facteurs de croissance, des oligoéléments... et pour autant elles arrêteront de proliférer : c'est la sénescence réplicative ou limite de Hayflick (1965). (Impossibilité pour les cellules de continuer à proliférer et entrer dans le cycle cellulaire). Le nombre de cellules capables de proliférer diminue (ce n’est pas la durée du cycle cellulaire qui augmente). La limite de Hayflick (découverte par L.Hayflick en 1965) est le nombre de divisions cellulaires au- delà duquel une cellule entre en sénescence. Les cellules normales ont une capacité intrinsèque de réplication limitée en nombre de doublement de population. II. Quelques chiffres Des expériences ont été menées sur des fibroblastes de différentes espèces animales et humains (capacité de prolifération de fibroblaste in vitro). Quand on isole des cellules, les fibroblastes c’est ce qui pousse le mieux. → Pour la souris, le nombre de doublement de population avant la sénescence est d'environ 15 avec une longévité de 2 ans. → Pour la tortue des Galápagos, elle est de 130, et la longévité de plus de 100 ans. → Pour l'homme, il y a environ 60 doublements de population, longévité de 80 ans. On voit en parallèle la longévité de ces espèces → on constate alors un lien entre le nombre de doublement de population avant la sénescence réplicative et la longévité des individus. Plus les individus vivent longtemps, plus le nombre de doublement de population est important. Chez l'Homme, on a 2 exemples de pathologies proposés : Syndrome de Hutchinson–Gilford aussi appelé Progéria : individus qui vieillissent très rapidement sur le plan morphologique (ils ont une physionomie de personne âgés alors qu’ils sont jeunes). La capacité de doublement de leurs cellules est beaucoup moins importante que la normale (30 donc 2 fois moins), de ce fait la longévité des individus est elle aussi raccourcie, moins de 20 ans en moyenne. Syndrome de Werner, aussi appelé vieillissement prématuré, le principe est sensiblement le même que pour le Progéria. Le nombre de doublement de la population est ici de 15 avec une longévité inférieure à 50 ans. Intuitivement, si on veut vivre longtemps, il faut que les doublements de population soit important afin de renouveler les stocks cellulaires. Page 2 sur 9 PAB- Bio cell Pr Pretet Binôme 75: Gaspina 25/10/2024 de 10h à 12h III. La sénescence 1. Pourquoi la sénescence ? La sénescence est une forme de vieillissement. Les cellules d’un individu âgé ont moins de DP (=doublement population) (a priori). La sénescence c'est aussi une « marque du vieillissement des cellules », elles sont vieilles car elles ont un nombre important de divisions cellulaires (on caractérise « l’âge » d’une cellule non pas en fonction du temps mais en fonction du nombre de divisions). Ce mécanisme a pour but d’assurer une stabilité génétique en limitant le nombre de divisions. Une prolifération excessive conduirait à des aberrations génétiques. Les cellules d'individus âgés ont une capacité de doublement de population plus faible que celles des individus jeunes (les cellules chez les sujets âgés ont déjà proliféré). On observe un non-remplacement des cellules qui meurent. Les tissus auront une capacité de renouvellement moins importante (par exemple les pertes de masses musculaires chez les PA sont dues à ces défauts de remplacement). La cellule en sénescence est une cellule qui ne peut plus se multiplier, qui vieillit, et qui est donc associée à un certain nombre d’altérations de fonctions cellulaires : une modification du métabolisme entraînant la libération de protéines altérant la MEC et de cytokines pro- inflammatoires. Le micro-environnement est altéré et il devient moins favorable pour la multiplication des cellules. Cette inflammation va être un des facteurs qui favorise la mort progressive des cellules sénescentes. Il y aussi sécrétion de protéases qui vont altérer la MEC. Si on imagine que toutes les cellules d’un individu épuisent leur nombre de doublement de population, on obtiendrait une