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Andreia Balhico – Biologia Celular Sebenta de Biologia Celular 1º ano 1º semestre Andreia Balhico 20/21 1 Andreia Balhico – Biologia Celular Introdução à microscopia 1. Microscopia Ótico...

Andreia Balhico – Biologia Celular Sebenta de Biologia Celular 1º ano 1º semestre Andreia Balhico 20/21 1 Andreia Balhico – Biologia Celular Introdução à microscopia 1. Microscopia Ótico O microscópio ótico é um instrumento utilizado para ampliar e observar estruturas pequenas dificilmente visíveis ou invisíveis a olho nu. Existem vários tipos de microscopia: Microscopia de fundo claro (A): Produz uma imagem relativamente pouco escura num fundo claro. A luz atravessa o objeto biológico previamente seccionado bidimensionalmente. Por norma, as preparações são coradas para permitir contraste visível e permitir a observação Microscopia de contraste de fase (B): Aumenta o contraste entre fases intracelulares, sendo usado para observar preparações vivas (não coradas). Funciona similarmente à microscopia de fundo escuro mas tem maior poder de resolução (contém mais discos opacos). As entidades surgem com um halo de contraste. Microscopia de interferência-contraste-diferencial (C) Microscopia de fundo escuro (D): Produz uma imagem clara num fundo escuro. Usa-se para visualizar preparações vivas (não coradas). Usam-se anéis (discos opacos) no condensador, que retardam ou aceleram os comprimentos de onda da luz e a conduz a pontos específicos. Utiliza- se geralmente para observação de bactérias e outras entidades pequenas, que surgem como pontos brilhantes sobre um fundo escuro. Existem vários fatores que podem influenciar a resolução do microscópio, nomeadamente a luz. 2 Andreia Balhico – Biologia Celular 2. Microscopia de florescência Na microscopia de florescência são utilizados os Fluoróforos, que são moléculas que absorvem um determinado comprimento de onde e emitem a sua energia num comprimento de onda ainda maior. Este fluoróforo vai ser excitado por um laser de excitação, de modo a ativá-lo num determinado comprimento de onda. De seguida existe um laser de emissão que irá recolher a luz emitida por esta molécula, permitindo a observação das proteínas às quais esta se liga. Existem duas hipóteses para conseguirmos observar determinadas proteínas. A primeira seria a ligação de um fluoróforo a um anticorpo específico (anticorpo primário) que por sua vez se liga a uma determinada proteína, que representa um organelo particular. Contudo o que ocorre é a ligação entre o fluoróforo com um anticorpo secundário (não específico) que de seguida se irá ligar a um anticorpo primário. Esta hipótese é mais vantajosa porque a um anticorpo primário podem- se ligar diversos corpos secundários. Não devem ser usados fluoróforos com comprimentos de onda aproximados, pois a sua cor assim será semelhante. Existem espécies que conseguem produzir os seus próprios anticorpos, como por exemplo, os ratos ou ratazanas. A escola do anticorpo secundário depende da origem do anticorpo primário, se o anticorpo primário for originado por um rato é necessário que o anticorpo secundário seja “anti-rato” Para este procedimento as células têm de ser fixadas e preparadas, o que lhes provoca a morte. Se quisermos observar uma ação celular, é necessário que estas estejam vivas, então podemos utilizar um “fluoróforo” de origem natural, como o das alforrecas (ou outros animais e microalgas com bioflorescência) que se irá ligar à proteína de interesse. 3. Microscopia eletrónica Existem dois tipos de microscopia eletrónica, a microscopia de transmissão-TEM (Secções bidimensionais atravessadas pela luz. Para observar o interior de certas estruturas. Os eletrões passam a preparação na 3 Andreia Balhico – Biologia Celular perpendicular) e a microscopia de varrimento-SEM (Imagens tridimensionais com grande resolução. Usa-se para observar o exterior das células e o seu relevo, por exemplo) O microscópio eletrónico difere do microscópio ótico pois utiliza um feixe de eletrões em vez de um feixe de luz. Centrifugação diferencial A centrifugação diferencial consiste na separação dos constituintes celulares, de diferente densidade, através da força de centrifugação. Sendo o núcleo o constituinte mais denso. Biomoléculas Proteínas 4 Andreia Balhico – Biologia Celular As proteínas podem desempenhar diversas funções, como estrutural (membranas celulares), enzimática, transporte (hemoglobina), motora (proteínas contrateis nos músculos), hormonal (insulina) e imunológica (anticorpos). A sua unidade estrutural é o aminoácido (monómero) e o tipo de ligação é peptídica. Os aminoácidos são constituídos por um grupo de amina e um grupo de carboxilo. Os oligopéptidos são constituídos por 2 a 20 aminoácidos e os polipéptidos são constituídos por mais de vinte aminoácidos. Uma proteína é uma ou mais cadeias polipeptídicas e apresenta uma estrutura tridimensional definida. Estas moléculas apresentam vários níveis de organização. Níveis de organização: A estrutura primária corresponde à sequência linear de resíduos de aminoácidos da cadeia polipeptídica. A estrutura secundária corresponde a cadeias da estrutura primária dispostas paralelamente ligadas por pontes de hidrogénio, ou então, cadeias peptídicas enroladas em hélice devido à ligação por pontes de hidrogénio entre grupos de amina e carboxílico de aminoácidos diferentes. A estrutura terciária corresponde a uma estrutura secundária dobrada e com uma forma globular. As proteínas nesta estrutura podem ter podem ter domínios globulares (associação de folhas betas pregueadas) e domínio fibroso (associação de hélices alfa) Ligações persulfato/dissulfato (ligações covalentes): Ligação entre dois átomos de enxofre entre aminoácidos que formam a estrutura terciária. Algumas proteínas podem desmaturar e voltar a maturar, mas apenas algumas o conseguem fazer. As proteínas chaperonas ajudam no enrolamento da estrutura terciária, estas necessitam de ATP para, por hidrolise, receberem energia para se enrolarem. A estrutura quaternária corresponde a cadeias globulares com ligações entre si. Os seus componentes podem ser todos iguais entre si (homo-oligomérico) ou diferentes (heterooligomérico) Glícidos (hidratos de carbono) A maior parte dos alimentos que consumimos possuem, na sua constituição, hidratos de carbono, que são classificados de acordo com a sua estrutura química. Estes são compostos terciários, formados por Carbono, Hidrogénio e Oxigénio. Os monómeros são as “oses” (monossacarídeos) e a ligação é a glicosídica. Aldoses: grupo aldeído Glicolípidos: glícidos + lípidos Cetoses: grupo cetónico Glicoproteínas: glícidos + proteínas 5 Andreia Balhico – Biologia Celular Alguns lípidos são excelentes reservas de energia, tais como o amido (reserva energética de plantas), glicogénico (reserva energética de animais) e a celulose (estrutura da parede celular). Todos estes são constituídos por glicose, sendo apenas as ligações que os tornam substâncias diferentes. A glicose e a frutose são Isómeros (fórmula química igual, mas fórmula estrutural diferente). Os polissacáridos são insolúveis em água. Lípidos Os lípidos são compostos orgânicos que são caracterizados pela sua insolubilidade em água e solubilidade em solventes orgânicos (clorofórmio, benzeno e éter). São compostos ternários compostos por C, H e O, podendo integrar também fósforo e azoto. Têm uma ligação designada Éster, que liga o ácido gordo à cadeia hidrocarbonatada Estes possuem diversas funções, como estrutural (fosfolipídios), reserva (glicerol e ácidos gordos), reguladora (hormonas esteroides), transporte e energética (armazenamento de energia no tecido adiposo). Os triglicéridos são três ácidos gordos mais glicerol. Os fosfolípidos constituem a membrana das células, sendo estes uma molécula de glicerol, com dois ácidos gordos e um grupo de fosfato. Possuem a parte da cabeça, que é composta pelo glicerol e o grupo de fosfato, sendo esta polar e hidrofílico. A sua cauda é composta por carbono e ácido gordo, sendo esta apolar e hidrofóbica. Estes são uma molécula anfipática (possuem uma parte hidrofóbica e hidrofílica) As cadeias hidrocarbonatada (cauda) são insolúveis em água. As suas nuvens eletrónicas são apolares, sendo, portanto, estáveis, não necessitando de encontrar estabilidade nos átomos da molécula de água. Já a parte da cabeça é polar e encontra estabilidade eletrónica na molécula de H20, dissolvendo-se. Ácidos nucleicos (DNA e RNA) Resumidamente, existem no grupo dos ácidos nucleicos, o DNA e o RNA. São constituídos pelo grupo fosfato, uma pentose e bases azotadas. A ligação entre um grupo fosfato de um nucleótido e a pentose do nucleótido anterior é denominada fosfodiéster. No DNA, a pentose é a desoxirribose e no RNA, é a ribose. No DNA, as bases azotadas são a adenina, citosina, guanina e timina, e no RNA, são as mesmas, só que a timina