Samenvatting Instrumentele Analyse PDF

DEEL 1: SPECTROFOTOMETRIE = interactie tssn elektromagnetische straling (EMS) en materie (moleculen of atomen). Eigenschappen EMS: - Polarisatie (alle golven hebben dezelfde richting) Dispersie (1 straal geeft meerdere stralen) Breking (refractie) Interferentie (samenwerking/tegenwerking golven op...

DEEL 1: SPECTROFOTOMETRIE = interactie tssn elektromagnetische straling (EMS) en materie (moleculen of atomen). Eigenschappen EMS: - Polarisatie (alle golven hebben dezelfde richting) Dispersie (1 straal geeft meerdere stralen) Breking (refractie) Interferentie (samenwerking/tegenwerking golven op zelfde plaats en tijd) ABSORBANTIESPECTROMETRIE ➔ Meten hoeveel straling geabsorbeerd wordt - UV, VIS, IR, AAS EMISSIESPECTROMETRIE ➔ Meten hoeveel straling uitgezonden wordt - Vlamfotometrie, fluorimetrie HOOFDSTUK 1) UV/VIS SPECTROFOTOMETRIE Wordt meest gebruikt. Kleur v/d oplossing is de kleur die niet wordt geabsorbeerd, zo speelt de kleur geen rol in de gemeten absorbantie en is die alleen afhankelijk van de deeltjes in de oplossing. Geabsorbeerde kleur en doorgelaten kleur zijn complementair: tegenover elkaar in de kleurencirkel. PRINCIPE UV/VIS steunt op abosorbantiespectrofotometrie. Er wordt licht door een staal gestuurd, een deel van dit licht zal geabsorbeerd worden om het molecuul in geëxciteerde toestand te brengen. De detector meet een deel van het licht dat niet is geabsorbeerd en kan hierdoor de absorbantie berekenen. M + h . v = M* = M + water ONDERDELEN APPARATUUR STRALINGSBRON ▪ - VIS (400 nm – 700 nm) Wolfraam (350nm-2200nm) 1 ▪ ▪ - Wolfraam/Halogeen (240nm-2500nm) UV (200nm-400nm) Deuterium (150nm-400nm) Waterstof Combo Xenon (200-800nm) Mercurry GOLFLENGTESELECTOR ▪ Waarom? o Lambert-Beer => ijklijn o Selectiviteit o Gevoeligheid ▪ Welke? o Filters (alles wat je niet wilt, weg) : Absorptie & interferentie (verwijderen ongewenste golflengtes) o Monochromators: prisma’s & roosters (gewenste golflengte is instelbaar) → enkel dat zonder wegfilteren ▪ Absorptiefilter = glasfilter (kwaliteit minder) o Gekleurd glas o Kleurstof in gelatine tussen 2 glazen o Laten λ-band door met overeenkomend eigen kleur ▪ Interferentiefilters: o Bestaat uit: ▪ Monochromators = apparaat dat polychromatisch licht splitst in de samenstellende golflengtes en de selectie toelaat van ieder gewenste golflengte o Prisma: dispersie is afhankelijk van golflengte = niet meer gebruikt o Rooster: − Groefjes: per groefjes = kleur & via spiegel = 1 regenboog => exit slit: kiezen welke kleur doorlaten − Spiegels, spleten, lenzen, dispergerend element (= rooster) 2 STAAL ▪ Cuvetten DETECTOR ▪ ▪ ▪ Fotomultiplicatorbuis Fotodiode (silicium) Diode array detector DATA OUTPUT ▪ Elektrisch signaal: o Analoog: naald met spiegel, recorder o Digitaal: LED (light emitting diode), LGD (liquid crystal display), CRT (cathode ray tube) TOEPASSINGEN ▪ Kwalitatief / identificatie o Beperkt: banden te breed (<-> IR) o Vergelijking spectrum met zuivere stof o Opletten voor − Oplosmiddel (transparant, geen effect op absorberende deeltjes) − Polaire solventen: minder fijn structuur − Apolaire solventen: meer fijn structuur ▪ Kwantitatief o VOORDEEL: − Breed toepassingsgebied = veel stoffen absorberen UV/VIS → zoniet kleurreactie ! − Hoge gevoeligheid: 10-4 à 10-5 / 10-46 à 10-7 M − Middelmatige tot hoge selectiviteit: mengsels − Goed accuraatheid: fouten van 0,5 à 2% − Gemakkelijk te bedienen apparatuur HOOFDSTUK 2) NEFELOMETRIE EN TURBIDIMETRIE Nefelometrie: meet lichtverstrooiing Turbidimetrie: meet schijnbare lichtabsorptie PRINCIPE Beide technieken meten de verstrooiing van het licht dat invalt op het staal. 