Péptides et Protéines - Biochimie - LAS 09/2024 PDF

PEPTIDES ET PROTÉINES BIOCHIMIE - LAS - 09/2024 Dr. Mathilde BAS  2 Introduction Les protéines sont des macromolécules essentielles à toutes les fonctions biologi...

PEPTIDES ET PROTÉINES BIOCHIMIE - LAS - 09/2024 Dr. Mathilde BAS  2 Introduction Les protéines sont des macromolécules essentielles à toutes les fonctions biologiques. Rappel : macromolécule = molécule carbonée de grande taille, de poids moléculaire élevé (supérieur à 5000 daltons) et qui sont en général des polymères, i.e. une structure répétitive faite de motifs élémentaires ou monomères liés par liaisons covalentes. un dalton = 1g.mol-1(= 1,66x10-24 g) L’ensemble des protéines présentes dans une cellule (ou un organisme) s’appelle le protéome. Chez l’Homme, il existerait entre 80 000 et 400 000 protéines différentes selon les études. Les fonctions très variées des protéines sont inscrites dans leur structure tridimensionnelle, i.e. dans la distribution spatiale de leurs atomes. Cette structure 3D permet aux protéines de reconnaitre, lier, transporter ou modifier d’autres molécules.  3 Introduction Ainsi, les protéines peuvent jouer : des rôles structuraux via la capacité de s’assembler entre elles pour former des assemblages dynamiques : fibres de collagène de la matrice extracellulaire, cytosquelette des rôles de transporteurs : perméase au glucose et canaux ioniques de la membrane plasmique, hémoglobine et transport de dioxygène, lipoprotéines et transport de lipides… un rôle de catalyseurs avec les enzymes qui se lient sélectivement à un substrat et permettent les réactions du métabolisme cellulaire un rôle dans la communication intercellulaire : de nombreuses hormones sont des peptides ou des protéines (insuline, glucagon) et les récepteurs à ces molécules informatives sont également des protéines certaines protéines, en se liant à l’ADN, permettent l’expression de groupes de gènes et sont donc un facteur clé de la régulation de l’expression génétique…  4 Introduction Sur le plan biochimique, les protéines sont des composés dits quaternaires constitués principalement des 4 atomes C, H, O et N. Ce sont des hétéropolymères d’acides aminés. Rappel : hétéropolymère = polymère formé de l’assemblage de monomères différents exemples : protéines, acides nucléiques (hétéropolymères de nucléotides) Les acides aminés sont liés par liaisons covalentes = liaisons peptidiques selon une séquence particulière qui est le reflet de l’information génétique portée par la séquence en nucléotides de l’ADN (cf code génétique).  5 Introduction Peptides et protéines : quelle différence? Il s’agit d’une différence de taille. Ainsi, on parlera d’oligopeptide si le nombre d’acides aminés constitutifs de la molécule est inférieur à 10, de polypeptide jusqu’à 100 acides aminés (limite supérieure variable selon les sources) et de protéine pour un nombre plus grand de monomères. L’insuline est considérée selon les auteurs comme un peptide ou comme une protéine. Elle est désignée en général comme étant une hormone peptidique. Elle comprend 51 acides aminés. Dans la suite du cours, on parlera indifféremment de polypeptide ou de protéine.  6 Plan du cours I - Une protéine est constituée d’un enchaînement linéaire d’acides aminés : les propriétés de la liaison peptidique II - La conformation des protéines et son origine III - Exemples de la myoglobine et de l’hémoglobine : mise en relation structure- fonction  7 I - Une protéine est un enchaînement linéaire d’acides aminés : les propriétés de la liaison peptidique  8 A - Les acides aminés, monomères des peptides et des protéines Rappel sur la formule générale d’un acide α-aminé La formule montre une fonction acide carboxylique (COOH ou COO- en fonction du pH cellulaire) et une fonction amine (NH2 ou NH3+) liées au même carbone dit α. La chaîne latérale ou radical R est propre à chacun des 20 acides aminés.  