é substituída pelo Uracilo. A adenina liga à timina/ uracilo (ligação dupla) e a citosina liga à guanina (ligação tripla). As bases azotadas podem ser de dois tipos, as de anel duplo são bases púricas ou purinas (adenina e guanina) enquanto que as bases de anel simples são bases pirimídicas ou pirimidinas (timina e citosina) Os nucleótidos têm designações consoante a base azotada que os compõem. Por reações de polimerização, os nucleótidos ligam-se sequencialmente e formam uma cadeia polinucleotídica. Célula procariótica- bactérias 6 Andreia Balhico – Biologia Celular A análise da sequência de DNA de procariontes revelou dois tipos distintos: Eubactérias e Archaebactérias. Assumindo que organismos com genes semelhantes evoluem a partir de um ancestral comum, foi elaborada uma árvore filogenética. As bactérias são seres procariontes, possuem uma cápsula, membrana plasmática, parede celular, flagelos, pili ou fímbrias, ribossomas, endósporos e nucleoide. Estas podem ser arqueobactérias, que vivem em ambientes extremos, podendo remeter a um ambiente ancestral com altas concentrações de sal, temperaturas elevadas e ambientes sem oxigénio. As eubactérias podem ser gram-positivas ou gram-negativas. Existem bactérias que vivem no nosso organismo e são essenciais, podendo ser consideradas bactérias “boas”, enquanto que os agentes patogénicos são considerados as bactérias “más”. Forma das bactérias As bactérias podem possuir diversas formas, tais como: Forma esférica Forma alongada ou bastonete Forma espirulada Forma espiroquetas Nota: É possível fazer a distinção de uma bactéria com forma filamentosa e um vírus com a mesma pelo seu tamanho Forma hifa Uma colónia é um conjunto de bactérias que se origina de uma só, a bactéria-mãe Forma filamentosa Em meios de cultura é possível, pelo seu aspeto, identificar o tipo de bactéria. Tipo de eubactérias 7 Andreia Balhico – Biologia Celular Existem dois tipos de eubactérias, as gram-positivas e as gram-negativas. Parede celular A parede celular confere rigidez, protege contra a fagocitose e pressão osmótica, impedindo a lise celular. Bactérias Parasitas intracelulares: Este tipo de bactérias não possui parede celular, reproduzem-se e procuram proteção contra células que as possam fagocitar. A E-coli é uma bactéria que vive no intestino humano (parasita mutualista) e que facilita a digestão. Gram-positivas Gram-negativas A parede celular deste tipo de bactérias é formada A parede celular deste tipo de bactérias é formada por uma camada espessa de peptidoglicano, uma por apenas 10% de peptidoglicano e tem uma camada pequena percentagem de outro tipo de proteínas e externa de bicamada fosfolipídica, algumas proteínas ácidos teicoicos (são agentes quelantes que atraem iões (como as aquaporinas) e lipopolissacarídeos (LPS). Tem positivos, o que aumenta a rigidez da camada) Não tem um espaço periplasmático e possui exotoxinas. exotoxinas. O peptidoglicano é um heteropolímero com unidades de repetição, dois aminoaçucares e quatro aminoácidos. Ligam-se através de ligações peptídicas e podem-no fazer de forma direta ou indireta (com glicina no meio). Uma enzima presente na saliva pode quebrar a ligação glicosídica entre os aminoaçucares e por isso é possível afirmar que a saliva numa ferida pode ajudar minimamente à sua limpeza. As bactérias gram-positivas são sensíveis à penicilina e às sulfamidas, pois este antibiótico interfere com a formação de peptidoglicano A coloração gram possibilita distinguir estes dois tipos de bactérias devido às suas diferenças da parede celular. No procedimento 3 as bactérias gram-negativas ficam incolores com a adição de álcool devido à presença de fosfolípidos na membrana 8 Andreia Balhico – Biologia Celular externa, que se dissolve e permite que o corante saia. Para poderem ser observáveis faz-se uma contra coloração com a pigmentação rosa. Cápsula A cápsula tem polissacarídeos e serve para dificultar a entrada de antibióticos e caso as bactérias não a possuíssem podiam ser mais rapidamente identificadas pelos glóbulos brancos, logo torna-as mais patogénicas. Está relacionada com a virulência da bactéria, uma vez que a cápsula confere resistência à fagocitose Flagelo O flagelo confere mobilidade, estes podem ser polares, ou seja, apenas se localizam numa determinada região, ou localizam-se ao longo da bactéria. Contudo estes flagelos são diferentes das células eucarióticas. Fímbrias ou Pili Estruturas proteicas que ajudam na adesão a outras bactérias ou ao substrato. Nem todas as bactérias têm. A pili é uma fímbria especial que troca DNA entre duas bactérias compatíveis, muito poucas a possuem. Material genético As bactérias possuem um DNA circular, plasmídeo e cromossomas extra condensados., estes não são tão complexos como o das células eucarióticas. Os seus ribossomas realizam a síntese proteica. Endósporos Certas espécies de bactérias têm a capacidade de formar endósporos, altamente resistentes ao calor, dessecação e outros agentes físicos e químicos, capaz de permanecer em estado latente por longos períodos e de germinar, dando início a uma nova célula vegetativa. Tal facto permite que a célula sobreviva em condições desfavoráveis. A esporulação tem início quando os nutrientes bacterianos se tornam escassos, geralmente pela falta de fontes de carbono e azoto. Os Endósporos são estruturas dormentes (latentes), duras e não- reprodutivas, produzidos por um pequeno número de bactérias. Conferem resistência perante condições adversas (falta de água ou nutrientes). O endósporo germina se houver humidade e é extremamente resistente. Dada a sua resistência, tornam-se um problema de saúde pública. 9 Andreia Balhico – Biologia Celular Reprodução bacteriana Existem três tipos de reprodução bacteriana: por transformação, por transdução ou por conjugação. Todos estes processos podem conferir vantagens às novas células formadas, devido à recombinação genética que pode ocorre. Estas podem-se tornar resistentes a antibióticos, radiação ou outros fármacos. Transformação Quando uma bactérica se reproduz por transformação, esta capta moléculas DNA, que estão dispersas no meio, da célula dadora. Este DNA pode permanecer extracromossomal nada acontece na célula, sendo posteriormente destruído no citoplasma, contudo se houver a sua integração há a transformação do genoma e a adição de nova informação, podendo ser vantajoso (resistência a antibióticos, radiação ou outros fármacos). Raramente acontece a toxicidade da célula. Antigamente a insulina era extraída do pâncreas suíno, o que poderia provocar reações alérgicas ao ser administrada em humanos. Atualmente é possível produzir insulina através do gene humano, através da sua inserção num plasmídeo que por sua vez vai entrar na parede celular, através de esporos, de uma bactéria (sem que haja a sua destruição) e dá-se a sua reprodução desta proteína recombinante. Transdução A transdução é a transferência indireta de segmentos da molécula de DNA de uma bactéria (dadora) para outra (recetora) através de um vírus bacteriano (bacteriófago ou fago) Pode ser generalizada, qualquer fragmento de DNA ou especializada (determinados genes, passados por determinados fagos) 10 Andreia Balhico – Biologia Celular Uma bactéria é contaminada por um bacteriófago e dá-se a formação novas partículas virais, RNA e novas proteínas. O bacteriófago reproduz-se o que faz aumentar o volume da célula, acabando esta por morrer. Sendo que este vírus já possui a informação genética da célula anterior, quando se “apoderar” de uma nova, irá ocorrer a recombinação do DNA de uma bactéria com o cromossoma da outra. Ainda pode ocorrer o processo de crossing-over onde existe a troca entre a informação genética do fago, que já tinha infetado uma bactéria antes (dadora), e da bactéria recetora. O que acaba por acontecer é que a bactéria recetora não irá possuir nem os mesmos genes da dadora nem os seus próprios genes, havendo assim uma combinação dos dois. Conjugação Duas bactérias unem-.se temporariamente através de uma pili, onde a célula dadora duplica o seu plasmídeo (pedaços de DNA dispersos no citoplasma) passando- o para a célula recetora. Os seus cromossomas não são iguais, apesar dos plasmídeos o serem. A célula dadora possui o DNA que será transferido para a recetora, e nesta pode ocorrer recombinação genética entre o cromossoma e o fragmento de DNA recebido. 