Nukleotidai PDF

Nukleorūgštys I. Nukleozidai/nukleotidai Nukleorūgščių atradimas 1869 m. šveicarų gydytojas-onkologas J.F. Meischer iš leukocitų branduolių išskyrė rūgštinės prigimties medžiagą, kurią pavadino “nukleinu”. Išskirto “nukleino” cheminė-elementinė analizė parodė, kad šioje medžiagoje yra C, N,...

Nukleorūgštys I. Nukleozidai/nukleotidai Nukleorūgščių atradimas 1869 m. šveicarų gydytojas-onkologas J.F. Meischer iš leukocitų branduolių išskyrė rūgštinės prigimties medžiagą, kurią pavadino “nukleinu”. Išskirto “nukleino” cheminė-elementinė analizė parodė, kad šioje medžiagoje yra C, N, H, O ir P elementai. Tai laikoma nukleorūgščių atradimo data. 2 Nukleorūgščių sudėties tyrimas 1885-1901 m. Albrecht Kossel aprašo heterociklines bazes: adeniną, citoziną, guaniną, timiną ir uracilą. 1910 m. Nobelio premija fiziologijos ir medicinos srityje už nukleorūgščių ir baltymų tyrimus. 3 Nukleorūgščių sudėtis 1919 m. Phoebus Levene (Fišelis Levinas, gimęs 1869 m. Žagarėje), nustato nukleozidinius DNR komponentus. Levene yra žinomas dėl savo tetranukleotidų hipotezės, kurioje buvo teigiama, kad DNR sudaryta iš vienodo kiekio adenino, guanino, citozino ir timino. 4 Paveldimumo keitimas 1946 m. Hermann Müller gauna Nobelio premiją už genetinių efektų tyrimą, pasitelkiant jonizuojančią spinduliuotę. Parodė, kad genetine informacija galima manipuliuoti fizinių metodų pagalba. 5 Paveldimumo prigimtis 1933 m. Thomas Hunt Morgan gauna Nobelio premiją už įrodymą, kad chromosomose slypi paveldimumą lemianti informaciją. Parodė, kad ląstelinė informacija turi fizinę prigimtį. 6 Deoksinukleorūgštis kaip paveldimumo medžiaga 1944 m. Oswald Avery, Colin MacLeod ir Maclyn McCarty, kad DNR yra medžiaga, sukelianti bakterijų transformaciją. 1952 m. Alfred Hershey ir Martha Chase eksperimentais su baktoriofagais patvirtintino, kad DNR yra genetinė medžiaga. 7 DNR struktūros nustatimas 1949 m. Erwin Chargaff hidrolizuoja nukleorūgštis, ir nustato heterociklinių bazių ekvimoliariškumą - [A]=[T], [G]=[C]. 1953 m. James Watson ir Francis Crick sukuria dvigrandininės DNR spiralės struktūros modelį. 1962 m. skirta Nobelio premija fiziologijos ir medicinos srityje kartu su Maurice Wilkins. 8 Tolimesni tyrimai 1974 m. S.H. Kim ir kt. nustato tRNR-Phe kristalinę struktūrą. 1982 m. Thomas R. Cech aptiko RNR sugebėjimą be baltymų katalizuoti intronų pašalinimą. 1983 m. Sidney Altman aprašo ribonukleazės P katalitines sąvybes. 1989 metų Nobelio premija chemijos srityje už RNR katalitinių savybių tyrimą. Ada Yonath, Venkatraman Ramakrishnan, Thomas Steitz už ribosomų struktūros tyrimus 2009 metais suteikta Nobelio premija chemijos srityje. 9 Nukleorūgštys. Nukleorūgštys – didelės molekulinės masės biopolimerai, kurių monomerai yra nukleotidai. Yra dvi grupės: DNR – deoksiribonukleorūgštis, sudaryta iš deoksiribonukleotidų, sujungtų fosfodiesteriniais ryšiais RNR – ribonukleorūgštis, sudaryta iš ribonukleotidų, sujungtų fosfodiesteriniais ryšiais. DNR yra paveldimumo medžiaga. DNR dalis, koduojanti biologiškai aktyvaus produkto sintezę, yra vadinama genu. Geno produktas gali būti baltymas arba RNR. RNR turi daug didesnę įvairovę ir turi daugiau funkcijų. Svarbiausia iRNR funkcija yra perduoti DNR užrašytą informaciją į baltymo seką. 10 Nukleorūgščių sudėtis. Nukleozidai Nukleorūgštys Mononukleotidai Nukleozidai ir H3PO4 Azotinės ir Pentozė bazės 11 Nomenklatūra. Bazės: Purinai: adeninas, guaninas. Pirimidinai: timinas, uracilas, citozinas. Nukleozidai: adenozinas, uridinas, guanozinas, citidinas; deoksiadenozinas, timidinas, deoksiguanozinas, deoksicitidinas. Nukleotidai: adenilatas, guanilatas, citidilatas, uridilatas; deoksiadenilatas, deoksiguanilatas, deoksicitidilatas, timidilatas. 12 Nomenklatūra biochemiškai Nukleozidų, į kurių sudėtį įeina pirimidino bazės, pavadinimai baigiasi galūne –idinas, o purino bazių darinių – galūne –ozinas. Nukleotidų pavadinimai sudaromi prie nukleozido pridedant žodį fosfatas ir nurodant, prie kurio anglies atomo prijungta fosforo rūgšties funkcinė grupė. 13 Nukleotidai Nukleotidai yra nukleozidų ir fosforo rūgšties esteriai. Fosforilo grupė gali būti prijungta prie hidroksilo grupių, esančių prie 2’, 3’, 5’ anglies atomų. 14 Pirimidinai ir purinai Pirimidinas – heterociklinis organinis junginys, panašus į benzeną ir piridiną, turintis du azoto atomus 1 ir 3 šešianario žiedo pozicijose. Purinas – heterociklinis aromatinis junginys, susidedantis iš pirimidino žiedo, konjuguoto su imidazolo žiedu. 15 Heterociklinės bazės nukleorūgštyse Citozinas (Cyt), 4-amino-2- okso-pirimidinas. Timinas (Thy), 2,4-diokso-5- metil-pirimidinas. Uracilas (Ura), 2,4-diokso-5- pirimidinas. Adeninas (Ade), 6-amino- purinas. Guaninas (Gua), 2-amino-6- oksopurinas. 16 Minorinės bazės 17 18 Nukleobazių santykis DNR Chagraff’o taisyklės: A=T; G=C; A+G=T+C. 19  Pentozės RNR sudėtyje yra ribozė, DNR – deoksiribozę. Nukleotiduose vyrauja β-furanozės forma. Pentozės anglies atomai RNR ir DNR sudėtyje žymimi štrichais, siekiant atskirti juos nuo heterociklinių azoto bazių atomų. 20 Ribofuranozės žiedo konformacijos Ribofuranozės žiedas yra dažniausiai voko formos. Priklausomai nuo pakaitų gali turėti twisted konformaciją. Voko konformacijoje keturi iš penkių žiedo atomų yra vienoje plokštumoje (2' endo ir 3' endo). Twisted konformacijoje tris atomai yra vienoje plokštumoje (2' endo 3' exo ir 3' endo 2' exo). RNR ir A formos DNR aptinkama North (3' endo), o B formos DNR South (2’ endo). 