9 B - Formation de la liaison peptidique Deux acides aminés (aa) peuvent se lier par condensation de la fonction acide de l’un avec la fonction amine de l’autre. Cette liaison covalente, appelée liaison peptidique, est une liaison amide. Formation de la liaison peptidique Quand n acides aminés sont enchaînés, le polypeptide formé possède une extrémité N-terminale (appartenant à l’aa de rang 1, dont la fonction amine n’est pas engagée dans la liaison peptidique) et une extrémité C- terminale (appartenant à l’aa n dont la fonction acide n’est pas engagée dans la liaison peptidique). Un aa impliqué dans une liaison peptidique est appelé résidu d’acide aminé. Les fonctions acide et amine étant engagées dans les liaisons, ce sont les radicaux d’acides aminés qui donnent à chaque protéine sa fonction et ses propriétés particulières. Chaque polypeptide/protéine est donc caractérisé par sa séquence en acides aminés, lue de N vers C, et qui établit un premier niveau structural appelé structure primaire.  10 C - Propriétés de la liaison peptidique La liaison peptidique est un hybride de résonance entre deux formes limites mésomères. La distance séparant les atomes C et N est intermédiaire entre celles d’une simple et d’une double liaison. Cette double liaison partielle empêche toute rotation autour de l’axe C-N : les 4 atomes C, O, N et H de la liaison et les 2 Cα voisins sont dans un même plan : ils sont coplanaires.  11 L’angle de torsion autour de C-N (appelé angle Ω) ne peut donc que prendre des valeurs proches de 0° : configuration cis (les 2 Cα sont du même côté de la liaison peptidique) ou proches de 180° : configuration trans (les 2 Cα sont de part et d’autre de la liaison). La configuration trans est favorisée car elle engendre moins de répulsion entre les atomes des chaînes latérales des résidus d’aa voisins.  12 La liaison peptidique est polaire de par l’effet de résonance et les différences d’électronégativité entre O et N. D’où la création possible de liaisons hydrogène fondamentales pour l’établissement des structures d’ordre supérieur au sein des protéines. Caractéristiques de la liaison peptidique Un polypeptide s’apparente donc à un collier de plaques rigides. Les seuls mouvements possibles sont réalisés autour des Cα.  13 II - La conformation des protéines et son origine  14 A - Quatre niveaux structuraux pour les protéines 1 - La structure primaire Comme expliqué en I, il s’agit de la séquence en acides aminés, de l’extrémité N à l’extrémité C de la chaîne polypeptidique. 2 - La structure secondaire, conséquence des propriétés de la liaison peptidique La rigidité de la liaison peptidique ne permet des rotations qu’entre le Cα et l’azote amide (liaison Cα-N) selon un angle noté phi Φ d’une part, et entre le Cα et le carbone carbonyle (liaison Cα-C) selon un angle noté psi ψ d’autre part.  15 Ainsi, la conformation de la chaîne polypeptidique est déterminée par une paire d’angles Φ et ψ pour chaque acide aminé. Lorsque plusieurs résidus d’aa successifs ont les mêmes couples (Φ, ψ), cela détermine une conformation régulière de la chaîne polypeptidique. Ce sont des conformations hélicoïdales droites, dites α, ou des conformations formées à partir de brins β, dites en feuillets plissés β. Ces conformations sont stabilisées par des liaisons hydrogène qui se créent entre les groupes CO et NH. Ces deux conformations, hélice α et feuillet β, sont présentes dans toutes les chaînes polypeptidiques et constituent la structure secondaire des protéines.  16 Caractéristiques de l’hélice α enroulement le plus souvent dextre (enroulement à droite de l’extrémité N vers l’extrémité C) de la chaîne polypeptidique sur elle-même en une structure hélicoïdale due à des valeurs des angles de torsion Φ+ψ = -100°. stabilisation forte par des liaisons H se créant entre le O du CO d’un résidu n et le H du NH du résidu (n+4). Ces liaisons H sont pratiquement parallèles à l’axe de l’hélice. Les chaînes latérales pointent vers l’extérieur de l’hélice. 