11 Andreia Balhico – Biologia Celular Membranas biológicas A estrutura básica da membrana é uma dupla camada de fosfolípidos, que é uma barreira impermeável à passagem da maioria das moléculas solúveis na água. Existem também proteínas com funções bastantes especificas, tais como: transporte, catalizar enzimas com reações referentes à membrana, estrutural e receção e passagem de sinais químicos. Os glícidos que a constituem podem estar associados a proteínas, passando a glicoproteínas, ou a lípidos, sendo glicolípidos. A membrana citoplasmática possui uma bicamada fosfolipídica, com as cabeças polares viradas para o exterior e as caudas viradas umas para as outras, esta também tem proteínas intrínsecas que se ligam às zonas hidrofóbicas dos lípidos, podendo ou não serem membranares. O outro tipo de proteínas são as periféricas, que possuem uma ligação fraca às zonas hidrofílicas dos lípidos ou de proteínas integradas. HÁ também glicoproteínas, na parte mais externa da membrana e glicolípidos na parte interna – MODELO MOSAICO FLUÍDO Lipídios na membrana-Fosfolípidos Há vários tipos de fosfolípidos, dependendo do grupo químico que se liga ao grupo de fosfato. A sua cauda é apolar e a cabeça polar. A membrana possui fluidez devido aos movimentos dos fosfolípidos. Estes têm um movimento de flexão e rotação sobre si mesmos, e um movimento de flip-flop onde ocorre a sua passagem de uma monocamada da membrana para a outra. 12 Andreia Balhico – Biologia Celular Os fosfolípidos conferem impermeabilidade à membrana, funcionando como uma barreira que não permite a difusão de moléculas Nota: A fosfotidilcolina a espessura é solúveis em água, e estabilidade devido à interação das duas menor pois quando esta está ligada a monocamadas que dão origem à bicamada fosfolipídica. colesterol há o alongamento da cauda dos fosfolípidos. A esfingomielina torna a camada De acordo com o tipo de fosfolípido que constitui a membrana mais espessa e a sua associação ao colesterol plasmática, esta pode ter uma maior ou menos espessura, e possuir ou não muda nada. Por fim, a não uma curvatura. fosfatidiletanolamina é responsável pela curvatura da membrana. Proteínas na membrana Existem vários tipos de proteínas nas membranas. As proteínas intrínsecas são as que atravessam totalmente ou parcialmente a camada de fosfolípidos. Interagem com as caudas hidrofóbicas dos fosfolípidos, possuem regiões hidrofílicas que se expõem de ambos os lados da membrana. As porções que se inserem na membrana são normalmente hélices alfa que têm de ser hidrofóbicas e estão fixas na membrana. As proteínas transmembranares dividem-se em três zonas: domínio luminar (extracelular), domínio citoplasmático (intracelular) e domínio transmembranar. As porinas são uma exceção à estrutura típica das proteínas transmembranares em hélice alfa, estas formam canais aquosos nas membranas externas das bactérias e atravessam-nas com conjuntos de folhas beta pregueadas. Os aminoácidos hidrofóbicos das folhas beta interagem com o interior da membrana. 13 Andreia Balhico – Biologia Celular As proteínas periféricas não interagem com o centro hidrofóbico da bicamada, dissociam-se facilmente da membrana celular, uma vez que não se encontram inseridas no interior da camada. Estas interagem indiretamente com a membrana, através de proteínas intrínsecas ou diretamente através das cabeças polares dos fosfolípidos. Podem-se encontrar na face citosólica ou exoplasmática. Na imagem podemos observar algumas proteínas periféricas, como por exemplo, as proteínas B que são responsáveis pela adesão de uma célula à outra, ou as que se encontram entre a célula e a lamina basal, tendo a função de as unir também. Os glícidos podem estar associados a proteínas, chamando-se glicoproteínas, sendo que estas só se encontram na parte externa da membrana. Grande parte das proteínas membranares estão glicosíladas. Existe ainda uma enzima (que se encontram no lúmen do reticulo endoplasmático) responsável pela produção de glicolípidos, encontrando-se estes na parte interna da membrana. A glicocálice só existe em algumas células, é um composto de glicoproteínas ou glicolípidos, tendo uma grande quantidade de proteínas glicosíladas. Encontra-se na superfície externa da membrana citoplasmática e é responsável pelo reconhecimento e comunicação das células com o exterior. Atraí a água, deixando a membrana hidratada porque possui hidratos de carbono e protege as células de agressões físicas e químicas. Esta também retém nutrientes e enzimas. E confere uma viscosidade à célula. Os oligossacarídeos que constituem a glicocálice são responsáveis pelo reconhecimento e adesão celular e são antigénios dos grupos sanguíneos. 14 Andreia Balhico – Biologia Celular Por exemplo, no intestino a glicocálice facilita a passagem do bolo alimentar e a absorção. No espermatozoide e óvulo, desempenha um papel de reconhecimento. Os linfócitos também a possuem, o que facilita a sua mobilidade e de outras células Colesterol na membrana O colesterol é o esterol principal no tecido dos animais e caracteriza-se pelo grupo hidróxido num dos anéis. Este aumenta a rigidez da membrana, facilitando as dobras. Também é responsável pela diminuição da permeabilidade da membrana e com temperaturas baixas, impede as cadeias de hidrocarbonatos de se juntarem e poderem cristalizar e ainda provoca compressões na membrana devido à sua distribuição pelas duas camadas da membrana (movimentos flip-flop) Nota: Os antifúngicos atuam no egosterol, um tipo específico de “estrol”, de modo a não poderem atuar no colesterol que está presente nas células do ser humano, não sendo prejudicial para as mesmas. Fluidez da membrana A fluidez da membrana é o movimento lateral a que os fosfolípidos e proteínas estão sujeitos ao lo ngo do plano de cada uma das monocamadas Existem vários fatores que afetam a sua fluidez, tais como: o tamanho da cauda dos fosfolípidos, que quanto maior for menor a fluidez. A saturação de hidrocarbonetos também é importante, pois quanto mais insaturados forem os fosfolípidos (ácidos gordos), maior o afastamento (mais curvaturas) e maior a fluidez. O colesterol, apesar de diminuir a fluidez da membrana, consegue inibir a mudança de fase sólida a líquida, neste caso, pela posição que ocupa entre os fosfolípidos, impedindo a sua junção. O aumento de temperatura aumenta a fluidez, pois quando a temperatura é menor ocorre a cristalização. 15 Andreia Balhico – Biologia Celular Movimentos Transmembranares Permeabilidade, G. concentração e G. eletroquímico A bicamada fosfolipídica é impermeável à maioria das moléculas polares, devido às caudas dos fosfolípidos que são hidrofóbicas, pelo que impedem a saída da maioria do conteúdo celular solúvel em água. As células têm a necessidade de criar mecanismos de transferência de moléculas solúveis em água através das suas membranas. Quanto menos o tamanho, menor a capacidade de estabelecer ligações de hidrogénio com água, logo mais rapidamente a molécula se difunde através da membrana. Pelo esquema à esquerda percebemos que a água, os gases, o etanol e os lípidos atravessam a membrana livremente. Contudo, os iões, as moléculas carregadas e as moléculas grandes neutras (como a glicose, os aminoácidos e os nucleótidos) não atravessam livremente a membrana. O transporte tem como objetivos a ingestão de nutrientes, a excreção de produtos do metabolismo e a regulação de concentrações iónicas intracelulares. Pelo esquema à direita percebemos que as bicamadas lipídicas são altamente impermeáveis a moléculas carregadas, independentemente do seu tamanho. As moléculas polares e moléculas grandes têm dificuldade em passar, e as moléculas lipossolúveis, como a vitamina E, passam. A bicamada é mais permeável à água do que ao Na+, K+ e Cl-. 16 Andreia Balhico – Biologia Celular A membrana apresenta elevadas concentrações de Na+ no seu meio extracelular, e baixas concentrações de K+. No seu meio intracelular, apresenta maiores concentrações de K+ e menos de Na+. Isto faz com que a carga elétrica da sua superfície interna seja negativa, enquanto a da superfície externa é positiva Devido à permeabilidade da membrana a estes compostos, é possível criarem-se diferentes tipos de potenciais, pois a diferença de potencial de membrana depende de haver passagem de iões através de canais e das concentrações dos dois lados da membrana Com a passagem de iões, criam-se nos meios potenciais de ação constantes. Assim, se os dois lados da membrana tiverem concentrações diferentes e um canal de passagem através dessa, gerar-se-á uma corrente elétrica dependente das concentrações. O potencial está dependente dos movimentos de iões K+ e Na+ Estas concentrações, na parte interna e externa da membrana. Designam-se por gradiente de concentração. O gradiente eletroquímico combina o potencial de membrana e o gradiente de concentração, pode atuar para aumentar a força de transporte de um ião através da membrana, ou dificultar a sua entrada. Como o K é positivo, a tendência elétrica seria entrar porque o interior da membrana é negativo. No entanto há mais K no exterior, então em termos de concentração, tendência química, será sair Basicamente, o gradiente químico (concentração) tem a ver com as diferenças de concentrações dos iões dentro e fora da membrana E o elétrico (potencial) com a diferença entre cargas junto à membrana, ou seja, se o interior da célula está maioritariamente negativo ou positivo como está na imagem Proteínas transportadoras Transporte passivo. São proteínas que formam canais cheios de água, o que cria um poro através da bicamada pelo qual passam iões específicos. São canais de repouso que dependem da voltagem, ligando e são ativados pelo stress mecânico. 