sphère de 135 km de diamètre La sénescence explique : (pas dit cette année mais intéressant) Que les cellules ne sont plus renouvelées La peau qui tombe Les muscles moins toniques Organes moins efficaces dans leur fonction À retenir : Sénescence = vieillissement des cellules et réduction de la taille de l’individu. On note toutefois que les cellules somatiques atteignent très rarement la sénescence réplicative (leur limite de prolifération) car elles sont soumises à un système de régulation; phénomène de différenciation (afin d’acquérir un phénotype qui leur est propre). Une cellule différenciée perd la capacité de proliférer. En cancérologie, quand on observe le tissu cancéreux au microscope, on voit des cellules qui ont perdu leur état de différenciation, elles n’ont plus les caractéristiques morphologiques de la cellule d’origine. La sénescence réplicative peut éventuellement concerner les cellules souches : ce sont des cellules qui ne se différencient pas ou très peu et qui conservent des propriétés de prolifération. Elles se divisent beaucoup et sont à l’origine du renouvellement des tissus. Ce sont des cellules qui ont un rythme de division plutôt lent (elles ne peuvent pas se diviser toutes les 24 h sinon au bout de 50 jours elles auraient atteint leur limite de prolifération), ça parait contre-intuitif mais si la cellule souche avait un rythme de division rapide, elle atteindrait très vite la sénescence réplicative. Page 3 sur 9 PAB- Bio cell Pr Pretet Binôme 75: Gaspina 25/10/2024 de 10h à 12h 2. Modifications morphologiques La sénescence réplicative est une notion qui a été mise en évidence à partir de cultures cellulaires (quand les scientifiques avaient accès seulement aux tissus pour observer au microscope, cette notion de sénescence ne pouvait pas émerger, car c’est un phénomène qui s’observe sur la durée). On observe des modifications morphologiques et métaboliques / biochimiques spécifiques des cellules qui entrent en sénescence réplicative : ▪ Cellules agrandies, aplaties, granuleuses (car nombre et taille des lysosomes augmentés) ▪ L’aspect granuleux est dû à l'augmentation du nombre et de la taille des lysosomes (qui permettent le recyclage notamment) : l'activité lysosomale catabolique est très importante. ▪ Expression de beta- galactosidase lysosomiales associée à la sénescence = SA-β-Gal (acronyme anglo saxon) ▪ Autophagie : cellule qui se digère elle-même, correspondant à un mécanisme de survie en cas de carence (recyclage des produits intracellulaires pour faire face à une carence). L’autophagie peut aussi conduire à la mort cellulaire selon les conditions dans lesquelles elle se trouve. NB: apoptose (mort cellulaire) est différent que la sénescence (vieillissement cellulaire) Photo du haut : on voit ici des fibroblastes. Ce sont des cellules plutôt allongées ancrées à la MEC. Photo du bas : on peut voir des fibroblastes également mais ici, ils sont sénescents. En culture, la cellule s’agrandit (leur surface est beaucoup plus importante), s’aplatit et devient granuleuse. Ces grains correspondent à l’augmentation du nombre et de la taille des lysosomes (compartiments IC qui servent à dégrader et recycler les protéines ou les acides nucléiques). La β- galactosidase lysosomiale s’exprime exclusivement dans les cellules sénescentes et augment le nombre de lysosome Sur le plan biochimique, on met en évidence cette β-galactosidase lysosomiale. On utilise ici un substrat (X-Gal) qui est un colorant bleu dérivé du galactose. Le substrat de l'enzyme est en fait incolore mais ce substrat est dégradé par l'enzyme β-galactosidase lysosomiale qui est exprimée dans la cellule sénescente. On voit alors une précipitation bleue si celle-ci est présente. NB: apoptose est différent que la sénescence La cellule sénescente n'est pas morte même si elle est sur sa fin de vie, ce sont deux mécanismes différents, ce n’est pas l’apoptose. La sénescence est l’arrêt de la prolifération cellulaire. 