21 Nukleozidai Nukleozidai yra N-heterociklinių bazių ir pentozės dariniai, susieti β-N- glikozidiniu ryšiu. Skirstomi į ribonukleozidus (RNR molekulėse) ir deoksiribonukleozidus (DNR molekulėse). Nukleozidai – baltos, kristalinės, gana blogai vandenyje tirpstančios medžiagos. Nukleozidų struktūroje esančios heterociklinės bazės sugeria UV šviesą. Nukleozidų sugerties spektrai charakteringi kiekvienai heterociklinei bazei. Sugertis priklauso nuo tirpalo pH, nes kinta heterociklinių bazių jonizacija, tuo pačiu keičiasi ir sugertis. 22 Nukleozidų anomerai Gamtiniai nukleozidai yra β anomerai. 23 Nukleozidai Glikozidinį ryšį sudaro pirimidino bazės N1 arba purino bazės N9 atomas ir ribozės arba deoksiribozės C1’ atomai. 24 Nukleozidų konformacija Gali būti syn- arba anti- konformacijų glikozidinės jungties atžvilgiu. Nukleorūgštyse dėl sterinių trukdžių vyrauja anti- konformacija. 25 Nukleotidai 26 Kiti nukleotidai – nukleozidų fosfatai ATP yra pagrindinis ir universalus energijos šaltinis; GTP dalyvauja baltymų sintezėje; CTP dalyvauja lipidų sintezėje; UTP dalyvauja angliavandenių metabolizme. 27 Cikliniai nukleotidai Aptinkami adenozin-3’, 5’-ciklofosfatų ir guanozin-3’, 5’-ciklofosfatų (cAMP ir cGMP). Veikia kaip antrinės signalinės molekulės. cAMP veikia metabolitinis reguliatorius bakterijuose, grybuose dalyvauja ląstelių susikalbėjime. 28 Nukleotidiniai kofaktoriai NAD+ oksidacijos ir energijos išgavimo reakcijos, ADP ribulozės donoras. NADP+ redukcijos reagentas, anti-oksidacinės reakcijos. FAD įvairios oksidacijos- redukcijos reakcijos, energijos išgavimas. KoA – svarbus aktyvuoti karboksirūgštis – riebalų rūgščių sintezė arba energijai išgauti. 29 Nukleotidų UV absorbcija 30 Cheminės savybės Tautomerizacija Rūgštinės – bazinės savybės Elektrofilinės reakcijos Nukleofilinės reakcijos 31 Tautomerizacija 32 Rūgštinės-bazinės savybės Nors vadinamos bazėmis, bazinės savybės silpnos. Rūgštinės savybės irgi silpnos. Fiziologinėmis salygomis nukleobazės yra neutralios. 33 Pirimidinų halogeninimas. Pirimidininiai nukleozidai halogenus (F, Cl ir Br) prisijungia bevandenėje terpėje, jodo prisijungimas vyksta sunkiau. Vykdant reakcijas vandenyje, susidaro tarpinis 5-halogen, 6-hidroksi pirimidinas, kuris lengvai dehidratuoja kaitinant arba naudojant rūgštinį katalizatorių. Taip gaunami 5-fluor-, 5-chlor-, 5- bromuridinas ir 5-fluor-, 5-chlor-, 5- bromcitidinas. 34 Brominimas Viena iš labiausių ištirtų reakcijų. Reakcija vyksta keliais etapais ir tam tikromis sąlygomis nukleobazė gali prisijungti du bromo atomus ir hidroksilo grupę. 35 Palengvintas pirimidinų halogeninimas NBS N-bromosukcinimidas SMBI natrio monobromo izocianuratas 36 Purinų halogeninimas Purininiai nukleozidai lengvai halogeninami vandeniniuose tirpaluose ir organiniuose tirpikliuose. Guanozinas lengviau halogeninimas nei adenozinas. 8-halogenpurinai yra gana nestabilūs junginiai ir lengvai hidrolizuojasi halogeninimo metu, suyrant imidazolo žiedui. Halogenus purino C8 padėtyje galima pakeisti kitais pakaitais. 37 Nitrinimas Nukleozidų nitrinimui reika aukštos temperatūros. Todėl nukleozide esančios angliavandenių hidroksigrupės turi būti apsaugotos nuo oksidacijos. Atitinkamus 5- aminonukleozidus galima gauti redukuojant 5-nitro- darinius. 38 Alkilinimas: metilinimas Kaitinant uridiną kartu su formaldehidu, esant druskos rūgščiai, vyksta jo 5- hidroksimetilinimas. Panašiomis sąlygomis citidinas nereaguoja. 5-hidroksimetilo dariniai gali būti paverčiami atitinkamais 5- metilnukleozidais hidrinant per platinos arba rodžio katalizatorių. 39 Nukleozidų reakcijos su aldehidais Jei reakcijos sąlygos yra nerūgštinės, gali vykti kitos reakcijos. Šarminėmis sąlygomis nukleozidų amino ir heteroazotai gali grįžtamai reaguoti su aldehidais ir ketonais. Labai perspektyvi procedūra yra aldehidų su papildomomis funkcinėmis grupėmis naudojimas kaip modifikavimo agentai. Glioksalio, pirotartaraldehido ir ketoksalio darinius galima oksiduoti perjodatu, po to redukuoti ličio aliuminio hidridu iki 2-N-alkilguanino darinių. 40 Azoto metilinimas Pirimidino ir purino darinių metilinimo reakcijos su diazometanu metu labai priklauso nuo reakcijos sąlygų. Guanozino suspensija eteryje su diazometanu, gaunama N1- metilguanozinas, o reakcija vandens- eterio terpėje suteikia N7- metilguanoziną. Citozino nukleozidai metilinami tik esant vandeniui, todėl gaunami N3 pakaitai. Nukleozidų polinkis sąveikauti su diazometanu vandens-eterio tirpaluose sumažėja taip: guanozinas ≈ uridinas > citidinas > adenozinas. 41 Metilinimo reagentai Be diazometano, bazių metilinimui taip pat naudojamas metilo jodidas ir dimetilsulfatas. Neutralioje terpėje guanozinas, adenozinas ir citidinas metilinami, o uridinas ir timidinas nereaguoja. Guanozinas alkilinamas, gaunant N7-metilguanoziną; esant kalio karbonatui pagrindinis reakcijos produktas yra N1- metilguanozinas. Adenozino metilinimas vyksta daugiausia N1, o citidino - N3. 42 Izotopiniai vandenilio atomų mainai Sparčiausiai keičiasi vandenilio atomai, prijungti su azotu, o su anglies atomais – daug lėčiau. Izotopo keitimas atgal į vandenilį taip pat vyksta greitai. Purino bazėse imidazolo žiedo anglimi (C8) vandenilis keičiasi lengviau nei kiti, o mainų greitis didėja didėjant terpės pH ir temperatūrai. Taip paženklinti nukleozidai naudojami atliekant biologinius eksperimentus, kurie paprastai atliekami esant neutralioms pH vertėms ir esant ne aukštesnei kaip 40 °C temperatūrai. Pirimidino dariniais vyksta energingesnėmis sąlygomis, vandenilis prie C5 keičiasi lengviau nei C6. 