17 Andreia Balhico – Biologia Celular 1.Canais iónicos Estes são específicos para a entrada e saída de iões e são proteínas com estrutura em hélice alfa. Existem diversos tipos: canais de repouso, canais dependentes de voltagem, canais dependentes de ligandos e canais ativados por stress mecânico. Os canais de repouso estão geralmente abertos e permitem a movimentação livre de iões, como o potássio Os canais dependentes de voltagem abrem apenas quando a membrana é despolarizada. Neste a hélice alfa, que tem uma carga positiva, está virada para o interior da membrana. Quando ocorre a despolarização, esta vira- se para o exterior da membrana (devido ao seu potencial), permitindo com que haja ainda mais a abertura dos cabais de sódio 18 Andreia Balhico – Biologia Celular Os canais dependentes de ligandos abrem quando uma certa molécula se liga à proteína. Os canais ativados por stress mecânico são abertos devido a forças ou pressão. 2.Bombas de ATP (ATPases) Existem vários tipos de bombas de ATP: Bombas do tipo P: Proteínas transmembranares que se auto-fosforilam durante o processo de transporte. Por exemplo, bombas responsáveis pela manutenção de gradientes iónicos através das membranas (Na + K+ H+ e Ca+) Bombas do: tipo F: Proteínas que funcionam como turbinas e são geralmente constituídas por várias subunidades. Diferem estruturalmente das bombas P e são encontradas na membrana plasmática das bactérias (respiração oxidativa) e nos tilacoides dos cloroplastos (fotossíntese). São frequentemente designadas por ATP sintases porque podem reverter o processo de hidrolise do ATP pelo da sua síntese. Bombas do tipo V: Relacionadas com as do tipo F e do ponto de vista estrutural são os transportadores deste tipo que geralmente transportam hidrogénio- Por exemplo, nos lisossomas, nas vesiculas sinápticas e nos vacúolos. Transportadores ABC: Bombeiam pequenas moléculas através das membranas ao contrário dos tipos anteriores que só transportam iões. 19 Andreia Balhico – Biologia Celular As bombas de cálcio estão presentes nas células musculares e estão relacionadas com a contração. É um transporte ativo rápido, contra o gradiente de concentração e com consumo de ATP Na imagem podemos observar que: 1. O cálcio e o ATP ligam-se 2. Dá-se a fosforilação do ATP 3. Mudança de conformação da proteína 4. O ião Ca2+ é libertado 5. A bomba é desfosforilada 6. Retoma ao início A bomba de sódio-potássio é responsável pela entrada de dois iões K+ e saída de 3 iões Na+. Está sempre em funcionamento, nunca atingindo o seu equilíbrio. A concentração de Na+ é superior no exterior e a de K+ no interior. Na imagem podemos observar que: 1. O Na+ e o ATP ligam-se 2. Dá-se a fosforilação do ATP 3. Mudança de conformação da proteína 4. Saída de Na+ e ligação do mesmo 5. A bomba é desfosforilada 6. Retoma ao inicio 20 Andreia Balhico – Biologia Celular 3.Canais aquosos A água não atravessa as membranas plasmáticas (caudas hidrofóbicas). A pressão osmótica é a força que é exercida para impedir que a água passe de um lado para o outro. Exemplo: O soro fisiológico é uma solução isotónica, daí não se sentir ardor em contacto com as feridas. Tipos de transportes Membranares 1.Endocitose e Exocitose Entre os diversos transportes temos a Endocitose, que pode realizar-se de três formas: Fagocitose: A membrana plasmática engloba grandes quantidade de matéria através dos pseudópodes (prolongamentos da membrana). Forma-se uma vesicula fagocítica, que se funde com os lisossomas e forma os vacúolos digestivos. Os nutrientes passam para a célula e as excreções saem através da exocitose. Pinocitose: A membrana plasmática engloba substâncias dissolvidas ou fluidos Endocitose mediada por recetores: As macromoléculas entram na célula ligadas à membrana das vesiculas de endocitose. 21 Andreia Balhico – Biologia Celular 2.Difusão Simples É um transporte não mediado, porque não requer a intervenção de moléculas transportadoras. Não requer gasto de energia O movimento do soluto dá-se do meio hipertónico para o meio hipotónico O movimento é a favor do gradiente de concentração Transporte de pequenas moléculas apolares (lipossolúveis) e iões Não saturável Não especifica 3.Difusão Facilitada (Uniporte) O movimento do soluto dá-se do meio hipertónico para o meio hipotónico O movimento ocorre através de proteínas transportadoras- permeases Não requer o gasto de energia É mais rápida do que a difusão simples Saturável Passivo e específico São proteínas que transportam de forma especifica moléculas no sentido do gradiente de concentração Transportam um único soluto Existem transportadores específicos para determinadas moléculas A maioria é unidimensional A molécula entra em contacto com a proteína e esta muda a sua conformação Como estas moléculas são especificas, a velocidade é maior Algumas são reversíveis e por isso têm dois centros ativos (glut-2) 4.Transporte ativo O movimento do soluto dá-se do meio hipotónico para o meio hipertónico O movimento é contra o gradiente de concentração Pode ocorrer com gasto, ou não, de energia O transporte requer a intervenção de ATPases, proteínas transportadoras que funcionam devido ao ATP, ou através das bombas de sódio e potássio, com a saída de 3 iões Na+ e entrada de 2 iões k+ Específico 22 Andreia Balhico – Biologia Celular 5.Co-transporte/Transporte acoplado Este transporte consiste em transportar uma molécula para dentro ou para fora da célula contra o gradiente de concentração, usando proteínas especificas e o gradiente eletroquímico de outra molécula, em vez de ATP. Simporte: As moléculas são transportadas no mesmo sentido, uma a favor e outra contra o gradiente de concentração. Ou saem as duas, ou entram as duas. Por exemplo, a glicose e Na+ na membrana apical do intestino. A ligação do Na+ e da glucose é cooperativa. A ligação de qualquer um dos ligandos induz a uma alteração conformacional que aumenta a afinidade da proteína para o outro ligando. No intestino ocorre simporte de sódio e glicose. A bomba sódio -potássio retira o sódio e a glicose sai da célula como consequência (ocorre em ambos os sentidos). Antiporte: Duas moléculas são transportadas em sentidos opostos, uma a favor e outra contra o gradiente de concentração. Uma sai e outra entra. Por exemplo, Ca2+ e Na2+ nas células cardíacas. 23 Andreia Balhico – Biologia Celular No estomago, a produção do pH (aumento da acidez gástrica). Ocorre antiporte de Cl- e de HCO3-. O Cl- entra a favor do gradiente de concentração. A molécula de CO2 retira o OH-. O Cl- passa para a molécula e entra H+, com saída de K +. A célula fica com o mesmo gradiente. No quadro seguinte está um resumo dos tipos de transportes. A célula nervosa Estrutura A unidade do sistema nervoso é a célula nervosa, o neurónio. Os neuronios são células estimulaveis, capazes de detetar pequenas alterações no meio. Em resposta a estas alterações verifica-se uma alteração elétrica, que percorre a sua membrana, o impulso nervoso. Os neuronios apresentam um corpo celular e dois tipos de prolongamentos citoplasmaticos: a dentrite e o axónio. As dentriste são prolongamentos finos e ramificados qye recebem e conduzem os estimulos provenientes do ambiente ou de células nervosas até ao corpo. O axónio é uma fibra fina e longa cuja função é transmitir o impulso nervoso proveniente do corpo celular. O corpo celular é constituido por canais iónicos ativados por stress mecanico e canais dependentes do ligando. O axónio, por canais dependentes da voltagem de sódio e o terminal do axónio canais dependentes da volagem de cálcio. Os neuronios multipolares possuem mais de dois prolongamentos, vérias dentrites e um axónio. Os neuronios motores conduzem o impulso nervoso para os musculos e glandulas do corpo. Estes possuem uma estrutura diferente. 