Metabolisme i Regulació - Curs 2024-2025 PDF

Metabolisme i Regulació Curs 2024-2025 Metabolismo y Regulación (UVEG) Carmen Bañó ([email protected])  Classes de Teoria...

Metabolisme i Regulació Curs 2024-2025 Metabolismo y Regulación (UVEG) Carmen Bañó ([email protected])  Classes de Teoria – Panorama del metabolisme intermediari – L’ acetil-CoA i el cicle de l’àcid cítric – Metabolisme de hidrats de carboni en diferents tipus cel.lulars – Circulació intracel.lular i extracel.lular de lípids – Metabolisme de lípids – Metabolisme d’aminoàcids – Metabolisme de nucleòtids – Integració del metabolisme Metabolismo y Regulación (UVEG) 2  Classes Pràctiques Prof. Inmaculada Quilis Carmen Bañó – Isocitrat deshidrogenasa de llevat – Represió catabòlica per glucosa del gen de la fructosa 1-6 fosfatasa – Biosíntesi de glicogen en Escherichia coli – Adaptacions metabòliques al dejuni Metabolismo y Regulación (UVEG) 3  Classes d’Aula d’Informàtica Metatool: Càlcul d’una xarxa metabòlica senzilla Prof. Inmaculada Quilis Metabolismo y Regulación (UVEG) 4  Seminaris Anàlisi crític d’articles: Esta activitat, de caràcter obligatori, serà organitzada de forma conjunta amb la resta d’assignatures de tercer curs Seminaris d’investigadors convidats Metabolismo y Regulación (UVEG) 5 Metabolismo y Regulación (UVEG) Avaluació 6  Bibliografia D.L. Nelson y M.M. Cox Lehninger Principles of Biochemistry International Edition 8ª Ed (2021) C.K. Mathews, K.E. Van Holde, D.R. Appling y S.J. Anthony- Cahill Bioquímica 4ª Ed. Pearson (2013) K. Frayn & R. Evans. Human Metabolism. A Regulatory Perspective 4 ed. (2019) Wiley Blackwell T.H. Devlin, Bioquímica Libro de Texto con Aplicaciones Clínicas 4 ed (2019) Ed. Reverté, S.A. J. Peretó, R. Sendra, M. Pamblanco i C. Bañó. Fonaments de Bioquímica 5ed (2005) Universitat de Valencia. Metabolismo y Regulación (UVEG) 8 Metabolismo y Regulación (UVEG) 9 Metabolismo y Regulación (UVEG) 10  Panorama del Metabolisme Intermediari Tema 1 Metabolismo y Regulación (UVEG)  Organització Jeràrquica dels Sistemes Biològics Metabolismo y Regulación (UVEG) Life’s Complexity Pyramid, SCIENCE, 2002, 298:763 12  Per qué Estudiar Metabolisme És l’essència de la vida Té una enorme importància en Biotecnologia – Producció eficient de productes Té una enorme importància en Medicina – Malalties metabòlicas són origen de mortalitat – Enzims metabòlics i els seus reguladors s’estan convertint en dianes per a fàrmacs viables És el ‘network’ cel.lular que millor es coneix Metabolismo y Regulación (UVEG) – El metabolisme és el conjunt de las reaccions químiques que tenen lloc en un organisme (interconexió, regulació) 13 Metabolismo y Regulación (UVEG) Punts clau 14 Metabolismo y Regulación (UVEG) Punts clau 15 Metabolismo y Regulación (UVEG) Punts clau 16 Metabolismo y Regulación (UVEG)  Estratègia Bàsica del Metabolisme 2 tipus de rutes depenent de la finalitat – Catabòliques (degradació) alliberen energia – Anabòliques (síntesi) consumeixen energia Metabolismo y Regulación (UVEG) Un sistema biològic -eminentment isoterm- per a conduir processos vitals que requereixen energia utilitza l'acoblament entre processos de manera que part de l'energia es conserva com a energia d'enllaç químic (ATP) 18  Tipus de Rutes Metabòliques Les rutes catabòliques Les rutes anabòliques Metabolismo y Regulación (UVEG) són convergents són divergents 19  Sistema Metabòlic ‘bow tie’ Metabolismo y Regulación (UVEG) Bow ties, metabolism and disease, Trends in Biotechnology 2004, 22:446 20  Aproximacions en Estudis del Metabolisme Aproximació reduccionista – Estudi del sistema sencer a través de propietats de les seues parts Reaccions individuals (a) Estequiometria de moltes reaccions (b) Caracterizació d’enzims Mecanismes en cada etapa Mapes metabòlics No Explica – Què determina el flux de Genomes seqüenciats material en les diferents rutes? – És possible fer models que – Com es manté el balanç entre Metabolismo y Regulación (UVEG) poden explicar les reaccions producció i utilizació de metabòliques d’un organisme metabolits? Rutes definides Regulació i Control matemàticament, permeten construir una xarxa completa (c) 21  