3,6 résidus d’acides aminés par tour pour un pas de 0,54 nm longueur moyenne de 10 résidus (soit 3 tours environ) Représentation d’une hélice α Les radicaux situés à l’arrière-plan de la chaîne ne sont pas représentés.  17 Caractéristiques des feuillets plissés β Ils sont constitués de plusieurs brins (entre 2 et 15). Chaque brin a une conformation étirée et est lié au brin voisin par les liaisons H entre CO d’un brin et NH de l’autre brin. Les chaînes latérales sont projetées de façon alternée vers le haut et vers le bas de l’axe central du feuillet. Représentation d’un feuillet plissé β Le feuillet β est beaucoup moins extensible que l’hélice α.  18 Les feuillets β sont de deux types : feuillet β parallèle (angles Φ et ψ respectivement autour de -119° et + 113°) feuillet β antiparallèle (angles Φ et ψ respectivement autour de -139° et + 135°) A noter que les liaisons H sont disposées perpendiculairement aux brins dans les feuillets antiparallèles, rendant ceux- ci plus stables que les feuillets parallèles où les liaisons H sont régulièrement espacées mais inclinées (compte-tenu des valeurs de Φ et ψ).  19 Notion de coudes et de boucles Le plus souvent, une protéine contient des hélices et des feuillets qui sont reliés par des séquences de conformation irrégulière et de longueur variable (entre 2 et une vingtaine d’acides aminés) formant des coudes (impliquant quelques résidus d’aa seulement) et des boucles (de longueur plus importante). Coudes et boucles permettent les changements de direction de la chaîne polypeptidique, d’où des protéines de forme compacte dites protéines globulaires. Ces coudes et boucles contiennent très souvent des glycine et des proline (cf diagramme de Ramachandran de ces deux aa). Boucles et coudes participent souvent à la formation des sites de reconnaissance, des sites de liaison et des sites actifs des protéines.  20 3 - La structure tertiaire La structure tertiaire d’une protéine résulte du rapprochement dans l’espace de résidus d’aa parfois éloignés dans la structure primaire. Elle correspond à l’organisation tridimensionnelle biologiquement active (forme dite native) de la protéine. Ce reploiement est permis grâce aux structures secondaires et supersecondaires mais aussi via la mise en place de liaisons faibles entre résidus d’aa : liaisons H, liaisons ioniques, interactions hydrophobes et forces de Van der Waals. 4 - La structure quaternaire Certaines protéines sont constituées de l’association de plusieurs chaînes polypeptidiques (identiques ou non) ou protomères (encore appelées sous-unités). Cette association résulte le plus souvent de liaisons non covalentes et parfois covalentes (formation de ponts disulfure interchaînes). La protéine peut être associée à un ou plusieurs groupements non protéiques appelés groupements prosthétiques. Le nom donné à la protéine est fonction du nombre de protomères, de la nature identique ou non des protomères, et de la présence ou non d’un groupement prosthétique.  21 Exemple de l’hémoglobine 4 chaînes polypeptidiques : c’est donc un tétramère les 4 chaînes ne sont pas identiques (2 chaînes dites α et deux chaînes dites β) : c’est donc un hétérotétramère chaque chaîne polypeptidique est associée à un groupement prosthétique qui est ici un hème  22 Conclusion Les 4 niveaux d’architecture des protéines  23 B - Il existe deux grands types de protéines selon leur forme les protéines fibreuses qui s’agencent en édifices allongés : collagène, kératine, filaments d’actine… les protéines globulaires formant des ensembles compacts, souvent sphéroïdes : myoglobine, hémoglobine, immunoglobulines… La myoglobine, une protéine globulaire  24 Deux