Seminaris 3 i 4 BCBD - Laia Vázquez PDF

Objectius Estudiar la determinació del patró en el model de l’extremitat i fer un exercici de lectura, anàlisi i discussió d’un treball científic. Procediment Visionat d’un vídeo que introdueix la determinació del patró. Breu introducció de l’extremitat del pollet com a model de determinació del pat...

Objectius Estudiar la determinació del patró en el model de l’extremitat i fer un exercici de lectura, anàlisi i discussió d’un treball científic. Procediment Visionat d’un vídeo que introdueix la determinació del patró. Breu introducció de l’extremitat del pollet com a model de determinació del patró. Discussió del vídeo i d’un article que els estudiants hauran llegit i analitzat prèviament amb l’ajut d’un qüestionari. Vídeo “Lewis Wolpert - How Our Limbs are Patterned like the French Flag” El vídeo es una conferencia del Professor Wolper que va tenir lloc en l’entorn d’un marató de 24h en la galeria d’exposicions “Serpentine Gallery” a Londres, on es varen explicar experiments realitzats per artistes i científics destacats. Els experiments exploraven les idees de temps, espai i de realitat. El Prof. Wolper introdueix la determinació del patró. Planteja els principals problemes d’una forma didàctica i amena i s’ocupa especialment de la determinació del patró de l’extremitat dels vertebrats. L’extremitat del pollet com a model de determinació del patró La forma tridimensional dels organismes és assolida mitjançant un procés denominat “formació o determinació del patró”. Les característiques generals del pla corporal queden establertes inicialment a grans pinzellades. Posteriorment es produeix un refinament d’aquestes primeres diferenciacions que condueix a l’establiment d’unes regions semi-autònomes conegudes com camps secundaris, a on es repeteix el procés d’especificació regional. La determinació del patró en aquests camps es fa en quatre fases : 1. Definició de les cèl·lules que constitueixen el camp. 2. Establiment de centres senyalitzadors que proporcionen informació posicional. 3. La informació posicional del camp és registrada a nivell cel·lular. 4. Les cèl·lules es diferencien responent a nous senyals d’acord amb la informació posicional registrada prèviament. La base molecular d’aquests esdeveniments és un tema de recerca actual i en els últims anys s’ha progressat notablement en la comprensió d’aquests processos en el model de l’extremitat dels vertebrats. El desenvolupament de les extremitats és un dels grans temes de la biologia del desenvolupament. El botó o brot de l’ala a l’embrió de pollet és fàcilment accessible a la manipulació quirúrgica i les alteracions del patró que resulten de les pertorbacions experimentals es manifesten clarament en els elements esquelètics de l’extremitat. 1 Una extremitat s’origina a partir del botó o brot que consisteix en cèl·lules mesenquimàtiques (mesoderm) recobertes per l’epiteli ectodèrmic. Els primers signes del desenvolupament de les extremitats a l’embrió de pollet són uns engruiximents del mesoderm de la làmina lateral (somatopleura) al costat dels somites 15-20 (ala) i 26-32 (pota) entre els 2 i 3 dies del desenvolupament. Això és degut al manteniment de la proliferació cel·lular a aquests llocs mentre que a la somatopleura enfrontada als somites 21-25 (flanc) disminueix. Després, l’ectoderm situat sobre el mesènquima s’infla i es fa més gruixut. Al marge de l’extrem apical, l’epiteli forma un engruiximent discret conegut com cresta ectodèrmica apical (apical ectodermal ridge : AER). El component mesodèrmic del botó de l’extremitat consisteix en una malla laxa de cèl·lules mesenquimàtiques, anomenada zona de progrés. A mesura que el botó es va allargant, una zona de cèl·lules mesenquimàtiques indiferenciades, zona de progrés, roman a la part apical de l’extremitat mentre que les cèl·lules de la regió proximal comencen a diferenciar-se per formar l’esquelet i els