43 Acilinimas Labai priklauso nuo reakcijos sąlygų. Acilinant švelniomis sąlygomis acilinasi tik amino grupės. Kai reakcija vyksta intensyviomis sąlygomis (acilinimo reagento perteklius, aukšta temperatūra), acilinimas apima ne tik heterociklo amino grupę, bet ir heterociklinį azotą. Esant dideliam anhidrido pertekliui, acilinasi ir ribozės hidroksi grupės. 44 Hidroksi grupių acilinimas Galima parinkti tokias reakcijos sąlygas, kad acilinimo reakcijoje dalyvautų tik ribozės hidroksigrupės. Acilinimui naudojant acto rūgšties anhidrido perteklių, paprastai acilinamos visos pentozių hidroksigrupės: 5’, 3’ ir 2’, tačiau naudojant ekvimoliarinį anhidrido kiekį, acilinama tik 5’-hidroksigrupė. 45 Nukleotidų acilinimas Nukleotidų acilinimo metu susidaro anhidridas su fosfato grupe, kuris lengvai hidrolizuojasi. Uridino 3'-fosfato acilinimo produktas yra 5'-acetiluridino 2',3'-ciklinis fosfatas, o 2',5'-diacetilo darinio išeiga yra labai maža. Pridedant į reakcijos mišinį nukleofilą reaktingesnį nei hidroksi grupė, leidžia geros išeigos acetilintą produktą. 46 Deacilinimas Acetilintų nukleosidų savybių tyrimai parodė, kad jų amido jungtis lengvai nutrūksta esant amoniakui, tačiau išlieka stabilus šarminėje terpėje (pH > 12). Angliavandenių esterinius ryšius lengvai suardo tiek šarmai, tiek amoniakas. Acto rūgšties darinių atveju amido jungties stabilumas mažėja: guanozinas > adenozinas > citidinas. N4-acilintuose citidino 5’-fosfatuose amido stabilumas mažėja kintant acilo grupei: benzoil-> acetil-. 47 Hidrinimas Dviguba jungtis pirimidino nukleoziduose yra lengvai hidrinama. 5,6-dihidrodariniai gaunami su gera išeiga, esant rodžiui ant aliuminio oksido, taip pat kai naudojami platinos arba paladžio katalizatoriai. Citidino atveju reakcija gali vykti ne tik dvigubo ryšio redukcija. Todėl, kai norimas produktas yra 5,6- dihidrocitidinas, procesas turi būti atidžiai kontroliuojamas. Pirimidino nukleozidus galima redukuoti ir naudojant natrio skystą amoniaką arba natrio amalgamą vandenyje, tačiau tokiais atvejais susidaro sudėtingi redukcijos produktų mišiniai. Purino nukleozidai yra atsparūs minėtų reduktorių poveikiui. 48 Reakcijos su nitritine rūštimi Nukleozidai, turintys amino grupių heterocikle, paprastai reaguoja su nitritine rūgštimi. Reakcijos metu susidaro atitinkama diazonio druska, kurioje nevyksta teigiamo krūvio delokalizacija ir kuri lengvai disocijuojasi, kaip ir diazoalkilai, vandeninėje terpėje, sudarydama hidroksi darinį. Deaminuojant guanoziną, adenoziną ir citidiną, gaunamas atitinkamai ksantozinas, inozinas ir uridinas. 49 Sintezė. 50 Glikozidinio ryšio sudarymo ypatumai Svarbiausios problemos: bazių regioselektyvumas, α ir β anomerų santykis. Naudojant elektronų donorines grupes, pvz.: acetil, dominuos β anomeras. Tas neveikia su deoksiriboze. Norint gauti α anomerus, reikia naudoti nukreipiančias papildomas reakcijas. 51 Metalų druskų prijungimas Modifikuotas Fischer-Helferich metodas. Naudota sidabro druska. Naudota modifikuota nukleobazė, kuri paverčiama adeninu arba guaninu. 1957 m. Nobelio chemijos premija buvo skirta Lordui Aleksandrui R. Todui už jo darbą su nukleotidais ir nukleotidų kofermentais. 52 Metalų druskos Gyvsidabrio chlorido druskos padidina išeigą. Natrio druskos netoksiškos ir gera išeiga. Deja problema su regioselektyvumu. 53 Nukleofilinės reakcijos „Fusion synthesis“: aukštoje temperatūroje išlydomas blokuotas angliavandenis, nukleobasė ir Lewis rūgštis su žemu vakumu. Išeiga dažnai siekia apie 70%. Naudota dirbtinių bazių prijungimui. Ribavirinas yra antivirusinis vaistas, vartojamas RSV infekcijai, hepatitui C ir kai kurioms virusinėms hemoraginėms karštligėms gydyti. 54 Švelnesnės sąlygos Hilbert-Johnson procedūra pirma nukleofilinė reakcija. Turi problemų. Vorbrüggen arba silyl-Hilbert- Johnson procedūra vyksta kambario temperatūroje. Naudojama SnCl4 arba ZnCl2, TMSOTf su silil apsaugotomis grupėmis. Didėlė išeiga leido pritaikyti pramonei. Su purinais yra problemų. 55 Vieno puodo reakcija Sililintos heterociklinės bazės yra jautrios hidrolizei. Vieno puodo, vieno žingsnio sililinimo ir nukleozidų sintezės metodo sukūrimas buvo reikšminga pažanga. Trifluoracto rūgšties (TFA), trimetilsililchlorido (TMSCl) ir heksametildisilazido (HMDS) derinys sukuria trimetilsililtrifluoracetatą in situ, kuris atlieka tiek heterociklo sililinimą, tiek vėlesnį jo sujungimą su cukrumi. 56 Bazės formavimo reakcijos Naudojama, kai reikia neįprastų bazių: izobazių, karbociklinių bazių. Purinų atveju gauti N-7 bazę. 57 Transglikozilinimas Reakcijos metu cukraus fragmentas perkėliamas nuo vienos heterociklinės bazės prie kitos. Skirtas dažnai įvesti modifikuotus cukrus. Gali būti cheminis arba fermentinis. Išeiga priklauso nuo nukleobazių termodinaminės pusiausvyros. 58 Dezoksiribonukleozidų sintezė Iš dezoksiribozės gauti elektrofilai nesugeba sudaryti palankaus katijono, dėl to stereoselektyvi sintezė yra sunkesnė nei ribonukleozidų sintezė. Vienas būdas: ribonukleozido sintezė, po to 3‘ ir 5‘ hidroksi grupių apsauga, 2‘ hidroksi grupės pašalinimas per Bartono deoksigenaciją ir blokuočių pašalinimas. 59 Nukleotidų sintezė Nukleotidų cheminė sintezė - nukleozidų fosforilinimas. Nukleozidai turi po kelias hidroksigrupes, taigi prijungiant fosfatą prie reikalingos grupės, kitas (kurių nereikia fosforilinti) būtina blokuoti. Paprastai monosacharidų hidroksigrupės alkilinamos arba acilinamos. 