Mètodes per Estudis del Metabolisme Elecció del sistema experimental Mesura de concentracions de metabolits Mesura de activitats enzimàtiques Anàlisi de fluxos metabòlics Metabolismo y Regulación (UVEG) 22  Mètodes per Estudis del Metabolisme Elecció del sistema experimental – Organismes sencers; teixits i òrgans aïllats; talls de teixits; cèl.lules aïllades; cèl.lules permeabilitzades; sistemes lliures de cèl.lules; orgànuls aïllats; enzims aïllats Mesura de concentracions de metabolits Mesura de activitats enzimàtiques Metabolismo y Regulación (UVEG) Anàlisi de fluxos metabòlics 23  Mètodes per Estudis del Metabolisme Elecció del sistema experimental Mesura de concentracions de metabolits ‘In vivo’ poques tècniques analítiques – RMN, espectrofluorimetria, espectrofotometria, marcatge isotòpic Alliberament de metabolits a partir de les cèl.lules, parant totes les reaccions de forma ràpida i simultània – Canvis de pH, congelació ràpida amb nitrogen líquid (freeze-clamping), mescles amb disolvents orgànics – Mètodes sensibles i selectius per a la quantificació (concentració generalment baixa en mescles complexes) Anàlisi enzimàtic (reacció directa; reacció acoplada) Separació cromatogràfica (TLC, HPLC) Metabolismo y Regulación (UVEG) Inmunoassajos RMN Mesura de activitats enzimàtiques Anàlisi de fluxos metabòlics 24  Metabolòmica Metaboloma Té la responsabilitat de – conjunt de tots els metabòlits proporcionar una de baix pes molecular descripció detallada de (intermediaris metabòlics, les rutes metabòliques i hormones, molècules de la seua funció en senyalització, metabòlits secundaris) d'un sistema humans, animals, biològic (cèl·lula, teixit, plantes, i òrgan, organisme) en un microorganismes determinat estat fisiològic, És dinàmic, canvia de segon a Les rutes metabòliques són segon rutes bioquímiques Humans, 2500 metabolits específiques del (www.hmdb.ca) metaboloma Metabolismo y Regulación (UVEG) Plantes , 50.000 metabolits 25  Mètodes per Estudis del Metabolisme Mesura d’activitats enzimàtiques – Elecció de tampó, pH, força iònica, temperatura, concentració d’ enzim, sustrat, cofactors.. – Control de factors que afecten a l’activitat ‘in vivo’ Efectors, modificació covalent, pèrdua d’estructura intracel.lular, interaccions proteïna-proteïna.. Anàlisi de fluxos metabòlics (AFM) – Fluxos de captació de materials o eixida de productes (fàcil) Producció d’etanol en cèl.lules de llevat que metabolitzen glucosa Consum d’ O2 o producció de CO2 – Fluxos interns (no tan fàcil; presencia rutes paral.leles, ramificacions i cicles) Marcatge isotòpic 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 32P..) i detecció per radiactivitat; CG-EM; CL-E; RMN. Metabolismo y Regulación (UVEG) El flux es calcula a partir de determinacions del grau de marcatge de metabolits particulars front al temps 26  Anàlisi Estequiomètric de Fluxos Coneiximent d’estequeometria Diagrama de fluxos per a una xarxa senzilla de reaccions, sistema en estat estacionari (e.e.) – Concentració intracel.lular de v=w cada metabolit i flux constant u=q+r La suma de fluxos d’ ‘entrada’ per a cada metabolit igual a la suma de fluxos d’ ‘eixida’ (balanç de masses) p+q=r+v – Dificultats en la interpretació en xarxes més complexes w=p Experiments de marcatge isotòpic (13C- o 14C-glucosa) i interpretació basada en models matemàtics (xarxa mitjana al voltant de 1000 ecuacions no Si es poden mesurar dos dels sis fluxos Metabolismo y Regulación (UVEG) lineals) es pot resoldre el sistema d’ecuacions, v=u-r w=u-r p=u-r q=r 27  Control del Flux Metabòlic Els fluxos observats són reflex de l’acció conjunta de transcripció, traducció, activitat d’enzims, i els processos de regulació que els controlen – Enzims determinen els nivells de metabolits – Aquests influeixen en els fluxos metabòlics directament, o indirectament a través d’ interacció amb proteïnes Metabolismo y Regulación (UVEG) reguladores 28  Xarxes Metabòliques Xarxa metabòlica – Conjunt de tots els processos físics i metabòlics que determinen les propietats bioquímiques i fisiològiques d’una cèl.lula Reaccions químiques Interaccions reguladores – Correlació entre genoma i metabolisme