muscles. L’eix posterior–anterior de l’extremitat es desenvolupa de forma diferent a l’eix pròxim-distal. A la part posterior del botó de l’ala hi ha la “zona d’activitat polaritzant” (ZPA) que actua com a morfogen. Experiments inicials de transplantament d’un fragment de la part posterior del botó de l’ala (ZPA) a la regió anterior, i la duplicació especular dels dígits que en resulta (4 3 2 2 3 4). Aquest resultat es pot explicar per una duplicació del gradient com a conseqüència de l’existència de dues fonts del morfogen. Aquests resultats experimentals es poden comparar amb malformacions que s’observen a l’home (polidactília). Pel que fa a la naturalesa química del morfogen, un article clàssic del Prof. Wolper (Tickle, Alberts, Wolper and Lee.Local application of retinoic acid to the limb bud mímics the action of the polarizing region. Nature 296, 554-566. 1982) explica com la vitamina A (àcid retinòic) produeix el mateix resultat que el trasplantament de la zona d’activitat polaritzant a la regió anterior de l’extremitat. Si les cèl·lules de la zona d’activitat polaritzant trasplantades provenen d’un embrió de ratolí, es produeix igualment una ala duplicada de pollet. Les cèl·lules trasplantades només serveixen per indicar la posició en el camp de l’extremitat. Posteriorment als estudis de l’àcid retinòic (RA) com a morfogen de la ZPA, es va definir Sonic hedgehog com a molècula inductora de l’activitat de la ZPA (Riddle, Johnson, Laufer and Tabin. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell 25, 1401-1416. 1993). 2 Com a estructura tridimensional, l’ala té tres eixos de polaritat : → Eix pròxim-distal (P-Di) de l’espatlla als dígits. → Eix antero-posterior (A-Po) del dígit 2 al dígit 4. → Eix dorso-ventral (D-V) del cantó superior a l’inferior. Les cèl·lules que formen l’esquelet i demés teixits connectius de l’extremitat deriven de la somatopleura excepte les que formen els muscles que deriven dels somites. Cap al dia 10 d’incubació (l’eclosió és als 21 dies), el patró bàsic de l’extremitat ja està establert. L’esquelet adopta inicialment la forma de cartílag que posteriorment s’ossificarà, mentre que el patró de muscles i nervis és ja molt semblant al definitiu. L’esquelet de l’ala del pollet consta de un húmer, a continuació el cúbit i el radi i tres dígits (equivalents als humans 2, 3 i 4 en ordre antero-posterior) formats per carpians i falanges. Discussió de l’article 3 “Evidence that Shh cooperates with a retinoic acid inducible co-factor to establish ZPA- like activity” Toshihiko Ogura, Ignacio S. Alvarez, Astrid Vogel, Concepción Rodríguez, Ronald M. Evans and Juan Carlos Izpisúa Belmonte (1996). Development 122, 537-542. Es tracta d’un article sobre la determinació del patró. En aquest article l’investigador espanyol Dr. Izpisúa Belmonte, que desenvolupa la seva recerca a California, USA, ens explica con l’àcid retinòic i el producte del gen Sonic hedgehog (Shh), cooperen com a morfògens senyalitzadors de la “zona d’activitat polaritzant, ZPA. Tècnicament, és relativament simple i això facilita la seva utilització com a material per a una pràctica d’anàlisi d’un article científic. El vídeo i les notes precedents sobre l’estat actual del tema permeten entrar plenament en el treball sense destorbs i estudiar-lo amb profunditat en tots els seus aspectes. El qüestionari adjunt és una guia per fer-ho. NOTES sobre l’article: → Transfecció: introducció de DNA exogen dins d’una cèl·lula. → Expressió de Shh sota el control de citomegalovirus: El gen Shh s’expressarà sota el control constitutiu d’un promotor del virus citomegalovirus (CMV). Discussió conceptes generals i vídeo Prof. Wolper 1. Explica el mecanisme de la bandera francesa que descriu el professor Wolper en el vídeo: Aquest mecanisme es basa en atorgar a cada un dels expectadors tres targetes, cada una d’elles d’un dels tres colors de la bandera francesa (blau, blanc o vermell) i segons