60 Trukūmai Nukleozidų fosforilinimas nukleofilinė reakcija, todėl fosforilinimo reagento fosforo atomas turi turėti dalinį teigiamą krūvį, kad ji vyktų. Nei fosforo rūgštis, nei pirofosfatas nėra fosforilinimo reagentai. Fosfato molekulėje įvedami pakaitai, kurie atitraukia elektronus, tada padidėja fosforo elektrofiliškumas - tik tokie junginiai gali būti nukleozidų fosforilinimo reagentai. Fosforilinimui naudojami fosforo rūgšties halogenanhidridai, anhidridai, trivalenčio fosforo junginiai. Fosforilinimui galima naudoti fermentus: reakcija vyksta specifiškai konkrečiai pozicijai, kitoms nukleozidų hidroksigrupėms blokuočių nereikia. 61 Fosforilinimas halogenų anhidridais (POCl3) Naudojama fosforo oksichloridas POCl3. Gautas tarpinis reakcijos produktas hidrolizuojamas. Hidrolizės metu išsisskyria HCl, tad reakcijos terpė yra šarminė ir pridėdama 1,8-bis (dimetilamino) naftaleno, kad išvengtų glikozinio ryšio hidrolizės. Reakcijai būtina ribozės hidroksi grupių blokavimas. Yra patobulintas būdas, kuriam nereikia blokuočių. Naudojama trimetil arba trietil fosfato. 62 Trialkil fosfato įtaka reakcijai Pridėjus trimetil arba trietil fosfatų, susidaro nukleozido kompleksas, kurio 5’ hidroksi grupė tampa labiau nukleofiliška. Propil ir didesnės grupės trukdo šio komplekso susidarymui. 63 Fosforilinimas per fosforamidatų tarpininką 2,2,2-tribrometilfosforomorfolinochloridas panaudojamas sintetinant ribonukleotidus. 2,2,2-tribrometilo apsauginės grupės pašalinima su Cu−Zn in situ. Vėlesnė rūgštinė hidrolizė duoda 65−70% išeigos. 64 Sintezė per fosfodiesterio tarpinį produktą Naudojami fosfoesteriai. Dėl prastų elektrofilinių savybių reikia naudoti jungimo reagentus: dicikloheksilkarbodiimidas (DCC) arba triizopropilbenzensulfoniltetrazolidas (TPS-TAZ). Būtinos blokuotės ne tik angliavandeniui, bet ir bazėms. Išeiga gali būti nuo 79 iki 95 %. 65 Sintezė per cycloSal tarpinį produktą Naudojami modifikuoti salicilo rūgšties esteris/anhidridas. Fosforo junginiai gali būti V ar III valentingumo. Susidaręs junginys hidrolizuojamas šarminėmis sąlygomis. 66 Sintezė per 5′-H-fosfonato tarpinį produktą. Metodas yra alternatyvus monofosforilinimas rūgštims jautriems nukleozidams. Naudojamas N,O-bis(trimetilsililo) acetamido (BSA) perteklius, kad susidarytų bis(trimetilsilil)fosfitas. Vėlesnis (-)-(8,8-dichlorkamforilsulfonil)oksaziridino pridėjimas (DCSO) reakcijos mišinyje susidarė bis(trimetilsililas) fosfotriesteris, kuris galiausiai buvo hidrolizuotas, kad būtų pašalintas TMS grupes. 67 Polifosfatų sintezė Sintezei galima naudoti įvairius tarpinius aktyvius produktus, kaip fosforo oksichlorido darinius. Dėl reakcijos sąlygų nebūtinos blokuotės. Susidaręs tarpinis produktas turi būti hidrolizuojamas šarminėmis sąlygomis. Vietoj pirofasfato, naudojant fosfatą galima gauti difosfatus. 68 cycloSal tarpinis junginio naudojimas Dėl reakcijos sąlygų būtinos blokuotės. Susidaręs tarpinis produktas turi būti oksiduotas ir hidrolizuojamas šarminėmis sąlygomis. Vietoj pirofasfato, naudojant fosfatą galima gauti difosfatus. 69 Fosfato grupės aktyvavimas Jei nėra aktyvaus tarpinio produkto, galima pasigaminti naudojant aktyvuojančius reagentus. Blokuotės reikalingos ir bazėms. 70 Tiesioginis prijungimas Reikia prie 5’ grupės prijungti gerai nueinančią grupę. Dažniausiai naudojama toluensulfonilo grupė. Reakcijos išeiga yra patenkinama. 71 Fermentinė sintezė Išskiriama daug fermentų, kurie katalizuoja nukleozidų fosforilinimo reakcijas. Tokie fosforilinantys fermentai vadinami kinazėmis. Fosfato grupės donoru jie naudoja ATP, rečiau kitus nukleozidtrifosfatus. Galimi ir kiti fosfato donorai. Kinazės fosforilina tik 5’ hidroksigrupes. Blokuoti kitų grupių nereikia. Kai kurios (E. coli) fosforilina 3’-OH grupes, o bakterijų Serratia marcescens – 5’-OH ir 3’-OH grupes ribo- ir deoksiribo-nukleoziduose. 72 Jungtinis Prastai vyksta reakcijos su dirbtinėmis ir stipriai modifikuotomis bazėmis. 73 Nukleozidų ciklofosfatai Vienas iš papildomų junginių chemiškai fosforilinant be blokuočių. Skiedimas kalio šarmu. Išeiga 35-49 %. H-fosfanato aktyvavimas pivaloilchloridu. Būtinos blokuotės. Išeiga 65−82 %. 74 Nukleorūgštys II. DNR Pristato Algirdas Mikalkėnas Nukleorūgštys. Nukleorūgštys – didelės molekulinės masės biopolimerai, kurių monomerai yra nukleotidai. Yra dvi grupės: DNR – deoksiribonukleorūgštis, sudaryta iš deoksiribonukleotidų, sujungtų fosfodiesteriniais ryšiais RNR – ribonukleorūgštis, sudaryta iš ribonukleotidų, sujungtų fosfodiesteriniais ryšiais. DNR yra paveldimumo medžiaga. DNR dalis, koduojanti biologiškai aktyvaus produkto sintezę, yra vadinama genu. Geno produktas gali būti baltymas arba RNR. RNR turi daug didesnę įvairovę ir turi daugiau funkcijų. Svarbiausia iRNR funkcija yra perduoti DNR užrašytą informaciją į baltymo seką. 2 Fosfodiesterinis ryšis Nukleorūgštys yra nukleotidų linijiniai polimerai, kuriuose nukleotidai sujungti 3’,5’-fosfo- diesteriniais ryšiais. Seka skaitoma 5’ → 3’ kryptimi. 3 DNR. Pirminė struktūra DNR pirminė struktūra – deoksiribonukleotidų, sujungtų 3’,5’ fosfodiesteriniais ryšiais, seka. Tai nuoseklus monomerų išsidėstymas polinukleotidinėje grandinėje. pApCpGpTpA; pACGTA. 