Immunocytochimie 2024/2025 PDF

Institut National de Formation Supérieure Paramédicale de Blida Enseignement du module d’Anatomie et Cytologie pathologiques IMMUNOCYTOCHIMIE Dr. W. ABDALLAH CHU BLIDA Année pédagogique 2024/2025  [ Plan : I. Introduction II...

Institut National de Formation Supérieure Paramédicale de Blida Enseignement du module d’Anatomie et Cytologie pathologiques IMMUNOCYTOCHIMIE Dr. W. ABDALLAH CHU BLIDA Année pédagogique 2024/2025  [ Plan : I. Introduction II. Types de prélèvements III. Éléments indispensables en ICC IV. Technique V. Préparation d’un cytobloc VI. Conclusion 1  I. Introduction : L’immunocytochimie (ICC) est une méthode d’analyse des cellules ou des molécules cellulaires par technique immunochimique Donc il s’agit d’une technique dont l’échantillon est une préparation cytologique Son principe consiste à utiliser un anticorps (Ac) couplé à un marqueur, visible par microscopie optique (MO) ou électronique (ME) Elle joue un rôle essentiel dans le Dc cytologique des masses tumorales Elle est parfois indispensable pour identifier une métastase ou classer une tumeur. II. Types de prélèvements : Différents types de prélèvements:  Matériel séché à l’air libre ou fixé (spray, alcool…) exp FCU  Cytoponction des ganglions, thyroïde, glandes salivaires…  Liquides émis (urines…)  Liquides recuillis: aspiration broncho-alvéolaire, LCR, pleurésie, ascite…  Cytologie en milieu liquide  Cytoblocs 1-Etalements cellulaires : -Prélèvements séchés à l’air libre -souvent d’aspect hémorragique -Souvent sur lames non adhésive -peuvent être réalisé au laboratoire (ex : liquide des séreuses, cytoponction gg, pulmonaire, thyroïde… ) 2-Cytocentrifugation : - Liquides des séreuses - LCR - Lavage Broncho-alvéolaire - kystes… Difficulté : avoir une bonne concentration des cellules sur les lames 2   Trop de cellules → risque de détachement  Peu de cellules → difficulté d’analyse Solution : comptage cellulaire exp Kovaslide : urines 3-Cytologie en milieu liquide -Prétraitement des lames pour augmenter l’adhésion cellulaire+++ -Si peu de cellules ramenées → cytocentrifugation (500μl/lame) 4-Cytoblocs  Plusieurs méthodes de préparation des cytoblocs  Difficultés : si très peu de cellules III. Eléments indispensables en ICC : Pour ICC on a besoin de: Lames Fixation Révélation antigénique 1-Lames pour ICC -Lames spéciales qui augmentent l’adhésion cellulaire -Surtout si révélation antigénique induite par la chaleur -Il existe plusieurs fournisseurs -Problèmes avec les frottis (Lames souvent non traitées, adhésion accrue si prélèvement hémorragique) 2-Fixation des lames: Frottis exp : air libre Fixation: par Acétone (4°C) 10 min Ou Ethanol (non souhaitable pour certains Ag ex: ER, pS100) Ou Méthanol, Formol… Lames mises à T ambiante pour 7 jours ou -20°C pour plusieurs mois 3 3-Révélation antigénique:  Pas nécessaire pour les cellules fixées par l’acétone ou l’alcool, pour les Ag membranaires et cytoplasmiques Mais  Peut réduire le bruit de fond et peut augmenter certains marquages  Obligatoire pour fixation au formol (enlève les ponts méthyléniques)  Obligatoire pour les Ag nucléaires  Révélation antigénique induite par la chaleur : Haute température 95-100°C 20 min ou 90°C 30 min ou 80°C 50min Bain marie+++ Micro-ondes  solution Alcaline (pH 8-9) +++ ou solution acide (Citrate pH 6)  Agent chelateur du Calcium (parfois Ag masqués par formation de complexes de Ca- formol) 4-Systemes de révélation:  Biotine : faux positifs avec biotine endogène (Foie, vessie, colon, thyroïde, sein…)  Phosphatase alcaline(PA): faux positifs avec PA endogènes (Placenta, intestin…)  Peroxydase : faux positifs avec peroxydase endogène (PNE, PNN, monocytes, erythrocytes…). Inhibée par le peroxyde d’hydrogène IV. Technique : Le protocole ICC comporte à la fois des étapes communes à toute technique cytologique (fixation, inclusion, coupes) et des aspects particuliers propres à l‘Ag, à l‘Ac et au système de révélation Technique "après inclusion" est la plus utilisée Les techniques "avant inclusion" nécessitent des traitements enzymatiques afin d'assurer l'accessibilité des Ac à leurs Ag)  Les systèmes de révélation se sont considérablement multipliés durant ces dernières années : variétés de fluorochromes, d'enzymes qui, selon leur 4  substrat, donnent un produit insoluble ou soluble différemment coloré ou des métaux lourds  Beaucoup d'entre eux sont commercialisés sous forme de Kits  Les marqueurs les plus utilisés: -Les fluorochromes, la férritine(ME), -Radioéléments, l’or colloïdal et les enzymes (MO ou ME) V. Préparation d’un cytobloc : La création d’un bloc cellulaire est une alternative utile pour le Dc de certaines lésions (métastase, tumeur rare ou maligne) 5 Le cytobloc (ou cell bloc) permet de reconstituer l’architecture tissulaire indispensable au Dc Cette méthode permet d’enrober, dans un gel, un produit de cytoponction, le culot de centrifugation d’un liquide ou des micro-fragments tissulaires, afin de réaliser des coupes sériées pour coloration par l’HES, ou permettre la réalisation de réserve de cellules fixées en vue de techniques spéciales (colorations spéciales et/ou étude immunocytochimique) TDD : Mode opératoire pour un produit de cytoponction -Apres avoir réalisé les étalements conventionnels pour le Dc, le médecin préleveur rince le matériel restant dans l’aiguille soit dans du Hanks pour les prélèvements non hémorragiques, soit dans du Hanks/EDTA (anticoagulant) pour les prélèvements hématiques. -Au laboratoire, la suspension cellulaire est soumise à une centrifugation douce (1500 t/min pendant 5 minutes) -Si le culot obtenu est abondant : il est possible, après élimination du surnagent, de fixer directement le culot dans un volume suffisant de fixateur comme l’AFA coloré à la phloxine 0,25 % (5 minutes sont suffisantes pour fixer des cellules) -Apres centrifugation, le surnagent est éliminer, le culot remis en suspension dans un volume identique de gel d’agarose à 2 % et place à + 4 °C pendant quelques minutes pour accélérer la gélification -Lorsque celui-ci est suffisamment rigide, le récupérer à l’aide d’une pince (si nécessaire, ôter l’excès du gel entourant le matériel avec un scalpel) et le déposer dans une cassette identifiée entre deux mousse afin de suivre une procédure technique histologique standard -Il existe d’autres techniques comme le kit commercial CytoblockR de Shandon qui contient les cassettes et les réactifs nécessaires à la réalisation d’un cytobloc VI. Conclusion : -L’immunocytochimie est une méthode délicate -Les difficultés sont surtout liées aux prélèvements pauci-cellulaires -Méthode fiable car bonne corrélation IHC/ICC 6