la seva posició en el públic ells sabran quina d’elles han d’aixecar per poder formar la bandera francesa, de manera al final es formarà aquesta. Per tant, és important la comunicació entre els individus i que sàpiguen quina és la seva posició. Es tracta d’una definició conceptual del que és un morfogen. Aquests, son capaços d’induir diferents diferenciacions en les cèl·lules depenent de la concentració en la que es trobin en el medi, ja que els morfògens es troben formant una mena de gradient. Els colors de la bandera representen les diferents concentracions del morfogen sobre les cèl·lules i com aquestes son capaces de reconèixer a quina posició s’han de col·locar. 4 2. Què vol dir en termes de desenvolupament el mecanisme de la bandera francesa? Com he explicat anteriorment, es refereix a la diferenciació de les cèl·lules de l’embrió durant el desenvolupament sota l’acció de diferents morfògens que es troben en el medi en diferents concentracions, afectant de diferent manera a les cèl·lules que es trobin en una zona amb una concentració determinada. Per exemple, les regions blaves corresponen a les cèl·lules que es troben en medis d’alta concentració de morfògens (formaran el 4t dígit), les blanques de mitja concentració (formaran el 3r dígit) i les vermelles de concentració molt reduïda o nul·la (formaran el 2n dígit). Per exemple, si en la darrera zona hi ha un increment de concentració al final, es formarà un dígit extra. 3. Què és i quina funció té la ZPA? La ZPA o zona polaritzant, és la zona d’una agrupació de cèl·lules mesenquimatoses cobertes d’ectoderm situades en la zona posterior de les extremitats que contribueixen a la formació de l’esbós de l’extremitat en l’eix antero-posterior. És la zona des d’on comença el gradient de molts morfògens i l’encarregada de definir l’assimetria dels diferents dígits de la mà. En aquest cas, es troba regulada per gens de la família Hox generalment. En cas de ser extirpada, no es generaran les estructures més proximals però si les distals. No està determinat ni en l’espècie (pollet, ratolí...) o en l’extremitat (ala, pota...). No es veu afectada per l’espècie, per l’afinitat o pels Tbx (5 anterior i 4 de posterior). 4. On es troba localitzada la ZPA? La podem trobar a la zona posterior de l’esbós de l’extremitat. 5. Qui eix defineix la ZPA? És l’encarregada de definir l’eix antero-posterior de l’extremitat. 5 6. Què és un morfogen? Un morfogen és una substància que es difon de manera no uniforme, normalment en les zones d’esbós de les extremitats i que, a causa del gradient que defineix, controla el patró del desenvolupament tissular, en particular, la diferenciació i posició de les cèl·lules mare en cèl·lules especialitzades dins d’un teixit. Per tant, les cèl·lules es diferenciaran de diferents maneres en funció de la concentració de morfògens en el medi en que es trobin. La definició del morfogen és conceptual, no química, doncs agents químics com el retinol poden actuar com a morfògens. Alguns són embrió bicoid (drosòfila). Exemples de morfògens son: l’àcid retinòic (RA), (possiblement) la Sonic Hedgehog (Shh), Transforming Growth Factor Beta (TGF-B), Bone Morphogenic Protein (BMP) i Wint-beta catenin (Wnt-B). 7. Què és i quina funció té la zona de progrés? Es tracta d’una capa de cèl·lules indiferenciades del mesoderm localitzades just a sota de la cresta ectodèrmica apical (AER), de manera que es troben en contacte amb ella. La seva funció és actuar com a una regió de senyalització per indicar el patró de les estructures que s’han de desenvolupar en l’eix pròxim-distal de l’extremitat. Les cèl·lules en aquesta zona es van definint a mesura que l’AER avança formant noves estructures; son les que donaran lloc als esbossos dels ossos i músculs de l’extremitat depenent del temps que passin en aquesta zona donaran: estructures proximals (molt poc temps) o estructures distals (molt temps). Aquestes cèl·lules ja comencen a estar diferenciades, pel que si realitzem un trasplantament ja esdevindran allò que havien sigut determinades. Si les extirpem no es desenvoluparan les estructures més proximals. 