3 M (suspensie) + h . v = M* = S NEFELOMETRIE 2 wetten: Wet 1) deeltje klein tegenover golflengte -> Rayleigh-lichtverstrooiing, meethoek van 90° Wet 2) deeltje groot tegenover golflengte -> Mie-lichtverstrooiing, hogere gevoeligheid met kleinere meethoek (5-12°) TURBIDIMETRIE ONDERDELEN APPARAAT Toestel nefelometrie: nefelometer ➔ Als er een laser wordt gebruikt is er geen golfselector nodig (laser bestaat maar uit 1 golflengte) Voor de rest i/h toestel hetzelfde als de UV/VIS spectrofotometer. Toestel turbidimetrie: gewone colorimeter of spectrofotometer 4 TOEPASSINGEN o o o ▪ ▪ Steeds gebruik maken van standaardoplossingen / ijklijnen Reproduceerbaarheid: sterk afhankelijk van stabiliteit van suspensies Bepalingen: Anorganische analyse: - alle analyten die neerslag vormen vb. Cl-(AgCl) en SO42-(BaSO4) Klinische analyse (Antigeen-bepalingen mbv Ag-Ab-complex): - Kwantitatieve analyse van EW:IgG, IgA, IgM,Coagulatie EW, transferrine,albumine, lipoEW, ... Nefelometrie: o o o o o o o Klinische chemie Antigenen Immunoglobulines Coagulatieproteïnen Lipoproteïnen Dranken (bier, melk, water) Verf, inkt Turbidimetrie: o Bepaling von Willebrand Factor (vWF) HOOFDSTUK 3) INFRAROOD SPECTROMETRIE Golflengtegebied: 700nm-1000µm IR-straling -> warmte PRINCIPE IR-straling valt in op het staal, de moleculen zullen bij een juiste golflengte harder gaan vibreren (vibratie-energie verhoogt). Hierbij nemen ze dus energie op waardoor IR-straling kan geabsorbeerd worden. M + IR = M* = M vibraties Identificatie & structuuropheldering van organische verbinden E elektronen overgang >> E vibratie >> E rotatie Een voorwaarde voor absorptie= molecule moet polair covalente bindingen hebben (dipool). 5 3 soorten trillingen: o Strekking (stretching)-, rekvibraties, rektrillingen: verandering in inter-atomaire afstand (tussen atoomkernen) 𝜎 = 4000 – 1500 cm-1 o Buiging (bend) vibraties: verandering in de hoek tussen bindingsassen 𝜎 = 1500 – 500 cm-1 o Skeletvibraties: trillingen tussen 2 meer-atomige groepen in een molecule Golfgetallengebied = fingerprint 𝜎 = 13500 – 500 cm-1 Elk atoom vibreert met een frequentie afh van massa, lengte en sterkte Moleculaire vibraties worden versterkt door geabsorbeerde IR straling Verschillende manieren waarop een molecule kan vibreren zijn gerelateerd met verschillende atomen (of bindingen) Pieken in spectrum → handig om functies in molecule te identificeren IR-spectrum wordt in transmissie weergegeven. 6 ONDERDELEN APPARATUUR STRALINGSBRON De Ideale stralingsbron zendt een constante hoeveelheid energie uit over het hele IR gebied. Bestaat uit een elektrisch tot gloeien (1000°C) gebrachte weerstand uit specifiek materiaal: Nikkel-Chroom legering Siliciumcarbide (‘globar’) STAAL o Cuvetten: − NaCl / KBr − Geen glas of kwarts, absorberen IR − Geen H2O gebruiken − Droog bewaren + handschoenen o Solventen − Meestal niet gebruikt: complex absorptiespectrum − Watervrij ! o Aggregatietoestanden: − Gas -> cuvetten met KBr / NaCl vensters − Vloeibaar -> niet-vluchtige vloeistof tussen KBr / NaCl vensters (enkel druppels) − Vast -> fijngemalen met KBr onder hoge druk en plaatje persen -> oplossen in organische solvent – Na verdampen, film op NaCl venster -> suspensie in paraffine olie tussen KBr / NaCl vensterd o Attenuated Total Reflectance (kristal) = een snelle methode om een IR spectrum op te nemen Bv: diamant -> vast: aandrukken, vloeistof: afdekken GOLFLENGTESELECTIE Monochromator: golflengtedispersie IR o Geen filter, wel prisma’s of roosters, geen glas/kwarts, wel zout 7 o o Gevoelig voor waterdamp = airco Groot intensiteitsverlies Monochromator: F(fourier) T(transformatie) IR o o o Interferometer in plaats van monochromator Duurder VOORDELEN: − Snelheid − Nauwkeurigheid − Beter signaal / ruisverhouding DETECTOR Detectoren hebben als doel de stralingsenergie (I/I0) te meten o Thermokoppel = bij verschil in temperatuur tussen 2 metalen ontstaat een spanning o Brug van Weatstone = een verband tussen weerstand en temperatuur o Golay detector = gebaseerd op het uitzetten van een gas bij hogere temperatuur TOEPASSINGEN o Structuuropheldering van onbekenden (an)organische verbindingen -> banden -> specifieke groepen (-OH, -NH2 …) gebruik referentiespectra voor identificatie onbekenden o Bepaling actieve stoffen in stalen: Bevat farmaca-staal apsirine of paracetamol? Bevat wijnstaal dieethyleenglycol (zoetstof)? -> zéér giftig en verboden o Minder geschikt voor kwantitatieve bepalingen o Een aantal klinische chemische testen zijn geschikt om met IR spectroscopie te analyseren Klinisch labo: niet zoveel gebruikt, maar mogelijk voor: − Analyses op serum, urine & vruchtwater − Glucose op volbloed − Metabole afwijking HOOFDSTUK 4) VLAMFOTOMETRIE OF ATOMAIRE EMISSIESPECTROMETRIE (AES) PRINCIPE De stoffen in het staal worden verhit waardoor de moleculen splitsen in atomen. Deze atomen worden geëxciteerd en vallen daarna terug naar hun grondtoestand, hierbij ontstaat er emissie van licht met een typische golflengte. M -> A = A* = A + h . v (licht) 8 Exiteren = ioniseren Soort licht hangt af van welke schil het elektron komt en naar welke schil het terug gaat. De emissie is meetbaar als I hoog genoeg is ONDERDELEN APPARATUUR Vlamfotometer - Atomaire emissie spectrometrie (AES) Analysetechniek voor eenvoudige conc.bepaling Belangrijke techniek i/d klinische chemie Ideale condities -> excitatie zo hoog mogelijk en ionvorming zo laag mogelijk VERNEVELEN VAN MONSTER o Luchtstroom over het uiteinde van capillair geblazen dat in een oplossing van monster is geplaatst − Monster worden aangezogen via capillair + verstoven − Kleine vloeistofdruppels (< 2 𝜇m) = als nevel met luchtstroom meegevoerd -> analyse − Grote vloeistofdruppels worden opgevangen (slaan neer) en afgevoerd Luchtstroom met vernevelde monster + brandergas naar de brander − Slechts 5 – 15% van monster verneveld tot kleine druppels -> uiteindelijk in vlam geatomiseerd ATOMISEREN & EXCITEREN VAN DE ELE MENTEN IN DEZE DRUPPELTJES o Temperatuur vlam = constant anders % geëxciteerde atomen = niet constant -> stel temperatuur vlam verandert 10 °C -> verandert % atomen in aangeslagen toestand met 4 % = goede vlam = constante toevoer van afkoelend monster o % geëxciteerde atomen = laag Bv: 2120 °C (H2-lucht) slechts 0,0017% van na geëxciteerd -> toch intense lijn (589 nm) o Hoeveelheden en verhoudingen ges / lucht juist afregelen -> doordoor zorgen we dat vlam er stabiel is en een constante temperatuur heeft 9 ISOLEREN VAN SPECTRAALLIJN SPECIFIEK VOOR ELEMENT o Meeste vlamfotometers kunnen verscheidene elementen gelijktijdig bepalen o Monochromator o Bv: aantal interferentiefilters in boog rond vlam: iedere filter laat 1 spectraallijn (Na, K, Li) door LICHTMETING, VERSTERKING & WEERGAVE SIGNAAL o Achter