24 Andreia Balhico – Biologia Celular Transmissão do impulso nervoso O potencial de repouso ocorre quando o neurónio não está a transmitir impulso nervoso. Existe uma diferença de concentração entre o sódio e o potássio. Durante a despolarização, os canais de sódio dependentes da voltagem, abrem-se o que faz com que este entre na célula. Os canais de sódio abrem-se devido ao movimento da hélice alfa (explicado anteriormente). Altera-se a polarização da membrana e a despolarização só termina quando uma proteina inativa os canais de sódio. A repolarização ocorre devido à abertura dos canais de potássio, dando-se a sua saída do meio intracelular da célula. Há assim uma queda no potencial da membrana até que atinja o seu potencial de repouso novamente. Os neurónios recebem e transmitem estímulos, através de canais iónicos. O corpo celular recebe o estímulo de outros neurónios/do meio externo/mecânico. O interior do neurónio é negativo, tendo uma maior concentração de K+ e o exterior é positivo, tendo uma maior concentração de Na+. Assim temos uma diferença de potencial de - 70 mV. O sinal começa com a entrada de um ião positivo, Na+ neste caso, que se espalha, formando uma corrente local de sódio e deslizando junto á membrana que despolariza. Há um limiar abaixo do qual não ocorre impulso nervoso. A corrente local de Na+ no corpo celular vai chegar ao axónio, provocando a diferença de potencial necessária á abertura dos canais de voltagem de sódio. Aos + 35 mV o canal de sódio bloqueia e o canal de potássio abre para este sair. Assim o impulso nervoso é unidirecional, nunca voltando para trás, uma vez que o canal de sódio fecha. Quando o impulso nervoso passa, o neurónio repolariza com a entrada de potássio e a saída de sódio através da bomba Na+/K+. Pode ocorrer a hiperpolarização se houver muita saída de potássio da célula. 25 Andreia Balhico – Biologia Celular Passagem unidirecional A passagem do impulso nervoso é unidirecional por causa das propriedades dos canais de sódio dependentes de voltagem. Após a repolarização estes canais ficam inativos devido à ligação de uma proteína, o que não permite ao impulso voltar atrás, tendo de continuar na mesma direção, porque aí os canais estão abertos devido à despolarização. Mielinização Nos neurónios motores, o axónio está revestido por uma bainha de mielina. É garantida uma rápida propagação do impulso nervoso, porque o potencial de ação despolariza a membrana do axónio unicamente na região dos nós de Ranvier (locais onde não há mielina). Desta forma, o impulso nervoso salta de nó para nó, havendo uma maior velocidade de propagação em relação aos neurónios desmielinizados. Caso a distância entre os nós seja muito grande, mas os iões conseguem passar de nó em nó, pode dar- se apenas a diminuição da velocidade de propagação do impulso nervos. Contudo, se esta distância for grande o suficiente para que estes não consigam passar, a transmissão do impulso nervoso para. 26 Andreia Balhico – Biologia Celular Sinal elétrico >>> Sinal químico As terminações dos axónios estabelecem ligações com as dentrites dos neurónios seguintes. A passagem de um impulso nervoso faz-se através das sinapses. A fenda sináptica é o pequeno espaço entre membranas celulares. A passagem de neurotransmissores nas vesiculas pré-sinápticas ativa o neurónio seguinte. 1. Conversão de um sinal elétrico num sinal químico 2. Conversão de um sinal químico em elétrico (terminal nervoso) (numa sinapse) Na sinapse entra Ca2+, o neurotransmissor sai por exocitose, o H+ entra na vesícula e o ATP é hidrolisado a ADP para o funcionamento da bomba de H+. No transporte acoplado, entra o neurotransmissor no citoplasma em simporte com o Na+ e depois o neurotransmissor que está no citoplasma entra na vesícula em antiporte com o H+ 27 Andreia Balhico – Biologia Celular No esquema observamos que, para uma vesicula funcionar, é necessária uma bomba de hidrogénio, que usa o ATP para o bombear para o interior da célula, o que aumenta o gradiente de concentração. Com este aumento, há a saída de hidrogénio da célula e um neurotransmissor entra para a vesicula. Esta vesicula funde-se com a membrana, graças a proteínas Vsnare (da vesicula) e Psnare (da membrana). Devido à abertura do canal de cálcio, há a possibilidade de o neurotransmissor ser “solto” para o interior da célula. Citoesqueleto O citoesqueleto se estende pela célula e está ligado à membrana plasmática e aos organelos internos, fornecendo assim uma estrutura para organização celular, podendo ser bastante dinâmico e os seus componentes são capazes de se reorganizarem. O citoesqueleto é composto por três sistemas de filamentos principais: Microfilamentos: São polímeros da proteína actina organizados em feixes funcionais e em redes. São especialmente importantes na organização da membrana plasmática, dando forma a estruturas da superfície como as microvilosidades. Estes podem servir como ponte para as proteínas motoras miosina ativadas por ATP, responsáveis pela função contrátil ou transporte de carga ao longo dos microfilamentos. Microtúbulos: São tubos longos formados pela proteína tubulina e são organizados por proteínas associadas aos microtúbulos. Eles muitas vezes se estendem pela célula, compondo uma estrutura organizadora para organelos e suporte estrutural para cílios e flagelos. Filamentos intermediários: São estruturas filamentosas presentes em tecidos específicos, que servem para diferentes funções, incluindo o suporte estrutural para a membrana nuclear, a integridade estrutural para células como tecidos e a atuação na estrutura e como barreiras na pele, cabelo e unhas. Não existem proteínas motoras que utilizem os filamentos intermediários para seu deslocamento. 28 Andreia Balhico – Biologia Celular As funções do citoesqueleto são reguladas pela sinalização celular. As células usam recetores da superfície celular para perceber sinais externos a partir da matriz extracelular, outras células ou fatores solúveis. Esses sinais são transmitidos pela membrana plasmática e ativam vias de sinalização citosólica específicas. Os sinais são detetados por recetores da superfície celular que ativam as vias de transdução de sinal, convergindo, por fim, em fatores que regulam a organização cito esquelética. Os sinais, muitas vezes integrados a partir de mais de um recetor, levam à organização do citoesqueleto para fornecer às células o seu formato, assim como para determinar a distribuição e o movimento dos organelos. Na ausência de sinais externos, as células ainda organizam sua estrutura interna, mas não de maneira polarizada. Filamentos de actina Conformação A actina é uma proteína abundante na maioria das células eucarióticas. Os humanos têm seis genes de actina. A actina existe na forma de um monômero globular chamado de actina G e na forma de um polímero filamentoso chamado de actina F. O nome microfilamento refere-se à actina na sua forma polimerizada com suas proteínas associadas. As subunidades em um filamento de actina estão organizadas como uma estrutura de hélice. Cada subunidade na estrutura faz contato com uma subunidade acima e uma abaixo numa das fitas e com duas subunidades na outra fita. As subunidades enrolam-se uma única fila, por trás da outra fita e repetem este processo depois de 14 subunidades de actina. Todas as subunidades num filamento de actina estão orientadas da mesma maneira. Consequentemente, o filamento exibe polaridade, isso é, uma extremidade que difere da outra. Uma extremidade do filamento é favorecida pela adição das subunidades de actina e é designada como extremidade (+) enquanto a outra é favorecida pela dissociação de subunidades, designada extremidade (-). Na extremidade (+) o sítio de ligação ao ATP da subunidade de actina faz contato com a subunidade de actina adjacente, enquanto na extremidade (-), o sítio está exposto à solução circundante e liga-se ao ADP A extremidade (-) é chamada de extremidade pontiaguda, enquanto a (+) é farpada. 29 Andreia Balhico – Biologia Celular Polimerização A polimerização in vitro da actina G pura ocorre em três fases sequenciais: A fase de nucleação é marcada por um período de latência no qual as subunidades da actina G combinam em duas ou três subunidades. Quando estes alcançam o comprimento de três subunidades, eles atuam como origem, ou núcleo, para a próxima fase. Durante a fase de alongamento, o oligómero curto rapidamente aumenta de comprimento pela adição de monômeros de actina a ambas as extremidades. À medida que os filamentos de actina F crescem, a concentração dos monômeros de actina G diminui, até que seja alcançado o equilíbrio entre as extremidades dos filamentos e os monômeros, e um estado estacionário seja alcançado (alongamento exponencial). Na fase de estado estacionário, os monômeros de actina G permutam com subunidades nas extremidades dos filamentos, mas não ocorre mudança no comprimento total dos filamentos (equilíbrio químico). (a) Na fase de nucleação inicial, os monômeros de actina G-ATP (vermelho) lentamente Se alguns formam complexos estáveis de actina (roxo). Estes núcleos são rapidamente alongados, na segunda fase, pela adição de subunidades a ambas as extremidades do filamento. Na terceira fase, as extremidades dos filamentos de actina permanecem em estado estacionário com a actina G monomérica. (b) A linha de tempo da reação de polimerização in vitro mostra o período de latência fragmentos de filamentos de actina curtos estáveis são adicionados no início da reação, para atuarem como núcleos, o alongamento prossegue imediatamente, sem qualquer período de latência, como podemos observar no gráfico da figura (c). A velocidade de adição de actina G à extremidade (+), onde se liga o ATP, é maior do que a que ocorre na extremidade (-). Cerca de 12 subunidades, em média, serão adicionadas à extremidade (+) a cada segundo, enquanto apenas 1,3 serão adicionados à extremidade (-). A concentração crítica (Cc) é a concentração de monômeros de actina G em equilíbrio com os filamentos de actina. Em concentrações de monômeros inferiores à Cc, não ocorre a polimerização. Quando a polimerização é induzida em concentrações de monômeros superiores à Cc, os filamentos são formados até que o estado estacionário seja alcançado e a concentração caia até a Cc inicial. 