8. Quin eix defineix la zona de progrés? La zona de progrés defineix l’eix pròxim-distal. 9. Què és l’AER? L’AER és la cresta ectodèrmica apical, la part més distal en la formació de l’extremitat formada per cèl·lules epitelials columnars. Es tracta del major centre de senyalització pel que fa a la regió de l’esbós de les extremitats. Aquesta regió ve determinada per la presència de gens Hox i fels FGF que s’expressen quan es comença a formar el botó de l’extremitat. És la zona encarregada de separar la zona dorsal de la zona ventral de l’extremitat i en cas de ser extirpada, no es generaran les estructures més distals, el desenvolupament de l’extremitat s’atura per manca de senyalització del FGF-8. 6 En cas que les cèl·lules morin (per irradiació, per exemple), les cèl·lules restants intentaran repoblar aquesta zona per a seguir el desenvolupament de l’extremitat; per tant, a les parts més proximals les estructures es desenvoluparan molt poc mentre que les distals si que es desenvoluparan. Un exemple és la talidomida; que el que afecta és la irrigació de les extremitats. 10. Quin resultat tindria un empelt de la regió polaritzant d’ala de pollet a la part anterior del brot d’una pota? Es formarien els mateixos dits duplicats de manera especular de la pota. duplicaran els dígits de la pota perquè es tracta d’un morfogen que determina l’eix anteroposterior sense determinar la zona. La pota resultant presentaria el doble de dígits (de pota), en forma de mirall de la següent manera: 4-3-2-2-3-4 o 4-3-3-4. 11. Quin resultat tindria l’empelt de la regió polaritzant de l’extremitat anterior de ratolí a la part anterior del brot d’una ala de pollet? Segurament a l’ala de pollet es duplicarien els dígits del mateix pollet i quedarien de la següent manera: 4-3-2-2-3-4 o -4-3-3-4. Ja que la ZPA no ve determinada per l’espècie. Discussió article Dr. Izpisúa Belmonte 7 12. Quin és l’objectiu de l’article del Dr. Izupisúa Belmonte? Demostrar les vies per les quals la Shh coopera amb l’àcid retinòic i el receptor d’aquest (VP16hRARa) per a generar activitat similar a la de la ZPA. Aquesta cooperació dels factors seria clau en la senyalització que estableix la proliferació i diferenciació durant el desenvolupament dels vertebrats. Per tant, seria necessària per a descobrir un possible mecanisme de regulació dels morfògens que indueixen la diferenciació de les cèl·lules en aquesta zona i que defineixen, per tant, l’eix antero posterior. 13. Com actua l’àcid retinòic (RA)? Quan les cèl·lules son tractades únicament amb una expressió de Shh, aquestes no son capaces de desenvolupar activitat de ZPA. Únicament amb l’acció de l’àcid retinòic (o per defecte, la presència d’un receptor d’aquest) sobre la prèvia expressió de Shh, són capaces de desenvolupar aquesta activitat polaritzant. Podem afirmar, per tant, que l’àcid retinòic pot ser una molècula encarregada d’activar la senyalització de les Shh (induint una sobreexpressió de Shh en el marge anterior) que posteriorment poden contribuir a l’expressió dels gens HoxD. 14. Què expressen les cèl·lules VP16-hRARa? Expressen receptors humans i actius d’àcid retinòic. Aquests, per tant, si expressen Shh, rebran l’activació per part de l’àcid retinòic, fet que fomentarà l’expressió ectòpica de gens HoxD, que resultarà en la duplicació dels dígits, similars a les que resulten de ZPA. 15. Quines cèl·lules s’utilitzen? S’utilitzen cèl·lules embrionals de carcinoma (P19) que no expressen la Shh (que ens permet quantificar el nivell d’expressió de la Shh) i cèl·lules P19 incubades amb diferents concentracions de Shh (PShh3, PShh27 i PShh28), aquestes últimes presentaven nivells de Shh deu vegades superiors als trobats a les cèl·lules de la part posterior de l’esbós d’ala de pollet. 