interferentiefilters staan fotocellen o Meten hoeveelheid doorgelaten licht, versterken & geven analoog of digitaal weer o Meestal aparte aflezingen Na & K INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-AES o Emissietechniek bij heel hoge temperatuur o Monster wordt in plasma verhit tot 6000K o Hoge temperatuur door EMS (~ magnetron) o Plasma: gasmengsel (argongas) waarin vrije atomen, veel vrije ionen en elektronen en moleculen vrijkomen o Veel van de ionen in aangeslagen toestand, kunnen ook EMS emitteren o Emissiespectrum bestaat uit heel veel lijnen met hoge achtergrondstraling → ontwikkeling van analysemethode o Meting van verschillende elementen tegelijk mogelijk HOOFDSTUK 5) ATOMAIRE ABSORBTIESPECTROMETRIE (AAS) PRINCIPE Absorptie van fotonen uit een stralingsbundel door vrije atomen. → monster bij zeer hoge temperatuur in gasfase brengen → moleculen vallen uiteen in atomen (atomiseren) ➔ Atomisatiegraad = % atomen in geatomiseerde toestand aanwezig M = A + h . v = A* De intensiteit van de straling wordt gemeten ONDERDELEN APPARATUUR 10 STRALINGSBRON o Holle Kathodelamp: − Glazen buis met 2 elektroden-spanning 500V • Anode (+): Ni, W (wolfraam) • Kathode (-): metaal (Fe, Al, Cu, Zn) − Vulgas (Ar, Ne) onder verminderde druk − Venster uit kwarts of gas Resultaat: emissie-lijnenspectrum van aangeslagen atomen ATOOMCEL o Verhitting atoombron (staal) met mengsel: afhankelijk van brandstof => verschillende B. knoppen o Volledige atomisatie van staal o Echter ook ionisaties -> gevoeligheid ↓ (ionen absorberen straling bij andere golflengte dan atomen) o Verbrandingsproducten: via puntafzuiging verwijderd o Slechts 5 – 10% gaat naar brander dus minder geschikt voor gevoelige metingen (𝜇g/l) -> grafietoven GRAFIETOVEN o Verhitting atoombron: elektrisch met tempratuur-programma (ca 8800K) o Schuitje van grafiet (kleine hoeveelheid staal: druppel, vaste stof) o Na meting wordt oven uitgegloeid (restanten monster verwijderen) o Temperatuurprogramma optimaliseren MONOCHROMATOR o 1 emissielijn uit spectrum isoleren = analyselijn o Intensiteit van de lamp wordt gemeten voor en na absorptie o Golflengte emissiestraling: selectieve absorptie door te bepalen element X ➔ AAS = zeer selectief (scheiding vooraf zeer overbodig) DETECTOR Meestal FMB TOEPASSINGEN o o Sporenanalyse (ppb-ppm) van metalen en niet-metalen Concentratiebepaling aan de hand van ijklijnmethode of standaardadditiemethode (matrixeffect) 11 o o Procedures experimenteel bepaald, omzettingsgraad G moet maximaal zijn Ijklijnmethode AAS vs. AES AAS Absorptie Atomisatie Light Source Lambert-Beer A vc. C Atomen met hoge excitatie energie AES Emissie Atomisatie & Excitatie No light Source Geen Lambert-beer (I = k . c) I vs. C Atomen met lage excitatie energie HOOFDSTUK 6) FLUORIMETRIE PRINCIPE Meten van de lichtemissie door geëxciteerde moleculen Fotoluminescentie (fluorescentie + fosforescentie) → de energie van het uitgestraalde licht < de energie van het geabsorbeerde licht → de golflengte van het uitgestraalde licht is langer dan de golflengte van het geabsorbeerde licht − Energie toevoegen ---> excitatie: M + h . v --> M* − Relaxatie − Fluorescentie ---> lichtemissie: M* --> M + h . v’ − Relaxatie = non-radiative transition = relaxatie o Tijdsduur (∆t) van relaxatie + lichtemissie (voordat een gedeelte van het geabsorbeerde licht opnieuw uitgezonden is): − ∆t > 10-4 s tot uren: fosforescentie • Enkel goed meetbaar bij vaste stoffen • Bv: fosforescerende postzegels