4 DNR pirminės sekos nustatymo būdai Klasikiniai – cheminis (Maxam-Gilbert) ir fermentinis (Sanger). Naujos kartos sekoskaita: fermentinių ir/arba biofizikinių aukšto našumo metodų kombinacijos. Nustatant DNR modifikacijas galima naudoti ir kitus metodus. 5 DNR antrinė struktūra. 1953 m. James Watson ir Francis Crick sukuria dvigrandininės DNR spiralės struktūros modelį. Remtasi: 1. Čargafo taisyklėmis. 2. Rengenostruktūrinės analizės duomenimis. 3. Kitais eksperimentais. 6 Watson ir Crick modelis DNR molekulė yra sudaryta iš dviejų polinukleotidinių grandinių. Grandinės antilygiagrečios. Bazės nukreiptos į spiralės vidų. Bazių plokštumos lygiagrečios viena su kita ir statmenos į spiralės ašį. Vienos grandinės bazė yra suporuota su kitos grandinės bazėmis. Adeninas su timinu, guaninas su citozinu. Spiralės žingsnis 3,4 nm, nuotolis tarp bazių plokštumų 0,34 nm. Spiralės žingsnyje telpa 10 bazių porų. 7 Bazių poros Timinas su adeninu sudaro 2 vandenilinius ryšius, citozinas su guaninu 3 vandenilinius ryšius. Fosfodiesterinis karkasas dalina bazių dalis į dvi dalis: didyjį ir mažajį griovelį. 8 Spiralės stabilumas Fosfato pK yra apie 2, tad fiziologinėmis sąlygomis, polinukleotidinė grandinė yra polianijonas. Palaiko: 1. Vandeniliniai ryšiai tarp bazių. 2. Hidrofobinė sąveika. 3. Stekingo sąveika. 4. Baziniai baltymai. 5. Dvikrūviai katijonai. 9 Modelio svarba Paveldimumas. Genetinės informacijos perdavimas. Genetinės informacijos realizavimas. 10 dgDNR replikacija B forma leidžia nuspėti pusiau- konservatyvią DNR replikaciją. Galimi ir kiti: konservatyvus ir dispersyvus. Į naują grandinę įvedus lengvesnius izotopus, CsCl ultracentrifugavimo metu būtų galima atskirti DNR tipus ir patvirtinti arba atmesti replikavimo tipus. 11 The Meselson – Stahl (1958) eksperimentas Bakterijos auginamas su 15N turtinga terpe tol, kol DNR tampa praturtinta 15N (sunki DNR). Pridėjus 14N šaltinio, stebima tarpinio sunkumo DNR (15N-14N). Auginant ilgiau, susidaro ir 14N-14N (lengvesnės grandinės). 12  Wilkins, Crick ir Watson Nobelio Premija, 1962. 13 Molekulinės biologijos gimimas Suformuluota Francis Crick 1958 metais. The Central Dogma. This states that once 'information' has passed into protein it cannot get out again. In more detail, the transfer of information from nucleic acid to nucleic acid, or from nucleic acid to protein may be possible, but transfer from protein to protein, or from protein to nucleic acid is impossible. Information means here the precise determination of sequence, either of bases in the nucleic acid or of amino acid residues in the protein. 14 Kitos hibridizacijos formos K. Hukstino (Hoogsteen) bazių poros. Geometrija labai skiriasi: A:T poros kampas tarp dviejų glikozidinių jungčių apie 80°, atstumas tarp C1′–C1′ 8,6 Å. Kai kuriais atvejais viena bazė pasisuka 180°. C:G ir A:T termodinamiškai pusiausvyros su Watson- Crick bazių poromis. 15 Triguba spiralė Turtingos T sekos grandinė gali per didįjį griovelį sąveikauti su dvigrandine spirale. Svarbios rekombinacijoje, transkripcijos valdyme, transliacijos valdyme. 16 G-quadruplex (G-kvadrapleksai) Būdingos G turtingoms sekoms. Stabilizuoja vienvalenčiai metalo jonai. Gali susidaryti iš vienos, dviejų ar daugiau skirtingų grandinių. Svarbus telemeruose, genų promotoruose. 17 Kitos formos Priklauso nuo aplinkos sąlygų ir partnerių (jungimosi su baltymais). 18 A formos DNR Susidaro iš B formos DNR, kai drėgmė sumažėja iki 75%. Struktūra relaksuoja į B formos DNR. Platesnė ir plokštesnė dešinio sukimo spiralė. 11,6 nukleotidų pilname apsisukime, 34 Å skersmens. Bazių porų plokštumos pasuktos 20° dvigubos grandinės ašies atžvilgiu. Gilus didysis griovys. Seklus mažasis griovys. Biologiniai pavyzdžiai: 3 nukleotidų segmentas aktyviame DNR polimerazės centre. Aptinkama Gram-teigiamų bakterijų sporose. 19 Z formos DNR Atrasta Wang ir Rich oligonukleotide d(CGCGCG). Sutinkama, kai purinas keičia pirimidiną aukštos joninės jėgos salygomis. Kairiojo sukimo dviguba grandinė. 12 Watson-Crick nukleotidų porų pilnam apsisukimui. 44 Å skersmens. Gilus mažasis griovys. Didžiojo griovio nėra. Nukleotidų poros apverstos 180°, lyginant su pozicijomis B formos DNR. Pasikartojantis motyvas sudarytas iš dviejų nukleotidų porų. Fosfatai išsidėstę zigzago principu. Identifikuoti Z DNR surišantys baltymai (ADAR1) ar atskiri baltymų domenai; tai nurodo, kad ši forma gali egzistuoti in vivo. 20 DNR spiralių parametrai Parametrai B DNR A DNR Z DNR Spiralės sukimosi kryptis Dešinioji Dešinioji Kairioji Bazių skaičius spiralės žingsnyje 10 11 12 Bazės pasisukimas spiralėje (°) 36 33 -30 Bazės pakrypimas ašies atžvilgiu 6 20 7 Glikozidinio ryšio konformacija Anti Anti Syn (purininės) Anti (pirimidininės) Deoksiribozės konformacija 2’-endo 3’-endo 3’ endo (purinai) 2’ endo (pirimidinai) Spiralės žingsnis 3,4 nm 2,8 nm 4,5 nm Atstumas tarp bazių plokštumų 0,34 nm 0,255 nm 0,37 nm 21 A, B ir Z formos 22 Žiedinė DNR Žiedinės (ciklinės) DNR molekulės neturi laisvų 5’ ir 3’ galų Žiedinės yra bakteriofago φX174 DNR, E.coli genominė, plazmidinės DNR,... 23 Kai kurių organizmų DNR 24 DNR superpiralizacija Superspiralizuotai DNR sudaryti ląstelėje reikalingi fermentai topoizomerazės. E.coli topoizomerazė, katalizuojanti superspiralizaciją, vadinama DNR giraze. Superspiralės susidarymui reikalinga ATP energija. Superspiralės iširimui - DNR relaksacijai - ATP energijos nereikia. 25 Topologijos aprašymas Topologija aprašoma naudojant linkio skaičiumi (linking number, Lk). Uždarai plasmidei 2100 bp Lk yra 200. Galimos neigiamai superspiralizuotos arba teigiamai superspiralizuotos. Kiti parametrai: writhe (Wr) ir twist (Tw). 