30 Andreia Balhico – Biologia Celular A habilidade dos filamentos de actina em aumentar e diminuir é movida pela hidrólise de ATP. Quando a actina G-ATP se liga à extremidade (+), o ATP é hidrolisado em ADP. o filamento torna-se assimétrico, com as subunidades actina-ATP na extremidade (+). após a liberação de Pi, seguidas pelas subunidades actina-ADP em direção à extremidade (-). Subunidades de actina-ATP adicionam mais rápido à extremidade ( +) do que à extremidade(-) de um filamento de actina, resultando em uma concentração crítica mais baixa e rolamento das subunidades em estado estacionário. (a) A taxa de adição de actina G-ATP é muito mais rápida da extremidade ( +) do que na extremidade(-), enquanto a taxa de dissociação de actina-ADP é similar nas duas extremidades. Essa diferença resulta em uma concentração crítica mais baixa na extremidade (+).No estado estacionário, a actina-ATP é adicionada preferencialmente à extremidade (+),dando origem a uma região curta do filamento contendo actina-ATP e regiões contendo actina-P,-ADP e actina- ADP em direção da extremidade ( + ). (b) No estado estacionário, as subunidades de actina G-ADP se dissociam da extremidade(-) dando origem ao rolamento das subunidades. Proteínas de regulação 1. Profilina e Cofilina A profilina possui uma propriedade importante, ela pode ligar-se a outras proteínas ao mesmo tempo em que se liga à actina. A cofilina também é uma pequena proteína envolvida no rolamento da actina, mas esta liga-se especificamente à actina F na qual as subunidades contêm ADP, que são as subunidades mais antigas no filamento em direção à extremidade (-) Esta proteína gera muito mais extremidades (-) livres e, por isso, aumenta muito a dissociação da extremidade (-) do filamento. As subunidades de actina-ADP liberadas são então recarregadas pela profilina e adicionadas à extremidade (+). Assim, a profilina e a cofilina podem aumentar o rolamento das subunidades mais de dez vezes, até os níveis observados. Como seria de esperar, a célula utiliza vias de transdução de sinal para regular tanto a profilina quanto a cofilina, e, dessa forma, a renovação dos filamentos de actina. 2. Proteínas capping O rolamento das subunidades e a dinâmica dos filamentos de actina ainda são regulados nas células pelas proteínas de revestimento (capping) que se ligam especificamente às extremidades dos filamentos. Não fosse assim, os filamentos de actina continuariam a crescer e a se dissociar de maneira descontrolada 31 Andreia Balhico – Biologia Celular Uma proteína conhecida como CapZ, liga-se com alta afinidade à extremidade (+) dos filamentos de actina, inibindo a adição ou a perda das subunidades. A concentração de CapZ nas células geralmente é suficiente para bloquear rapidamente qualquer extremidade (+) recém-formada. 3. Tropomodulina e tropomiosina Outra proteína chamada tropomodulina liga-se à extremidade (-) dos filamentos de actina, inibindo também a associação e a dissociação. A tropomodulina trabalha com outra proteína, a tropomiosina, que se localiza ao longo do filamento para estabilizá-lo 4. Gelsolina A gelsolina, é regulada por níveis aumentados dos iões cálcio. Ao ligar-se ao ião cálcio, a gelsolina sofre alteração conformacional que permite sua ligação na lateral de um filamento de actina e sua inserção entre as subunidades da hélice, quebrando assim o filamento. Ela então permanece ligada ao filamento e bloqueia a extremidade (+), gerando uma nova extremidade (-). Despolimerização As proteínas de ligação à actina regulam a taxa de associação e dissociação, assim como a disponibilidade da actina G para polimerização. No ciclo da profilina ll, a profilina liga-se à actina G-ADP e catalisa a troca de ADP por ATP. O complexo profilina-actina G-ATP pode levar a actina para a extremidade (+) de um filamento com dissociação e reciclagem da profilina No ciclo da cofilina H, a cofilina liga-se preferencialmente aos filamentos que contêm actina-ADP, induzindo- os a fragmentar e assim estimular a despolimerização, por gerar mais extremidades. No ciclo da timosina-𝜷4, a actina G disponível a partir do equilíbrio da profilina-actina é ligada pela timosina- 𝛽4, sequestrando-a da polimerização. Como a concentração de actina G livre é diminuída pela polimerização, a timosina- 𝛽4 - actina G dissocia-se para tornar a actina G livre disponível para associação com profilina e promover a polimerização. As proteínas de revestimento bloqueiam a associação e a dissociação nas extremidades dos filamentos. A CapZ bloqueia a extremidade (+), que é onde normalmente os filamentos crescem, assim sua função é limitar a dinâmica da actina à extremidade (-). A proteína de revestimento tropomodulina bloqueia as extremidades (-), onde normalmente ocorre a dissociação do filamento; assim, a principal função da tropomodulina é estabilizar os filamentos. 32 Andreia Balhico – Biologia Celular Proteínas de ligação à actina 1.Forminas – FH1 e FH2 As forminas são encontradas em essencialmente todas as células eucarióticas, possuem dois domínios adjacentes em comum, os domínios FHl e FH2 Os dois domínios FH2 de dois monômeros individuais se associam. Esse complexo tem a habilidade de fazer a nucleação da associação da actina pela ligação de duas subunidades de actina, mantendo-as de modo que a extremidade (+) esteja voltada para os domínios FH2 O dímero FH2 pode se ligar às duas subunidades terminais, deixando uma escapar para permitir a adição de uma nova subunidade, libertando espaço para a adição de outra subunidade na outra fita e permite o crescimento na extremidade (+) O domínio FHl é rico em resíduos de prolina que são sítios para a ligação de algumas moléculas de profilina. A actina dos complexos actina-profilina localizados é transferida para o domínio FH2 para adicionar actina à extremidade (+) Uma vez que as forminas permitem a adição das subunidades de actina à extremidade (+), longos filamentos com formina na sua extremidade (+) vão ser gerados. Dessa forma, as forminas fazem a nucleação da montagem da actina e possuem a notável capacidade de permanecer ligadas à extremidade (+) Para assegurar o crescimento contínuo do filamento, as forminas se ligam à extremidade (+) de modo a impedir a ligação de uma proteína de revestimento na extremidade (+) como CapZ, que normalmente terminaria a formação As forminas têm um domínio chamado FH2 que pode formar um dímero e fazer a nucleação da montagem do filamento. O dímero liga duas subunidades de actina (etapa 1) e, ao balançar-se para trás e para frente (etapas 2 a 4), pode permitir a inserção de subunidades adicionais entre o domínio FH2 e a extremidade (+) do filamento em crescimento. O domínio FH2 protege a extremidade (+) de ser bloqueada pelas proteínas de revestimento. 2..Complexo Arp2/3 O complexo Arp2/3 é uma máquina proteica composta por sete subunidades, duas das quais são proteínas relacionadas à actina. Para promover a nucleação da formação da actina ramificada, o Arp2/3 deve ser ativado pela interação com um fator promotor da nucleação (NPF), além de se associar com a lateral de um filamento de actina preexistente, tornando o Arp2/3 um potente nucleador para a associação da actina. 33 Andreia Balhico – Biologia Celular O NPF liga uma subunidade de actina por meio do seu domínio WH2 e ativa o complexo Arp2/3 pela interação com seu domínio acíclico. Quando ativados por NPF, Arp2 e Arp3 alteram-se para sua conformação correta e o complexo se liga à lateral do filamento de actina preexistente. A subunidade de actina trazida pelo domínio WH2 de NPF liga-se ao molde Arp2/3 para fazer a nucleação da montagem do filamento na extremidade (+). Essa nova extremidade (+) então cresce enquanto actina G-ATP estiver disponível ou até ela ser bloqueada por uma proteína de revestimento, como a CapZ. Uma subunidade de actina liga-se ao domínio W (etapa 1), e então o domínio A liga-se ao complexo Arp2/3 (etapa 2). Esta interação induz a alteração conformacional no complexo Arp2/3 e depois de se ligar à lateral de um filamento de actina, a subunidade actina ligada ao domínio W se liga ao complexo Arp2/3 (etapa 3) que então inicia a associação de um filamento de actina na extremidade (+) disponível (etapa 4). A ramificação Arp2/3 gera um ângulo característico de 70º entre os filamentos. 