permet reconstruir la xarxa de reaccions bioquímiques de molts organismes Metabolismo y Regulación (UVEG) Network metabòlic de Mus Musculus BMC Syst Biol 2007, 1:29 29 Metabolismo y Regulación (UVEG) Xarxes Metabòliques 30  Regulació i Control Els organismes mantenen el seu estat intern constant gràcies al flux de matèria i energia a través de les rutes metabòliques (equilibri dinàmic) Rutes metabòliques tendeixen a estat ‘quasi’ estacionari Enzims que catalitzen reaccions que estàn lluny de l’equilibri (etapa limitant de velocitat), més importants en regulació i control que les que estàn pròximes a l’equilibri – Una única etapa limitant de velocitat insatisfactori – Més de un enzim afecta al flux d’una ruta Metabolismo y Regulación (UVEG) Tots els enzims, en major o menor grau, participen en el control 31  Mecanismes Moleculars de Regulació Enzimàtica – Regulació lenta (hores o dies) Control de la síntesi/degradació de l’enzim Metabolismo y Regulación (UVEG) 32  Regulació mitjançant síntesi d’ E Metabolismo y Regulación (UVEG) 33  Mecanismes Moleculars de Regulació Enzimàtica – Regulació lenta (hores o diess) Control de la síntesi/degradació de l’enzim – Regulació mitjana (minuts o hores) Modificació covalent – Reversible (Fosforilació, Adenililació, Acetilació, ADP-ribosilación, Metilació, Miristilació,..) – Irreversible Metabolismo y Regulación (UVEG) 34  Tipus de Modificació Covalent d’Enzims Metabolismo y Regulación (UVEG) 35  Regulació per Fosforilació Reversible Fosforilació – Transferència de grup fosforil a grups –OH de Ser Thr o Tyr Catalitzada per proteïnes quinases – Sovint desencadenen efectes amplificats Desfosforilació Señal – Eliminació de grup fosforil Catalitzada per proteïna Metabolismo y Regulación (UVEG) fosfatasa 36  Mecanismes Moleculars de Regulació Enzimàtica – Regulació lenta (hores o dies) Control de la síntesi/degradació de l’enzim – Regulació mitjana (minuts o hores) Modificació covalent – Reversible (Fosforilació, Adenililació, Acetilació, ADP-ribosilación, Metilació, Miristilació,..) – Irreversible – Regulació ràpida (segons o minuts) Control al.lostèric Interacció amb altres proteïnes Associació/Dissociació Multimodulació Metabolismo y Regulación (UVEG) 37  Enzims Al.lostèrics Generalment contenen diversos centres i diverses subunitats – Centres actius – Centres reguladors Efectes de sustrat o moduladors – A través de canvis conformacionals en l’enzim V Efecte homotròpic – Entre centres equivalents Cooperativitat – Curves sigmoides [sustrato] – No sigueixen la cinètica de Michaelis-Menten Metabolismo y Regulación (UVEG) Efecte heterotròpic Estado R – De centres reguladors sobre V centres actius, al.losterisme Estado T [sustrato] 38  Activació i Inhibició Al.lostérica Inhibició Activació Metabolismo y Regulación (UVEG) Menor activitat i corba menys Major activitat i corba més sensible a la concentració de sensible a la concentració de sustrats sustrats 39  Mecanismes Moleculars de Regulació Enzimàtica – Regulació lenta (hores o dies) Control de la síntesi/degradació de l’enzim – Regulació mitjana (minuts o hores) Modificació covalent – Reversible (Fosforilació, Adenililació, Acetilació, ADP-ribosilación, Metilació, Miristilació,..) – Irreversible – Regulació ràpida (segons o minuts) Control al.lostèric Interacció amb altres proteïnes Associació/Dissociació Multimodulació Metabolismo y Regulación (UVEG) – Regulació temporal/espacial Disponibilitat de sustrat Compartimentalizació 40  Mecanismes de Regulació i Control Metabolismo y Regulación (UVEG) 41  Channelling És un procés de transferència directa d'un intermediari entre els llocs actius de dos enzims que catalitzen reaccions seqüencials en una ruta biosintètica. Metabolismo y Regulación (UVEG) 42  Channelling Metabolismo y Regulación (UVEG) Molecular Cell (2021) Pareek, V et al. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.030 43 Metabolismo y Regulación (UVEG) Channelling 44  Channelling Carbamoyl Phosphate Synthetase Metabolismo y Regulación (UVEG) Miles, E. W. et al. J. Biol. Chem. 1999;274:12193-12196 45  Channelling Tryptophan synthase alpha2beta2 complex Metabolismo y Regulación (UVEG) 46