16. De quina espècie és el gen Shh que transfecten en les cèl·lules de la figura 1? És de pollet (Gallus gallus). 8 17. Per què serveix la tècnica d’anàlisi Northern? Per a detectar la presència de determinat RNA d’una certa seqüència que es troba en una mostra. El procediment consisteix en aïllar el RNA present en una mostra, aquest es fa córrer per un gel d’electroforesi de manera que les porcions més pesants queden situades a les parts superiors i les més lleugeres a la part inferior. Tot seguit es fa la transferència a una membrana carregada positivament on s’incuba amb una sonda marcada (químicament o radioactiva) per a que es doni la hibridació i així pugui ser observat. 18. Què detecta l’anàlisi Northern de la figura 1? En la figura A es pretén observar per autoradiografia, un Northern del RNA de cèl·lules de la ZPA d’un pollet en la línia 1. En les altres s’observa l’expressió del RNA en cèl·lules P19 amb diferents concentracions de Shh. Es pot observar com les cèl·lules de la ZPA del pollet presenten una línia de Shh endogen entre les línies de 18S i 28S. Les altres línies cel·lulars expressen completament el RNA de la Shh juntament amb la regió no transcrita procedent del vector d’expressió que migra amb la banda 18S. En la figura B s’observen els nivells dels transcrits de Shh de pollet a les cèl·lules P19 tant en monocapa com en agregats. Es pot observar com es manté constant després del tractament amb àcid retinòic. 19. Un agregat de cèl·lules de la mida de la ZPA es varen empeltar. A on? A la part posterior del botó on es comença a formar l’esbós de l’extremitat del pollet en etapa 19-20 dies. Tot seguit aquests embrions van ser incubats diferents temps i marcats contra els gens Shh i HoxD per a observar l’expressió d’aquests i finalment apreciar si succeïa o no la duplicació de dígits. 9 20. Quin va ser el resultat de trasplantar cèl·lules expressant Shh al marge anterior? Quan únicament es trasplantaren cèl·lules que expressaven Shh no s’obtenia molta diferència, com a molt es va obtenir un dígit extra. Quan, a més de la Shh, es trasplantaren cèl·lules incubades amb RA es va amplificar l’efecte polaritzant i es va produir la duplicació (i en alguns casos triplicació) dels dígits en forma especular o de mirall. 21. Com es va obtenir el percentatge mes elevat d’activitat polaritzant? Es va obtenir amb cèl·lules de la línia PShh on s’havia expressat el receptor d’àcid retinòic actiu VP16hRARa, en que es va aconseguir fins un 47% d’activitat polaritzant. Es va observar, per tant que al duplicació del 4 dit es corresponia amb els nivells més elevats d’activitat polaritzant. La segona amb més activitat varen ser les cèl·lules PShh incubades amb àcid retinòic que en van expressar un 40%. Les cèl·lules es varen deixar 2 dies sense incubar amb àcid retinòic ja que si a la part on es fa l’empelt s’insereix també àcid retinòic, es produirà la duplicació de l’extremitat. 22. Els embrions trasplantats es varen analitzar a través d’hibridació in situ i emprant les sondes de DNA de Shh i HoxD. Quina era la finalitat d’aquest anàlisi? Ja havia sigut demostrat que els gens Hox participaven en el procés de determinació del patró de l’extremitat i que aquests es veien activats per molècules de la regió polaritzant, segurament per Shh. La finalitat d’aquest experiment, era, per tant, observar si les diferents combinacions (Shh amb àcid retinòic, Shh sense RA i Shh amb receptors de RA) alterarien l’expressió d’aquests gens. El que es va trobar va ser que les cèl·lules amb Shh i RA o receptors de RA varen ser capaces d’expressar (ectòpicament) els gens HoxD 11 i 13, mentre que les cultivades sense RA o receptors varen expressar únicament HoxD 11. Hibridació in situ és detectar l’expressió gènica utilitzant sondes complementaries al gen que vols veure si s’està expressant, de manera que hibridarà amb les molècules de RNA. Les sondes estan marcades amb fluorescència, radioactivament, químicament... La principal diferència amb el Northern és que aquesta tècnica es fa amb el teixit. 