3. Les facteurs limitant la prolifération Ce sont les régulateurs du cycle cellulaire qui vont intervenir, deux anti-oncogènes qui jouent un rôle central : ▪ p53 (protéine gardienne du génome) qui induit l'expression de CKI comme p21, p16 qui vont bloquer les complexes cycline/CDK. (P53 intervient en G1, en S et en G2/M au cours du cycle cellulaire.) ▪ pRb : (protéine du Rétinoblastome) qui va séquestrer les facteurs de transcription de la famille EDF impliqués dans la réplication de l'ADN. (PRb est impliquée dans la régulation du cycle cellulaire au niveau de la transition G1/S ; en effet, lorsqu‘elle est phosphorylée elle va favoriser le cycle cellulaire) Page 4 sur 9 PAB- Bio cell Pr Pretet Binôme 75: Gaspina 25/10/2024 de 10h à 12h Si l’on touche ces protéines, on peut observer des doublements de population dans des cellules en sénescence : ▪ Séquestration et inactivation de p53 et pRb par l’antigène T du virus SV40 (virus oncogène qui produit cet antigène). Lorsque l'on transfecte cet antigène T du virus SV40 à des cellules qui vont entrer en sénescence, on voit qu'elles récupèrent un nombre de doublement de population. C’est un contre-exemple à la sénescence. En effet, si on élimine P53 et PRb les cellules vont gagner de 10 à 30 DP supplémentaires. ▪ Si p53 et pRb sont inactifs par des mutations (processus de carcinogénèse), on peut gagner jusqu'à 100 doublements de population supplémentaires. Les cellules cancéreuses ont donc des capacités de prolifération qui sont au-delà des cellules normales notamment grâce à ces mécanismes car les principaux régulateurs du cycle (p53 et pRb) sont inactivés. P53 et pRb sont donc indispensables à l’induction de la sénescence réplicative. Néanmoins, à l'issue de ces doublements de population gagnés (soit par l'action de protéines virales soit par inactivation de p53 et pRb), toutes les cellules vont finir par mourir. Elles rentrent à nouveau en sénescence : c’est la crise. La crise se traduit par la mort des cellules. 🡪 Donc cette inactivation de p53 et pRb n’est pas suffisante car les cellules finissent quand même par rentrer en crise, arrêtent de proliférer et meurent. Ainsi y a deux étapes « barrières » dans la sénescence : ▪ Limite de Hayflick qui représente le nombre de divisions au-delà duquel la cellule entre en sénescence, liée à p53 ou pRb (physiologique). ▪ La crise : si jamais de part des mutations ou des protéines virales, la limite de Hayflick venait à être franchie (les cellules échappent à la sénescence, non physiologique), la crise est une deuxième barrière qui entraîne la mort cellulaire. Elle arrive quand on favorise le doublement de cellules. Il est néanmoins possible que les cellules continuent de proliférer, elles peuvent devenir immortelles en passant la crise (= condition pathologique). Ces rares cellules ont des propriétés de prolifération, en théorie illimitées, ce sont des cellules immortelles (ex : cellules cancéreuses). En récapitulatif : Si on lève l’inhibition en inactivant p53 et pRb par des P virales ou des mutations ; on gagne en DP mais les cellules finissent par arriver en crise et mourir. Néanmoins si on continue à cultiver ces cellules on verra que certaines de ces cellules vont finir par continuer à proliférer et donc on aura un processus d’immortalisation. Ces cellules devenues immortelles continueront à proliférer par la suite. Exemple : on a des cellules en culture depuis les années 60 dans le monde (levée de la sénescence réplicative → processus d’immortalisation). IV. Quels sont les mécanismes de la sénescence ? Comment? La sénescence ne va pas avoir lieu au bout d’un certain temps, elle est liée aux nombres de divisions cellulaires (induite après un certain nombre de DP) et non pas à un certain tps de division ! Ce qui rythme la vie de la cellule se sont les divisions qui passent ! C’est l’horloge mitotique : le temps/âge des cellules se compte en nombre de doublement de population (=nombres de mitoses, d’où le nom d’horloge « mitotique »). Par exemple : une cellule qui s’est divisée 2 fois en 40 