exemples de protéines fibrillaires Fibrilles de collagène (microscope électronique à balayage) Filaments d’actine (A) Photographie au microscope électronique à transmission (B) Organisation hélicoïdale d’un filament  25 C - Origine de la spécificité de la structure tridimensionnelle des protéines 1 - les expériences de dénaturation réversible d’Anfinsen sur la ribonucléase (124 aa, 4 ponts S-S) Lors de la renaturation de l’enzyme, les ponts S-S se reforment entre les mêmes cystéines que dans la forme native, donnant une seule conformation parmi les multiples possibles. L’information nécessaire au reploiement de la protéine et à l’acquisition de sa forme native fonctionnelle est donc contenue dans sa séquence en aa (structure primaire) et donc dans la séquence nucléotidique de l’ADN. On parle parfois de morphogenèse autonome.  26 Conclusion L’origine de la conformation tridimensionnelle et donc de la spécificité fonctionnelle des protéines dépend de leur séquence en acides aminés. Les mutations ponctuelles, affectant certains acides aminés clés des protéines et à l’origine de dysfonctionnements graves, renforcent cette conclusion (voir l’étude de l’anémie falciforme ou drépanocytose dans le III).  27 2 - modalités de reploiement d’une protéine globulaire Exemple du reploiement d’une protéine globulaire en milieu aqueux Ainsi, en milieu aqueux, les résidus hydrophobes seront au cœur de la protéine et les résidus hydrophiles en surface.  28 Exemple du reploiement d’une protéine membranaire Pour les protéines insérées dans les membranes cellulaires donc dans un environnement hydrophobe, le reploiement sera tel que les résidus d’aa hydrophobes seront en surface et les résidus hydrophiles au cœur de la protéine. Structure de la glycophorine A, protéine transmembranaire du globule rouge Les chaînes latérales hydrophobes des hélices α transmembranaires sont représentées en vert et en rose  29 3 - des modifications post-traductionnelles importantes pour la stabilité et l’activité des protéines Très souvent, les protéines globulaires sécrétées présentent des ponts disulfure intrachaînes entre résidus cystéine. Ces liaisons covalentes stabilisent la conformation native et la rendent moins sensible à la dénaturation. Le lysozyme, une protéine globulaire stabilisée par des ponts disulfure Principe de formation d’un pont disulfure (intrachaîne ou interchaîne) Après leur synthèse, de très nombreuses protéines sont glycosylées par fixation de résidus glucidiques, d’où la formation de glycoprotéines. Cette glycosylation, en modifiant et stabilisant la conformation de la protéine, participe à sa fonction.  30 III - Exemples de la myoglobine et de l’hémoglobine : mise en relation structure-fonction  31 1 - Myoglobine (Mb) et hémoglobine (Hb), deux hétéroprotéines globulaires pouvant se lier réversiblement au dioxygène La myoglobine est une protéine à structure tertiaire formée de 153 aa organisés en 8 hélices α, désignées de A à H. Les hélices E, F et C forment une poche dans laquelle se loge un groupement prosthétique, l’hème. Structure tridimensionnelle de la myoglobine : Modèle en ruban de l’oxymyoglobine l’hème est en rouge, les histidines E7 et F8 en bleu Elle existe sous deux formes : une forme désoxymyoblobine et une forme oxymyoglobine suite à la fixation d’O2.  