worden automatisch gestempeld • In klinische chemie niet belangrijk o − ∆t 10-9 - 10-6 s (onmiddellijk): fluorescentie • Eosine (rood-oranje oplichtend) -> kleuring van eosinofiele granulocyten, regenjassen … • Fluoresceïne (geel-groen oplichtend) -> markeringsviltstiften • Optische witmarkers (wasmiddel): witter dan wit ONDERDELEN APPARATUUR Fluorimeter: voor kwantitatieve bepalingen Spectrofluorimeter -------------> spectra (excitatie en emissie) Filterfluorimeter ---------------> routinebepaling 12 LICHTBRON o o Spectrofluorimeter − Dikwijls UV o fblauw licht nodig − Wolfraam of deuterium lamp -> te lage intensiteit -> niet bruikbaar − Xenon-booglamp -> continu spectrum met zeer hoge lichtintensiteit Filterfluorimeter − Gasontladingbuis (vb: Hg-lamp, Zn-lamp) EXCITATIEMONOCHROMATOR o o Spectrum (alle golflentes): spectrofluorimeter -> rooster Kwantitatief: filterfluorimeter -> primaire (interferentie) filter CUVET o o o o Exciterend licht: rechtdoor Uitgezonden licht: naar alle kanten Het minste last indien gemeten onder hoek van 90° -> vierzijdig geslepen cuvetten Golflengte excitatie < 325 nm -> kwarts cuvetten FLUORESCENTIEMONOCHROMATOR o Spectrum: spectrofluorimeter => rooster o Kwantitatief: filterfluorimeter => secundaire (interferentie) filter o Opletten met exciterend licht; wordt naar alle richting verstrooid FLUORESCENTIEDETECTOR o o o o o Kleine fractie van exciterend licht w uitgezonden Enkel uitgezonden licht in 1 richting w gemeten I verlies door monochromator Gemeten licht is heel kleine fractie van exciterend licht Zeer gevoelige detectoren: fotomultiplicatorbuis 13 TOEPASSINGEN o Fluorimetrische bepalingen relatief tegenover standaard: 1. Excitatie- en emissiespectrum standaard 2. Monochromator instellen op max 3. Strooilicht controleren – fotomultiplier 4. Blanco in cuvet – autozero 5. Standaard in cuvet – C instellen 6. Monster in cuvet – waarde aflezen o Quenching: verschil tussen standaard en monster -> voorzuiveren, juiste keuze oplosmiddel voor standaard o Standaardadditie o Klinische chemie − Aantonen Ca met calceïne (Ca in nierstenen, serum) − Immunologische bepalingen (Ab met fluorescerende groep) − Fluorescentie-microscoop o Aantoningsreactie − Urobilinebepaling (405 nm excitatie: groen) − Labeling van moleculen (DNA) − Platen dunne laagchromatografie belichten onder UV-lamp -> Terugvinden fluorescerende stoffen bv: Scheiding polyfyrines (voorstadia haemgroep) -> platen met fluorescerende indicator; hele plaat geeft licht, behalve waar stoffen aanwezig zijn die absorberen -> stoffen quenchen Licht -> zichtbaar als donkere vlekjes o Kwantitatieve bepalingen: − Eerder beperkt (klinisch chemie) − Ca-titrator = toestel van bepaling van concentratie van Ca in serum + urine − Bepaling van farmaca zoals kinidine (hartritmestoringen); van sommige vitamines o Immunologische bepalingen (Ab met fluorescerende groep) − Fluorescerende imunno assay, FIA − Fluorescentie-microscopie Vlamfotometrie vs. Fluorimetrie VFM Excitatie van atomen Excitatie dmv hoge temperatuur Lijnenspectra 14 Fluorimetrie Excitatie van moleculen Excitatie dmv licht Bandenspectrum HOOFDSTUK 7) NUCLEAIRE MAGNETISCHE RESONANTIE = kernmagnetische resonantie = kernspinresonantie ~ MRI = Magnetic Resonance Imaging Wel of geen spin? Wel: aantal p OF n even, aantal p EN n oneven Niet: aantal p EN n even Atoomkernen bezitten een spin (= ze draaien rond hun as) ➔ Veroorzaken magneetveldje -> staafmagneetjes Afwezigheid magnetisch veld