3.Proteinas de interligação A fimbrina, proteína encontrada nas microvilosidades, forma os feixes de filamentos, todos com a mesma polaridade. Assim como a fimbrina, a 𝑎-actinina também une filamentos de actina paralelos em um feixe, porém mais distantes do que a fimbrina. Outra proteína, chamada espectrina, é um tetrâmero com dois sítios de ligação à actina. Esta deixa uma distância ainda maior entre os filamentos de actina e forma redes sob a membrana plasmática A filamina, possuem uma região bastante flexível entre os dois sítios de ligação, funcionando como suspensão molecular, de modo que possam fazer interligações estabilizadoras entre os filamentos num emaranhado 34 Andreia Balhico – Biologia Celular Exemplos de quatro proteínas de interligação da actina F, onde todas têm dois domínios (azul) que se ligam à actina F. Algumas têm um sítio de ligação à Ca2 + (roxo) que inibe sua atividade em níveis altos de Ca2 + livre. Também está representada a distrofina, que possui um sítio de ligação à actina no seu domínio N-terminal e um domínio (-terminal, que se liga à proteína de membrana distroglicana. Proteínas motoras- Miosina A miosina II é isolada a partir do músculo esquelético. No músculo esquelético, centenas de moléculas de miosina II individuais são agrupadas em feixes chamados filamentos grossos bipolares. A miosina 1 consiste em um domínio cabeça com um número variável de cadeias leves associadas com o domínio pescoço. (a)Organização Membros dadaclasse miosina da miosina II em filamentos 1 são as isolados únicas miosinas do músculocomesquelético. um único domínio A miosina cabeça. II é composta As miosinasporII têm filamentoscabeça dois domínios bipolares e duasnoscadeias quais as caudas leves formameasão por pescoço seta do filamento a única com classe que as se pode cabeças expostas organizar nas em filamentos bipolares. extremidades. As miosinas (b) VAspossuem moléculasdois dedomínios miosina IIcabeça consistem e seisemcadeias duas cadeias leves por pesadas pescoço. idênticas Elas se(azul ligamclaro) a recetores e quatro (retângulo específicos cadeias leves (verde enas marrom) azulorganelas escuro). Aque cauda dastransportam. elas cadeias pesadas forma Todas um dímeronestas as miosinas de super-hélice; três classes se a região de movimentam na pescoço direção dade extremidade cada cadeia pesada possui duasde (+) dos filamentos cadeias actina.leves associadas com ela. 35  Andreia Balhico – Biologia Celular Modelo deslizante Dentro de cada célula muscular, existem várias miofibrilas que consistem em um arranjo repetido regular de uma estrutura especializada chamada sarcómero Cada sarcómero contém dois tipos de filamentos: os filamentos grossos, compostos por miosina II, e os filamentos finos, contendo actina e proteínas associadas Os filamentos grossos são compostos por filamentos bipolares de miosina II, nos quais as cabeças em cada metade do filamento têm orientações opostas. Os filamentos de actina finos são montados com suas extremidades (+) numa estrutura densa chamada Disco Z. A hidrólise de ATP está associada ao movimento de uma cabeça de miosina em direção ao disco Z, que corresponde à extremidade (+) do filamento fino de actina Os filamentos grossos arrastam os filamentos finos rumo ao centro dos filamentos grossos e, portanto, rumo ao centro do sarcómero. Esse movimento encurta o sarcómero até que as extremidades dos filamentos grossos entrem em contato com o disco Z. Na presença de ATP e Ca2+, as cabeças de miosina que se estendem Para estabilizar os filamentos de actina, a CapZ bloqueia a a partir dos filamentos grossos se deslocam rumo às extremidades extremidade (+) dos filamentos finos no disco Z, enquanto a (+) dos filamentos finos. Como os filamentos finos estão ancorados tropomodulina bloqueia a extremidade (-). A proteína gigante titina nos discos Z (roxo), o movimento da miosina puxa os filamentos de se estende pelos filamentos grossos e se liga ao disco Z. A nebulina se actina rumo ao centro do sarcómero, encurtando seu comprimento liga às subunidades de actina e determina o comprimento do no estado contraído filamento fino. Contração Muscular (a) Modelo do complexo regulador tropomiosina-troponina sobre um filamento fino. (b) A tropomiosina no seu estado relaxado (superior) desloca-se para sua nova posição (seta) no estado que induz a contração (inferior) quando a concentração de Ca2 + aumenta. Este movimento expõe os sítios de ligação à miosina (vermelho) da actina. (A troponina não aparece nesta representação, mas permanece ligada à tropomiosina em ambos os estados). (c) Resumo da regulação da contração do músculo esquelético pela ligação de Ca2 + à troponina 36 Andreia Balhico – Biologia Celular Na ausência de ATP, a cabeça da miosina está firmemente ligada ao filamento de actina. Embora bastante curto no músculo esquelético, este é o estado responsável pelo enrijecimento muscular na morte (rigor mortis). Etapa 1: Ao se ligar ao ATP, a cabeça da miosina se libera do filamento de actina. Etapa 2: A cabeça hidrolisa o ATP em ADP e P, que induz uma rotação da cabeça em relação ao pescoço. Este estado "inclinado" armazena a energia liberada pela hidrólise de ATP como energia elástica, semelhante a um elástico esticado. Etapa 3: A miosina no estado “inclinado" se liga à actina. Etapa 4: Quando ligada à actina, a cabeça da miosina acopla a liberação de P, com a liberação da energia elástica para mover o filamento de actina. Isso é conhecido como “movimento de força" uma vez que envolve o movimento do filamento de actina em relação a extremidade do domínio pescoço da miosina. Etapa 5: A cabeça permanece firmemente ligada ao filamento enquanto o ADP é liberado e antes que novo ATP seja ligado à cabeça. Adesão celular A migração celular resulta da coordenação dos movimentos gerados em diferentes partes de urna célula. Esta é iniciada pela formação de uma ampla protrusão da membrana grande e na borda anterior de uma célula Os filamentos de actina na borda anterior são rapidamente interligados em feixes e redes em uma região de protrusão, chamada de lamelipódio nas células de vertebrados. formam, então, contatos estáveis com a superfície subjacente (como a matriz extracelular) pela qual a célula se desloca. 37  Andreia Balhico – Biologia Celular Extensão da membrana A rede dos filamentos de actina na borda anterior é um tipo de máquina celular que empurra a membrana adiante. A actina é nucleada, na membrana da borda anterior, pelo complexo Arp2/3 ativado, e os filamentos são alongados pela associação de subunidades nas extremidades (+). A membrana frontal é empurrada para fora enquanto os filamentos se alongam A renovação da actina, e assim o rolamento das subunidades, é mediada pela ação da profilina e cofilina. Adesões célula-substrato Quando a membrana tiver sido estendida e o citoesqueleto tiver se organizado, a membrana torna-se firmemente aderida ao substrato. Os feixes de actina na borda anterior aderem às estruturas conhecidas como adesões focais. A ligação impede que ocorra a retração da lamela que está avançando e fixa a célula ao substrato, permitindo que a célula vá adiante. As moléculas de adesão celular que fazem a mediação da maioria das interações célula- matriz são proteínas de membrana chamadas integrinas. Essas proteínas têm um domínio externo que se liga a componentes específicos da matriz extracelular, como fibronectina e colágeno, e um domínio citoplasmático que as liga ao citoesqueleto de actina Translocação do corpo da célula Depois de as ligações anteriores terem sido estabelecidas, a maior parte do conteúdo do corpo celular é translocado para frente. Acredita-se que o núcleo e as outras organelas embebidas no citoesqueleto sejam movidos para frente pela contração cortical dependente de miosina II na parte posterior da célula Rompimento das adesões celulares Finalmente, na última etapa do movimento, as adesões focais na parte posterior da célula rompidas, e as integrinas são recicladas. A capacidade de movimento celular corresponde a um equilíbrio entre as forças mecânicas geradas pelo citoesqueleto e as forças resistentes geradas pela adesão celular (b) Diagrama das classes dos microfilamentos (c) A estrutura das adesões focais envolve a ligação das extremidades das fibras de envolvidos na migração celular. A rede dos tensão por meio da integrinas à matriz extracelular subjacente. As adesões focais filamentos de actina na borda anterior desloca a também contêm várias moléculas de sinalização importantes para locomoção celular. célula para frente. As fibras contráteis no córtex (d) A rede dinâmica de actina na borda anterior é nucleada pelo complexo Arp2/3 e celular espremem o corpo da célula para frente, utiliza o mesmo grupo de fatores que controlam a associação e a dissociação dos e as fibras de tensão que terminam nas adesões filamentos de actina na cauda da Listeria focais também puxam a maior parte do corpo celular à medida que as adesões posteriores são liberadas. 