32 Organisation de l’hème et liaison à O2 L’hème est formé d’un cycle tétrapyrrolique centré sur un ion ferreux Fe2+. Fe2+ peut établir 6 liaisons de coordination : 4 liaisons, situées dans le plan de l’hème, avec les atomes d’azote des 4 noyaux pyrroles et une 5ème liaison avec l’histidine de l’hélice F (F8) dite histidine proximale, qui attire Fe2+ hors du plan de l’hème. De plus, Fe2+ est en regard d’une histidine de l’hélice E (E7) dite histidine distale. L’espace entre Fe2+ et HisE7 est susceptible de fixer réversiblement O2. Ainsi, en présence d’O2, la désoxymyoglobine se transforme en oxymyoglobine, ceci s’accompagnant d’un mouvement du fer qui revient dans le plan de l’hème. Les 6 liaisons de coordination de Fe2+  33 Soit, en simplifiant : Représentation schématique Organisation de l’hème Conséquences de la liaison de Fe 2+ à O2 de la désoxymyoglobine et de sa liaison à la globine  34 L’hémoglobine est un hétérotétramère formé de 2 protomères α (α1 et α2) et de 2 protomères β (β1 et β2) associés par de nombreuses liaisons faibles. Chaque protomère a une structure tertiaire semblable à celle de la myoglobine et chacun des 4 hèmes fixe O2 comme vu pour Mb. Représentation schématique de Hb Structure de l’hémoglobine et des liaisons entre protomères  35 2 - rôles biologiques de la myoglobine et de l’hémoglobine Ces rôles peuvent être compris grâce à la courbe de saturation (établie expérimentalement) qui donne le pourcentage de saturation de Mb ou Hb en fonction de la pression partielle en O2. L’allure des courbes pour Mb et Hb est différente : hyperbolique pour Mb, sigmoïde pour Hb. On définit pour chacune des protéines la P50, valeur de la PO2 pour laquelle le pourcentage de saturation est de 50%. Plus P50 est petit, plus l’affinité pour O2 est grande. Courbes de saturation de Mb et Hb  36 L’allure sigmoïde de la courbe de saturation de Hb traduit une affinité variable de Hb vis-à-vis de O2 (fixation difficile de O2 à faible PO2, puis de plus en plus facilement quand PO2 augmente, jusqu’à saturation). Ces propriétés font de l’hémoglobine un excellent agent de transport, qui se charge en O2 au niveau des poumons et libère O2 au niveau des tissus en activité. La myoglobine présente une affinité forte (P50 faible) et constante pour O2. Elle assure ainsi un stockage de O2 pour les cellules musculaires.  37 3 - un exemple d’hémoglobinopathie : l’anémie falciforme ou drépanocytose L’anémie falciforme est une maladie génétique récessive touchant environ 50 millions de personnes dans le monde. Les globules rouges falciformes (en forme de faux) contiennent une hémoglobine Hb différente de l’Hb normale (dite Hb A), dénommée Hb S (S pour Sickle = faucille). Globules rouges d’individus sains (à gauche) et d’individus drépanocytaires (à droite) Electrophorèse en conditions non dénaturantes d’hémoglobine d’individus sains (1) et d’individus drépanocytaires hétérozygotes (2) et homozygotes (3)  38 Les chaînes β de HbS présentent une valine à la place d’un glutamate en position 6. Ce changement est dû à une mutation ponctuelle dans le gène de la β globine. L’étude comparative de HbA et de HbS montre que ni l’affinité pour O2, ni les propriétés allostériques de HbS ne sont modifiées. De même, la solubilité de l’oxyHb S est inchangée. En revanche, la solubilité de la désoxyHbS est très réduite. En effet, la substitution du glutamate, aa hydrophile ionisable, par la valine, aa hydrophobe, fait apparaitre une bosse hydrophobe à la surface de la protéine. Cette bosse peut s’accoler à une aire hydrophobe d’une autre HbS (aire formée par les résidus Phe β85 et Leu β88) qui n’est extériorisée que dans la forme désoxy. Il se forme ainsi des fibres très insolubles au sein des hématies qui prennent la forme de faucilles, perdent leur souplesse, obturent les capillaires et créent des thromboses. Formules de la valine (A) et du glutamate (B)  39 Représentation schématique de la formation de fibres par polymérisation de la désoxyhémoglobine S  40 Conclusion La combinatoire des acides aminés étant quasi infinie (20n avec n nombre de monomères), les protéines présentent une diversité structurale qui conduit à une multiplicité de rôles puisqu’à chaque forme correspond une fonction déterminée. Les protéines sont des structures dynamiques (cf myoglobine et hémoglobine…) pouvant changer de forme de façon réversible suite à la fixation d’un ou de plusieurs ligand(s).