23. Com actua la proteïna Shh? Com es processa? En aquest article es demostra com la Shh és una de les encarregades de la regulació de la generació dels dígits en les extremitats. A més a més participa en processos d’organogènesi com l’organització del cervell. Podem considerar-la un morfogen ja que, en el cas de l’extremitat, es distribueix en forma de gradient fet que provoca la correcta diferenciació de les cèl·lules en les estructures digitals. Pateix un procés post-traduccional en el que és proteolitzada en dues parts, una de 19kDa i una altre de 27kDa. 10 24. Què es detecta a la figura 3? Quina tècnica s’utilitza? En aquesta figura es detecta el processament de la proteïna Shh en diferents tipus cel·lulars. Com es pot observar, en les cèl·lules P19 no s’observa cap marca de Shh, mentre que a les altres, les incubades amb aquesta proteïna presenten dues franges comunes, una al voltant de 45kD corresponent a la proteïna de mida completa i l’altre a aproximadament 19kDa corresponent a l’extrem amino terminal de la proteïna produït després del processament post-traduccional. IMMUNOBLOT: els extractes cel·lulars que expressaven el gen Shh es van separar amb SDS- PAGE i es va fer un Westernblot. Després les Shh proteins es van detectar amb Ac anti-Shh que reconeixen l’extrem N-terminal de la proteïna. 25. Què havien descrit els autors d’aquest article anteriorment respecte als gens Hox? Ja havien confirmat en estudis anteriors que l’organització del patró que defineix l’extremitat ve regulada per l’activació seqüencial dels gens Hox, controlats per les senyals alliberades per la ZPA. El que s’intenta demostrar ara és que aquesta senyalització, ve en part determinada per una cascada en la que la proteïna Shh hi és implicada. Després es va fer la hipòtesi de que les línies cel·lulars de P19Shh, cultivades en presència o absència de RA o transfectades amb RAreceptor actiu, activarien l’expressió del gen HoxD Seminari 6. Tècniques actuals en la biologia del desenvolupament 11 1- El Dr. Yamanaka a l’article indica que hi ha tres tendències inicials per a la producció o gènesi de cèl·lules IPS, indica quines són aquestes tres tendències. La primera d’aquestes tendències era la reprogramació per transferència nuclear, en que s’implanta el nucli d’una cèl·lula somàtica en un oòcit anuclear. Quan aquesta nova cèl·lula es divideix, dona lloc a un organisme sencer, amb les característiques gèniques del progenitor del nucli de la cèl·lula somàtica implantat (clonació). La segona, el descobriment de factors de transcripció “màsters” capaços d’induir i determinar els llinatges cel·lulars de manera que qualsevol cèl·lula que s’exposi a aquests factors podrà ser des-diferenciada i tornada a diferenciar en un llinatge cel·lular diferent. Finalment, la tercera és la de recerca que inclou l’intent de creació de cèl·lules mare embrionàries (ESC) i el manteniment d’aquestes al llarg del temps mitjançant l’exposició dels cultius a factors determinats. 2- Quins investigadors van crear l’ovella Dolly? Quin any ho van publicar? Els investigadors creadors del primer clonatge d’un mamífer (ovella Dolly) a partir de la clonació de cèl·lules mamaries epitelials varen ser el grup dirigit per Ian Wilmut. L’estudi va ser publicat l’any 1997. 3- A quina revista ho van publicar i què pots dir d’aquesta revista? Es va publicar a Nature 385, una revista de gran prestigi i amb molt impacte, pel que la noticia va arribar ràpidament i àmplia al mon científic. Es tracta d’una revista multidisciplinària (política científica, crítica...). 4- Quina tendència (tècnica) van utilitzar? En aquest estudi es va fer us de la tendència de reprogramació per transferència nuclear. En aquest cas van utilitzar un oòcit i un nucli d’una cèl·lula somàtica, concretament d’epiteli mamari.