38 Andreia Balhico – Biologia Celular Microtúbulos Os microtúbulos e seus motores contribuem para o movimento dos cílios e flagelos Observados transversalmente, mostram que todos são compostos de 13 unidades longitudinais repetidas hoje chamadas de protofilamentos. Foi observado que microtúbulos purificados a partir do cérebro são compostos por uma proteína principal, a tubulina, e por proteínas associadas, as proteínas associadas aos microtúbulos (MAPs). As tubulinas consistem em duas subunidades intimamente relacionadas chamadas de 𝑎 - e 𝛽-tubulinas. Cada uma das subunidades 𝑎 - e 𝛽 do dímero de tubulina pode ligar-se a uma molécula de GTP. O GTP ligado pela subunidade í3 pode ser hidrolisado e o GDP hidrolisado pode ser trocado por GTP livre De maneira semelhante, os dímeros de tubulina em que a subunidade 𝛽 tem um GDP ligado adicionam-se preferencialmente a uma das extremidades do microtúbulo, também designada extremidade (+) A hidrólise de GTP possui efeitos drásticos sobre o comportamento da extremidade (+) do microtúbulo. Os microtúbulos são compostos por 13 protofilamentos associados lateralmente que formam um túbulo Cada um dos 13 protofilamentos é um cordão de dímeros de 𝑎 - e 𝛽 -tubulina arranjados longitudinalmente, Os dímeros de 𝑎 - e 𝛽 -tubulina num protofilamento estão todos orientados de mesma forma, cada protofilamento tem uma subunidade 𝑎 em uma extremidade e uma subunidade 𝛽 na outra, tendo polaridade intrínseca. Todos os protofilamentos associados lateralmente têm a mesma polaridade; dessa forma, os microtúbulos também têm polaridade geral. A extremidade com as subunidades 𝛽 expostas é a extremidade (+), enquanto a extremidade com as subunidades 𝑎 expostas é a extremidade (-) Os microtúbulos têm uma junção longitudinal única, onde uma subunidade 𝑎 de um protofilamento se encontra com uma subunidade 𝛽 do protofilamento adjacente. A organização das subunidades de tubulina num microtúbulo. Os dímeros são alinhados, extremidade com extremidade, em protofilamentos, os quais se dispõem lado a lado para formar a parede do microtúbulo. Os protofilamentos estão levemente descompassados, de modo que a a-tubulina num protofilamento está em contato com a 𝑎 -tubulina dos protofilamentos vizinhos, exceto na junção, onde a subunidade a faz contato com a subunidade 𝛽.O microtúbulo exibe uma polaridade estrutural na qual as subunidades são preferencialmente adicionadas à extremidade na qual os monômeros de 𝛽 - tubulina estão expostos. Esta extremidade do microtúbulo é conhecida como extremidade (+) 39  Andreia Balhico – Biologia Celular Um microtúbulo único, composto por 13 protofilamentos. Os microtúbulos duplos ou triplos são encontrados em estruturas especializadas, como nos cílios e nos flagelos (microtúbulos duplos) e em centríolos e corpos basais (microtúbulos triplos), Polimerização Os microtúbulos são polimerizados a partir de sítios específicos para gerar vários tipos diferentes de organizações Estes são nucleados a partir de estruturas conhecidas como centros de organização dos microtúbulos, ou MTOCs. Na maioria dos casos, a extremidade (-) do microtúbulo permanece ancorada no MTOC, enquanto a extremidade (+) se estende para longe. As interações laterais entre os protofilamentos na 𝛽 -tubulina-GTP Um microtúbulo com 𝛽 -tubulina-GTP na extremidade bloqueadora são suficientemente fortes para não permitirem que o de cada protofilamento é fortemente favorecido para crescer. Entretanto, um microtúbulo com 𝛽 -tubulina- microtúbulo descame nessa extremidade; assim, os protofilamentos logo atrás GDP nas extremidades dos protofilamentos forma uma da 𝛽 -tubulina-GTP bloqueadora são coagidos a não se dissociarem. A energia estrutura curvada e irá sofrer dissociação rápida. Pode libertada pela hidrólise de GTP das subunidades atrás do bloqueio é ocorrer a alternância entre as fases de crescimento e armazenada como tensão estrutural aguardando para ser libertada quando o encurtamento, chamadas resgate e catástrofe bloqueio da 𝛽 -tubulina-GTP é perdido. 40 Andreia Balhico – Biologia Celular A organização dos microtúbulos e mais dinâmica na extremidade (+), onde os microtúbulos são polimerizados a partir de sítios localizados conhecidos como MTOCs e os microtúbulos individuais podem sofrer instabilidade dinâmica. Juntos, esses dois processos contribuem para a distribuição dos microtúbulos nas células. Se o microtúbulo for submetido a uma frequência alta de catástrofe e baixa de resgate, ele irá encurtar de volta para o centrossomo e desaparecer, enquanto se ele sofrer várias catástrofes e for prontamente resgatado, ele continuará a crescer. A "captura" da organela ou estrutura celular pelo microtúbulo estabiliza sua extremidade (+) e o protege de catástrofes, enquanto microtúbulos não ligados têm maior frequência de dissociação. Resumindo: As extremidades (+) dos microtúbulos podem sofrer a instabilidade dinâmica, com períodos de alternância de crescimento e encurtamento rápidos. A maioria da 𝛽 -tubulina nos microtúbulos está ligada a GDP. Nos microtúbulos em crescimento, as extremidades (+) são bloqueadas pela 𝛽 -tubulina-GTP e são cegas ou levemente alargadas. Os microtúbulos em encurtamento perderam a 𝛽 -tubulina-GTP bloqueadora, causando a dissociação dos protofilamentos. Os microtúbulos em crescimento armazenam energia derivada da hidrólise de GTP na rede de microtúbulos, de modo que tenham o potencial de realizar o trabalho quando estiverem em dissociação. Os microtúbulos polimerizados a partir do centrossomo e que exibem instabilidade din âmica podem "procurar" por estruturas ou organelas no citoplasma que tenham alvos apropriados e as "capturar", resultando na estabilização da extremidade (+) do microtúbulo. Dessa forma, a polimerização acoplada à "procura e captura" pode contribuir para a distribuição geral dos microtúbulos em uma célula. Centros organizadores de microtúbulos O centrossomo é o principal MTOC nas células animais, estando geralmente localizado perto do núcleo. Todos os microtúbulos são nucleados a partir de estruturas conhecidas como centros de organização dos microtúbulos, ou MTOCs. Na maioria dos casos, a extremidade (-) do microtúbulo permanece ancorada no MTOC, enquanto a extremidade (+) se estende para longe A pericentriola. consistem em nove conjuntos de microtúbulos triplos intimamente relacionados na sua estrutura com os corpos basais encontrados na base dos cílios e flagelos. Os corpos basais têm estrutura similar ao centríolo e são os MTOCs encontrados na base dos cílios e flagelos 41 Andreia Balhico – Biologia Celular (d), os dois MTOCs são chamados polos do fuso (os cromossomos são mostrados a azul) num neurônio (e), os microtúbulos nos axônios e dentrites são polimerizados a partir de um MTOC em um corpo celular e então são liberados deste; os microtúbulos que compõem o eixo de um cílio ou flagelo (f) são polimerizados a partir de um MTOC conhecido como corpo basal. A polaridade dos microtúbulos está indicada por (+) e (-) O centrossomo é o MTOC que faz a nucleação do arranjo radial dos microtúbulos em células animais não mitóticas; dois centrossomos, ou polos do fuso, são os MTOCs que fazem a nucleação dos microtúbulos do fuso mitótico; e os corpos basais são os MTOCs que organizam os microtúbulos dos cílios e flagelos (ver Figura 18-5). Os centrossomos consistem em dois centríolos e material pericentriolar que contém o complexo de nucleação do microtúbulo Proteínas estabilizadores e desestabilizadoras 1. Família tau e MAP Entre as mais estudadas está a família tau de proteínas, que inclui a própria tau e proteínas chamadas de MAP2 e MAP4. As Tau e MAP2 são proteínas neuronais. Acredita-se que as proteínas tau estabilizem os microtúbulos e também atuem como espaçadoras entre eles. MAP2 é encontrada apenas nos dendritos dos neurônio. Elas podem aumentar a taxa de crescimento dos microtúbulos ou suprimir a frequência de catástrofe Em vários casos, elas apenas se associam com as extremidades (+) que estão a crescer e não a encurtar. As MAPs nessa classe são conhecidas como + TIPs, para proteínas que trilham pela extremidade (+). (a) Micrografias eletrônicas de secções transversais de protuberâncias induzidas pela expressão da MAP2 (esquerda) ou da tau (direita) em células transfectadas. O espaçamento entre os microtúbulos (MTs) nas células que contêm a MAP2 é maior do que nas células que contêm a tau. Ambos os tipos de células contêm aproximadamente o mesmo número de microtúbulos, mas o efeito da MAP2 é aumentar o diâmetro da protuberância similar ao axônio. (b) Diagramas das associações entre os microtúbulos e as MAPs 42 Andreia Balhico – Biologia Celular 2. Cinesinas e Dineínas A polimerização e a despolimerização dos microtúbulos podem realizar trabalho usando a energia fornecida pela hidrólise de GTP. Além disso, as proteínas