Pruebas bioq. gram negativas PDF

Rojo metilo (RM/VP) Principio El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido pirú...

Rojo metilo (RM/VP) Principio El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido pirúvico producen ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es útil para la diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo). Rojo metilo Procedimiento y resultado: Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP. Incubar a 35º C por un mínimo de 48 horas. Agregar 5 gotas del indicador rojo metilo y observar si hay cambio de color. Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo. Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja. Voges-proskauer Principio El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido pirúvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de VogesProskauer (VP) detecta estos productos metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de alfa-naftol antes del agregado de KOH. Procedimiento y resultados: Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo de RM/VP Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horas Agregar unas gotas del reactivo de alfa-naftol Agregar unas gotas del reactivo de KOH Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos Observar la formación de un color rosado a rojo SIM (H2S, indol y motilidad) Determinar si la bacteria a través de Triptofanasas puede degradar el Triptófano a indol. Determinar si hay producción de H2S a partir de aminoácidos azufrados dando como resultado un color negro Determinar si la bacteria es móvil mediante la difuminación de la misma hacia los lados, de lo contrario, la bacteria sólo crece en la línea de inoculación. Principio del Indol El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+)de Salmonella (-). Procedimiento y resultados Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular en el medio SIM. Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas. Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el medio y el reactivo. Si el ensayo es negativo no hay cambio del color hay un color amarillo en la interfaseolor, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas. Medio SIM (gas sulfhídrico, indol y motilidad) Prueba de la urea Principio La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por acción de la ureasa da 2 moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del medio. Es una actividad característica de especies de Proteus y se usa para diferenciar por ejemplo: Klebsiella (+) de Escherichia coli. Procedimiento y resultados Con un asa estéril se toma abundante material y se inocula por punción Se incuba a 37ºC y se efectúa la lectura. Ensayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del mismo. Ensayo negativo: no hay cambio de color. Prueba de la urea Agar Kligler Principio El agar de Kller contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán productos alcalinos y el medio permanecerá rojo. La producción de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. Resultados Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, lactosa (E. coli) Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente (Shigella spp.) Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomona aeruginosa) Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp) Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.) Medio Kligler 3.Fermentador de lactosa y gluocas con producción de gas 1.Sin inocular 2.A/A Fermentador lactosa y glucosa 5. K/A fermentador de gluocas con producción de gas sulfhídrico 4.K/A fermentador de glucosa Kligler Prueba del citrato Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y azul de bromotimol como como indicador de pH. Únicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrán multiplicarse en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos) que junto con la eliminación de citrato (ácido) generará una fuerte basificación del medio que será aparente con un cambio de color del indicador de pH de verde a azul. Procedimiento Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul. Resultados (+)Klebsiella spp , ( - ) Escherichia Coli Prueba del citrato Prueba del malonato El caldo con malonato se emplea para diferenciar enterobacterias del grupo de Enterobacter de bacterias del grupo de Escherichia; los primeros son capaces de utilizar malonato como única fuente de carbono, produciendo una reacción alcalina y cambio de color del medio al azul. Si no se aprecia viraje de color la reacción es negativa. composición: Prueba de la lisina (carboxilasa-dihidrolasa) Principio La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. La decarboxilación de lisina da cadaverina (diaminas). El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda por ejemplo en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter Procedimiento y resultados: Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos Incubar a 37ºC Efectuar la lectura. Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo) Prueba de la Lisina descarboxilasa 1. Tubo sin inocular. 2. Lisina positivo, productora de gas sulfhídrico. 3. Lisina negativa, no productora gas sulfhídrico- Prueba de la fenilalanina Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un ácido carboxílico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen ácido fenilpirúvico que con Fe3Cl en solución ácida produce un color verdoso ( resultado positivo) y cuando es negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo). SISTEMA API PARA ENTEROBACTERIAS Sistema que permite obtener todos los resultados de las mismas pruebas realizadas arriba, de manera simultánea, rápida y con una menor cantidad de muestras y reactivos.