Aanwezigheid magnetisch veld Hoe groter het extern magnetisch veld, hoe groter het verschil in energie tussen de paralelle en antiparallele stand. De energie nodig om deze overgang van parallel naar antiparallel te maken is afhankelijk van de sterkte van het extern magnetisch veld, maar ligt meestal in het energiegebied van de radio- en televisiegolven. o 2e extern veld (radiofrequentiestraling) uit -> E2 terug naar E1 -> hierbij afgifte radiogolven signaal -> detectie -> breking plaats van oorsprong (of concentratie) o ∆E afhankelijk van de kern (soort atoom, molecule) en afhankelijk van het uitwendig magneetveld B. 15 PRINCIPE Je kiest voor een bepaalde grootte van magnetisch veld. Er worden radiogolven toegevoegd aan de kernen van de moleculen/atomen (meestal 1H en 13C), er wordt van energieniveau 1 gesprongen naar energieniveau 2. De radiogolven worden dan uitgezet waardoor er terug wordt gevallen naar energieniveau 1 en hierdoor zullen er radiogolven worden uitgezonden die dan gedetecteerd kunnen worden. CHEMISCHE VERSCHUIVING (CHEMICAL SHIFT OF VERSCHUIVING RESONANTIELIJN) Belangrijkste resonantie is afkomstig van protonen (resoneren niet allemaal bij dezelfde frequentie, is afhankelijk van afscherming door omringde elektronen (hangt ervan af aan wat het gebonden is).) ➔ extern magnetisch veld moet verhoogd w om zelfde resonantie te krijgen. Hoe sterk die elektronen de kern gaan afschermen hangt af v/h atoom waar ze aan vasthangen -> hangt van de elektonegativiteit van het atoom af) Hoe een kleinere EN-waarde een atoom heeft, hoe beter het afschermt. Chemische shift moet vergeleken met iets worden: 1. Tegenover alleenstaande H ➔ molecule weinig afgeschermd ➔ voelen magnetisch veld het beste ➔ niet mogelijk want H komt niet alleen voor 2. Tegenover h gebonden aan atoom met laagste EN-waarde ➔ molecule maximaal afgeschermd ➔ voelen magnetisch veld het minste METEN VAN CHEMISCHE SHIFT TEGENOVER INTERNE STANDAARD Interne standaard= Tetramethylsilaan (TMS) -> methode 2 (EN-waarde = 0) 16 OUTPUT NMR BEPALING Op x-as: chemische shift Op y-as: intensiteit Zowiezo staat op 0 TMS Protonen met een goede afscherming liggen dicht bij de nul terwijl protonen met een slechte afscherming er ver van liggen → toenemend extern magnetisch veld ← toenemende frequentie nodig om te resoneren NMR SPECTRUM Metingen met twee andere magneet gedaan. Duidelijk verschil in absolute waarde van de radiogolven. Maar chemische shift hangt niet af van de soort magneet. Altijd kijken naar de chemische shift ipv de absolute waarde!! SPIN-SPIN KOPPELING = zwakke interacties tussen de kernen Naburige kernen van het molecule hebben een invloed op elkaar -> splitsen elkaars resonantielijnen op -> resultaat: meerdere piekjes Hoeveel pieken? Regel is: aantal naburige protonen i/d kern + 1 Bv: 2 naburige protonen i/d kern +1= 3 pieken Bv: 3 naburige protonen i/d kern + 1= 4 pieken 17 Op de x-as: chemische shift ONDERDELEN APPARATUUR NMR spectrofotometer 2 soorten toestellen: Magneet constant, radiogolven variabel Magneet variabel, radiogolven constant ➔ meest gebruikt (continuous wave (WV)) Rekening houden met solvent: staal oplossen in een solvent dat zelf geen protonen bevat H vervangen met deuterium -> D2O Solvent heeft ook een invloed op de plek waar de pieken voorkomen in het spectrum -> goed weten welk solvent je gebruikt en welke invloed het heeft! TOEPASSINGEN Identificatie o o Bio-organische structuurbepalingen Biomedische toepassingen: − MRI-toestel 18