26 Chromosomų tretinė struktūra. Chromatinas yra DNR ir baltymo kompleksas interfaziniame branduolyje, ji sudaro histonai ir nehistoniniai baltymai. Histonai yra mažos molekulinės masės baziniai baltymai. DNR ir histonų kompleksas vadinamas nukleosoma. Tolesnis susisukimas sudaro chromatino siūlą. Dar labiau susikondensavus DNR, formuojasi chromosoma. 27 DNR kondensacijos lygiai Žmogaus ląstelėje esančios DNR ilgis – apie 1,4 metro. Žmogaus ląstelės skersmuo – apie 50 mikrometrų. Žmogaus ląstelės branduolio skersmuo – apie 5 mikrometrai. 28 Bakterinės ląstelės nukleoidas Nukleoidas yra DNR ir bazinių, į histonus panašių baltymų, kompleksas. Ne visa DNR sąveikauja su baltymais. 29 DNR denatūracija DNR dvigubos spiralės išsukimas ir grandinių atskyrimas vadinamas denatūracija. 30 Fiziniai denatūrantai Kaitinimas virš 95 °C; Sonifikavimas; Malimas su stiklo rutuliukais; Švitinimas ultravioletiniais spinduliais; Jonizuojanti spinduliuotė. Cheminiai denatūrantai Chaotropai: guanidino hidrochloridas, karbamidas; Formamidas; Dimetilsufoksidas; Stiprios rūgštys ir šarmai. Hiperchrominis efektas Natyvios DNR sugertis yra mažesnė, negu denatūruotos DNR arba ekvimoliarinio nukleotidų mišinio sugertis 33 DNR lydimosi temperatūra Temperatūra, kuriai esant pusė DNR molekulės yra viengrandė, o kita pusė – dvigrandė, vadinama lydimosi temperatūra Tm. 34 DNR cheminės savybės DNR praskiesta rūgštimi depurinizuojama. RNR atspari praskiestai rūgščiai. DNR atspari bazėms. RNR bazėmis hidrolizuojama. 2’-hidroksilo grupė RNR molekulėje gali sudaryti vandenilinius ryšius, dalyvauti specifinėse cheminėse ir fermentinėse reakcijose. 35 UV sukelti produktai 36 Interkaluojantys reagentai Psoralenas yra natūralus junginys aptinkamas įvairiuose augaluose. Lengvai interkaluoja TA sekuose. Laktono žiedas būna virš timino, o furano žiedas po kitos grandinės timinu. Toks junginys esant UV spinduliuotei sudaro abduktus. 37 Deaminacija ir depurinizacija 10 000 per dieną vienoje ląstelėje 38 Kodėl DNR yra timinas? Jei DNR būtų uracilas, jis DNR dvigubėjimo metu hibridizuotųsi su adeninu. Deamininti citozinai taip pat hibridizuotųsi su adeninu. Laikui bėgant, tai salygotų vis mažėjantį G-C bazių porų kiekį. Ilgainiui visos G-C bazių poros būtų prarastos. Genetinis kodas redukuotųsi iki dviejų nukleotidų repertuaro. 39 Alkilinimas gali blokuoti bazių porų susidarymą 40 Reakcija su nesočiais aldehidais 41 DNR pažeidžiantys junginiai 42 „Crosslinking“ reagentai: busulfanas Naudojamas gydyti leukemijas. Labai toksiškas. Pagrindinis veikimo mechanizmas – alkilinimas ir „crosslinking“. 43 Aziridinio žiedas selektyviai alkilina DNR Panašus į Mustardo reagentą. Daug letesnė ciklizacija. Didesnis reakcijos greitis dgDNR, >50 nei su guanozinu, >7 nei su vgDNR. 44 Natūralus savižudžiai kancerogenai Afltoksinas B1 iš Aspergillus flavus. Veikiant kepenų citochromo P450 fermentams, įvedamas epoksido funkcinė grupė. Alkilina guanidino N7. 45 Ftakvuilozidas (ptaquiloside) Aptinkamas paparčio (Pteridium aquilinum) lapuose. Sukelia virškinimo trakto auglius. 46 Su mažuoju grioveliu sąveikaujantys toksinai Su mažuoju grioveliu lengvai sąveikauja plokšti oligomerai su besisukančiais ryšiais prie penkianarių žiedų. Modifikuoja adenino N3. 47 DNR cheminė sintezė Oligodeoksiribonukleotidai – viengrandininiai sintetiniai DNR fragmentai su žinoma (arba konkrečiai apibrėžta) nukleotidų seka. Oligonukleotidų ilgis būna nuo keliolikos iki keliasdešimt nukleotidų. Šiuo metu, ištobulėjus sintezės metodams, gali būti sintetinami ir ilgesni nei 100 nukleotidų ilgio DNR fragmentai. Sintetiniuose oligonukleotiduose gali būti ne tik keturi įprasti monomerai – deoksiribonukleotidai, kurių bazės: A, G, T ir C, bet įvairiai modifikuoti nukleotidai. 48 Funkcinių grupių blokavimas Oligodeoksiribonukleotidų cheminės sintezės metu būtina blokuoti šias funkcines grupes: amino grupes heterociklinėse bazėse (Ade, Cyt, Gua) deoksiribozės 5’ arba 3’ hidroksigrupes fosfatus (monoesteriuose ir diesteriuose) Reikalavimai blokuotėms: selektyviai įvedamos stabilios cheminės sintezės metu selektyviai pašalinamos Tarpnukleotidinių fosfodiesterinių ryšių sudarymui būtina naudoti aktyvuojančius agentus 49 Oligodeoksiribonukleotidų sintezės būdai Fosfodiesterinis metodas (H.G. Khorana, 1950 m.). H-fosfonato/fosfatotriesterinis metodas (A. Todd, 1950 m.). Fosfotriesterinis metodas (R. Letsinger, C. Reese, F. Cramar, 1960-65 m.). Fosfitinis/fosforamiditinis metodas (M. Caruthers, 1970 m.). 50 Fosfodiesterinis metodas Sintezei reikalingi du komponentai: nukleozidinis (hidroksilinis). Tai blokuotas nukleozidas arba nukleotidas su laisva 3’–OH grupe. nukleotidinis (fosfatinis). Tai blokuotas nukleotidas su laisva 5’ fosfatine grupe. Sintezei svarbu parinkti tinkamas blokuotes, nes vienas reikia pašalinti po kiekvienos sujungimo reakcijos stadijos, o kitos pašalinamos tik susintetinus norimo ilgio oligonukleotidą. Vienos blokuotės pastovios, kitos – laikinos. 51 G. Khorana metodas Blokuotės: Nukleozidinio komponento 5’-OH grupei – p-dimetoksitrifenilmetano blokuotė (tritilinė blokuotė); Nukleotidinio komponento deoksiribozės 3’-OH grupė acetilinama: -CO-CH3 (acetil-); Heterociklininių bazių (Ade, Cyt, Gua) amino grupės acilinamos: -CO-CH(CH3)2 (izobutilinė arba acetilinė blokuotė). Aktyvatoriai: DCC (dicikloheksilkarbodiimidas); TPS (triizopropilbenzsulfochloridas arba tozilchloridas); MS (mezitilensulfochloridas). Oligonukleotidinė grandinė ilginama 5’→3’ kryptimi. 