ans est toute jeune mais si la cellule s’est divisée 50 fois en 30 jours : elle est vieille (on parle donc d’horloge mitotique). Page 5 sur 9 PAB- Bio cell Pr Pretet Binôme 75: Gaspina 25/10/2024 de 10h à 12h Il y avait deux hypothèses pour expliquer l’induction de la sénescence réplicative : 1. Dilution d’un constituant cytoplasmique. Hypothèse selon laquelle on aurait un composé intracellulaire avec une quantité fixe qui se diluait au fur et à mesure des divisions. Et quand celui-ci arriverait en deçà d’une certaine concentration dans la cellule ; la sénescence se déclencherait. Or, on n’a jamais trouvé cette substance qui se diluait et qui induirait la sénescence. 2. Perte de fragment d’ADN au cours des divisions : érosion des télomères (= télotomie). On a observé sur des cellules en culture qu’à chaque division cellulaire = DP : les télomères (parties distales des chromosomes) se raccourcissent 🡪 érosion des télomères = télotomie. L’induction de la sénescence réplicative est donc directement liée à cette érosion des télomères. 1. Les télomères Ce sont les extrémités des chromosomes (donc 2 télomères par chromosome), des séquences nucléotidiques répétées (palindromiques), c’est un ADN non codant : TTAGGG/CCCTAA sur 5 à 15kb (séquence assez conséquente). Ils protègent l’ADN notamment lors de la mitose, pour éviter les fusions aux extrémités lors de la duplication de l’ADN. On peut les mettre en évidence grâce à une sonde (FISH) En rouge sur l’image (bout chromosomes) = séquences télomériques sur chromosomes Les télomères sont érodés à chaque division, jusqu’à être éliminés. Quand la taille des télomères devient trop petite, il y a induction de l’arrêt du cycle cellulaire. On voit des raccourcissements à chaque division : ici 2DP mais il faut imaginer qu’il y en a une soixantaine 2. Sur le plan moléculaire Il y a plusieurs mécanismes : ▪ Défaut de polymérisation lié au mécanisme de réplication de l’ADN lui-même (ou duplication de l’ADN) : il y a la fourche de réplication qui s’ouvre et les ADN polymérases se déplacent sur l’ADN dédoublé. Elles synthétisent de 5’ vers 3’-> brin directeur, avec comme matrice le brin 3’ 5’. C’est le brin directeur. Sur l’autre brin 5’ 3’ = brin retardataire = complémentaire (il forme une boucle), il est à l’envers, la polymérase commence de l’autre côté (3’). L’ADN polymérase possède le fragment d’Okazaki, complémentaire de l’ADN, qui possède une séquence ARN qui sert d’amorçage et comble les séquences qui n’ont pas encore été répliquées. Cela permettra de synthétiser dans le sens 5’ 3’ par petit bout (synthèse en discontinue). A la dernière amorce, il manque un petit fragment d’ADN sur le brin retardataire où était le fragment d’ARN, il n’y a rien pour combler ce vide donc ce bout d’ADN est perdu. On a donc un ADN matrice simple brin qui a été grignoté par une DNase. Le fragment retardataire sera donc plus court. C’est donc le télomère retardataire qui est raccourci → C’est le mécanisme principal. Page 6 sur 9 PAB- Bio cell Pr Pretet Binôme 75: Gaspina 25/10/2024 de 10h à 12h A chaque cycle on perd de 100 à 200 pb → télomères s’erronent à chaque DP. ▪ Via l’action d’exonucléase en 5’ du brin néosynthétisé. Il y a des fragments plus courts, les exonucléases tentent de remettre les télomères à la même taille en les raccourcissant. On a donc une diminution du télomère directeur qui peut même devenir plus petit que le retardataire. ▪ Recombinaison inégale : avant la mitose, fragments plus longs que d’autres sur ADNdb. S’il y a des phénomènes de recombinaison (liés aux répétitions), les télomères seront inégaux (un des deux sera raccourci). Le prof n’insiste pas sur ces phénomènes … Défaut de polymérisation : Exonucléase Recombinaison inégale : 3. Conséquences de l’érosion Si les télomères continuent de s’éroder, on va finir par tomber sur des séquences codantes (≠ des séquences répétées des télomères). Page 7 sur 9 PAB- Bio cell Pr Pretet Binôme 75: Gaspina 25/10/2024 de 10h à 12h Lorsque les télomères sont