52 5’-OH grupės blokuotė Deblokuojama 20% trichloracto rūgštimi. Dimetoksitritil yra stabilus oranžinės spalvos karbakatijonas. 53 Nukleotidinis komponentas Nukleotidinio komponento deoksiribozės 3’-OH grupė acetilinama. Deblokuojama šarminėmis sąlygomis. 54 G. Khorana reakcijos ypatumai Fosfodiesteriniu metodu paprastai sintetinami trumpi 5-10 monomerų oligonukleotidai Pagrindiniai metodo trūkumai: Pašalinės reakcijos, kuriose dalyvauja oligonukleotidų tarpnukleotidinio fosfato liekanos (grandinė šakojasi). Ilginant oligonukleotidinę grandinę, kiekvieno etapo metu gaunamos vis mažesnės išeigos Metodas brangus, didelės laiko ir reagentų sąnaudos 55 Fosfotriesterinis metodas Pakeitimai: Fosfatinė liekana blokuojama cianetiline blokuote CN-CH2-CH2-. Cianetilinė blokuotė nuo tarpnukleotidinio fosfato pašalinama veikiant baziniais reagentais (piridinu, trietilaminu, amoniaku, OH-). I-asis nukleozidinis komponentas - 5’-blokuotas nukleozidas fosforilinamas chlorfenilfosfatu (reikalingas aktyvatorius MS arba TPS). Susidaro 3’- fosforilintas nukleotidas. Prie fosforilinto I-ojo komponento pridedamas II-asis komponentas - nukleotidas su laisva 5’-OH grupe. Kondensacijos metu susidaro 3’→5’ fosfotriesterinis ryšys. Reikalingas aktyvuojantis reagentas. 56 Komponentų paruošimas 5’-blokuotas nukleozidas fosforilinamas chlorfenilfosfatu. Gaunamas tarpinis 3’- fosforilintas nukleotidas, kurio fosfato liekana dar blokuojama cianetilfosfatu cianetilchloridu. Iš šio junginio galima gauti “nukleozidinį” ir “nukleotidinį” komponentus: 57 Fosfotriesterinis metodo reakcijos Kondensacijos metu susidaro 3’→5’ fosfotriesterinis ryšys. Reikalingas aktyvuojantis reagentas. Cianetilinė blokuotė nuo tarpnukleotidinio fosfato pašalinama veikiant baziniais reagentais (piridinu, trietilaminu, OH-). 58 Blokuočių pašalinimas ir nuėmimas nuo nešiklio Tritilinės blokuotės pašalinimos 20% acto rūgštimi arba trifluoracto rūgštimi. Acetilinės blokuotės pašalinimos konc. amoniako vandeniu. Oligonukleotidų gryninimas; chromatografija, elektroforezė. 59 Fosfitinis/fosfoamiditinis metodas Šiuo metu oligonukleotidai sintetinami M. Caruthers išrastu fosfitiniu/fosfoamiditiniu metodu. Sintetinant oligonukleotidus fosfoamiditiniu metodu, naudojami trivalenčio fosforo junginiai, kurie yra labai aktyvūs, todėl tarpnukleotidinis ryšys susidaro greitai ir efektyviai. I-asis komponentas - 3’-fosfoamiditinis nukleotido darinys su blokuota 5’- OH grupe. II-asis komponentas - nukleozidas su laisva 5’-OH ir blokuota 3’-OH grupe. Kondensacijos reakcija vyksta labai efektyviai, susidaro tarpnukleotidinis trivalenčio fosfato darinys. Jis vėliau paverčiamas penkiavalenčiu. 60 Nukleotidinis komponentas Keli būdai pasigaminti. Naudojma bazė N-etil-N,N-diizopropilaminas (Hunig bazė). 61 Kietafazė sintezė Dabartinės oligonukleotidų sintezės ant polimerinio nešiklio (kietafazės sintezės) autorius – R.B. Merrifield Metodo privalumai: Lengva atskirti sintetinamą oligodeoksiribonukleotidą nuo reakcijos mišinio komponentų: nesureagavusių bei pašalinių medžiagų, aktyvuojančių reagentų. Galima naudoti reaguojančių medžiagų ir kondensuojančio reagento perteklių, tai padidina reakcijos išeigą. Sintezės stadijos atliekamos viename inde (kolonėlėje), todėl sumažėja reagentų nuostoliai. Sintezę galima automatizuoti, sukurti pirmieji (I-os kartos) sintezatoriai. 62 Pirmas nukleozidas DMT 5’-OH pozicijoje blokuotas pirmasis 3’ galo nukleotidas. Linkeriu per 3’-OH prijungtas prie kieto nešiklio (CPG – Controlled Pore Glass). 63 Aktyvavimas ir prijungimas Acenotrile aktyvuojamas rūgštinio azolo katalizatoriaus: 1H-tetrazolo; 5-etiltio-1H-tetrazolo; 2-benziltiotetrazolo; 4,5-dicianoimidazolo;... 64 “Capping” reakcija Nesureagavę nukleotidai (paprastai būna iki 2 %) acetilinami, siekiant išvengti jų dalyvavimo tolimesnėse reakcijose. Pašalina pašalinę reakciją guanozino depurinizaciją. 65 Sintezės pabaiga Veikiama koncentruotu amoniaku: Nuimti nuo kietos fazės nešėjo; Hidrolizuoti nukleobazių apsaugines grupes; Deblokuoti fosfatą saugantį cianetilą. Paskutinė tritilo grupė (5‘ gale) pašalinama TCA prieš arba po chromatografinio produktų gryninimo. Pastarasis būdas leidžia dar vieną gryninimo žingsnį ir taip užtikrina didesnį grynumą. Atliekamos papildomos reakcijos: oksidacija, sulfurilinimas ir kt... 66 Fosforo oksidacija jodu piridine Fosforamiditai lengvai oksiduojami silpnais oksiduojančiais reagentais, pavyzdžiui, vandeniniu jodu, esant silpnoms bazėms, arba vandenilio peroksidu, kad susidarytų atitinkami fosforamidatai. Kai jie liečiasi su sieros tirpalu arba sulfurilininčiais reagentais fosforamiditai sudaro fosforotioamidatus. Reakcijoje su selenu arba seleno dariniais susidaro fosforselenamidatai. 67 Pilnas sintezės ciklas 68 H-fosfonato/fosfatotriesterinis metodas Labai panašus į fosfitinį/fosfatotriesterinį metodą. Sujungimui naudojama pivaloilchloridas, 2,4,6- triizopropilbenzensulfonil chloridas (TPS-Cl) ar kiti.. 69 Vieno ciklo išeigos reikšmė 70 Sintetiniai oligonukleotidai Sintetiniai oligonukleotidai naudojami daugelyje molekulinės biologijos eksperimentų: Pradmenys DNR padauginimui PGR ar sekoskaitoje, mikrogardelių technologijoms; Mutacijų įvedimui genų inžinerijos būdu; Kaip analitiniai įrankiai, tiriant su DNR sąveikaujančių baltymų sąveikos mechanizmą; DNR fragmentų sintezė genų terapijai; Genų sintezė genomų inžinerijos darbams; Genomų rekonstrukcijai. 71 Fotolitografinė DNR sintezė Didelio kiekio oligonukleotidų sintezė (“DNA-chips”). Šviesos kontroliuojama sintezė. Principas pasiskolintas iš puslaidininkių pramonės. Atrankus 5'- (ar 3'-) blokų pašalinimas 365 nm bangos ilgio šviesa per fotolitografinę kaukę (fotoaktyvios blokuojančios grupės). Tik apšviestos grupės formuoja laisvą –OH grupę ir toliau dalyvauja sekančioje reakcijoje. Taip lygiagrečiai sintetinami tūkstančiai oligonukleotidų. Vienas oligonukleotidas paprastai sintetinamas 25 x 25 µm plote. Ant 10x10 mm paviršiaus ploto susintetinama iki 106 oligonukleotidų. 72 Sintezės principas 73 Komponentai Olignukleotidų sintezei naudojamas fosfitinis/fosfoamiditinis metodas. 5’ hidroksi grupė blokuota meta nitro benzenaldehidu. Visi žingsniai yra identiški. 74 Fotodeblokavimas 5’ blokuotė pašalinama apšvytinus 365 nm banga. Vyksta Wolff persitvarkimas. Trumpesnio nei 360 nm ardo nukleobazes. Pilnas deblokavimas įvyksta greičiau, nei per minutę. Pasiekiamas 90-95% efektyvumas vienam žingsniui: 20 nukleotidų fragmentų gaunasi tik 10% idealios išeigos. Hibridizacijai tai priimtina, nors ir lemia foninį (nespecifinį) signalą. 75 DNR sekoskaita. Svarbu: Molekulinei biologijai; Evoliucinei biologijai; Metagenomikai; Virusologijai; Medicinai; Teismo medicinos tyrimams… 76 Maxam ir Gilbert sekvenavimo metodas DNR sekos nustatymo metodas, sukurtas A. Maxam‘o ir W. Gilbert‘o 1976–1977 m. Šis metodas pagrįstas nukleobazei būdingu daliniu cheminiu modifikavimu ir vėlesniu DNR skaidymu, esančiose šalia modifikuotų nukleotidų. 77 G>A reakcija. Metilinimas destabilizuoja glikozidinį ryšį. (G > A) 78 G reakcija. 79 C+T reakcija. 80 C reakcija. 1 M koncentracijos NaCl padidina reakcijos specifiškumą citozinui. 81 Kitos reakcijos. 82 Sekos nustatymas. 83 Maxam ir Gilbert sekvenavimo metodas Privalumai: Sekvenuojama de novo. Trukūmai: Techninis sudėtingumas; Darbas su pavojingomis medžiagomis (hidrazinas ir kt.); Sunku padidinti našumą. 84 Sanger sekvenavimo metodas “plus ir minus” metodas (1975); Sekvenavimas su DNR terminuojančiais nukleotidais (1977); Modernus sekvenavimas. 85 Metodo esmė 86 Modernus variantas 87 Sanger sekvenavimo metodas Auksinis standartas. Sekvenavimo ruožas nuo 300 iki 1000 nukleotidų. Didelis tikslumas >99,99 %. Antros kartos sekvenavimo metodai. Trečios kartos sekvenavimo metodai. 88 Nukleorūgštys II. RNR Pristato Algirdas Mikalkėnas Nukleorūgštys. Nukleorūgštys – didelės molekulinės masės biopolimerai, kurių monomerai yra nukleotidai. Yra dvi grupės: DNR – deoksiribonukleorūgštis, sudaryta iš deoksiribonukleotidų, sujungtų fosfodiesteriniais ryšiais RNR – ribonukleorūgštis, sudaryta iš ribonukleotidų, sujungtų fosfodiesteriniais ryšiais. 2 RNR sudėtinės dalys RNR yra ribozė, tad turi 2’ hidroksi grupę. RNR viena iš heterociklinių bazių yra uracilas, kurį metilinant 5 pozicijoje gaunamas timinas. 3 RNR pirminė stuktūra RNR yra ribonukleotidų linijiniai polimerai, kuriuose nukleotidai sujungti 3’,5’-fosfo-diesteriniais ryšiais. Seka skaitoma 5’ → 3’ kryptimi. DNR: dA, dT, dC, dG. 4 RNR Ląstelėje RNR yra žymiai daugiau, nei DNR – tiek pagal masę, tiek molekulių rūšių kiekį. RNR sintetinama kaip viengrandininė molekulė, bet egzistuoja įvairių dvigrandininių struktūrų pavidale. RNR yra (žymiai) trumpesnė nei DNR. Yra daug RNR rūšių, skiriamų pagal dydį, struktūrą, atliekamas funkcijas etc. 5 RNR antrinė struktūra RNR nesuformuoja dvigrandininės struktūros, atitinkančios B formos DNR, dėl erdvinių apribojimų, dėl 2’-OH grupių. Dvigrandė RNR suformuoja į A formos DNR panašią struktūrą, vadinamą A-RNR arba RNR-11. Spiralė pilnai apsisuka per 11 bp. Plotis – 30,9 Å. Bazių poros su ašimi sudaro 16,7° kampą. Hibridiniai RNR-DNR dupleksai sudaro tarpines struktūras tarp A-RNR ir B-DNR. 6 RNR struktūriniai motyvai Stiebas-kilpa arba plaukų segtukas (angl. stem-loop or hairpin); Bučinio stiebas-kilpa (angl. kissing stem-loop); Pseudomazgas (angl. pseudoknot)... 7 tRNR antrinė struktūra Yra 76-93 nukleotidų ilgio. Turi iki 25% modifikuotų nukleotidų. Pasižymi dobilo lapo formos plokštumine išklotine. Visų tRNR 3’ gale yra CCA seka, prie kurios prijungiama aminorūgštis. 8 RNR tretinė struktūra Struktūra primena apversta L raidę. Kiekviena šaka apie 6 nm. Skersmuo nuo 2 iki 2,5 nm. Molekulė yra kompaktiška, stabilizuota neįprastais vandeniliniais ryšiais. 9 Neįprastos bazių poros 10 tRNR nukleotidai ir jų ryšiai 11 Kiti struktūriniai motyvai Adenino mažojo griovelio motyvas; Ribozės užtrauktukas; Metalo jonų prisijungimas... 12 RNR įvairovė Ląstelėje RNR yra žymiai daugiau, nei DNR – tiek pagal masę, tiek molekulių rūšių kiekį RNR sintetinama kaip viengrandininė molekulė, bet egzistuoja įvairių dvigrandininių struktūrų pavidale RNR yra (žymiai) trumpesnė nei DNR Yra daug RNR rūšių, skiriamų pagal dydį, struktūrą, atliekamas funkcijas… 13 RNR vieta ląstelėje Ląstelės branduolyje saugoma genetinė medžiaga – DNR. Branduolyje RNR sintetinama, nuskaitant nuo genominės DNR. Po subrandinimo RNR per poras branduolio apvalkale pernešama į citoplazmą. 14 E.Coli sudėtis 15 Dydžiai, kiekiai, greičiai 1 16 Dydžiai, kiekiai, greičiai 2 Savybės E. coli S. cerevisiae Žmogaus fibroblastas Ląstelės tūris 1 μm3 1000 μm3 10 000 μm3 Baltymų kiekis 4x106 4x109 4x1010 Baltymo dydis 5 nm Ribosomų kiekis 104 107 108 Vienos baltymo molekulės 1 nM 1 pM 0,1 pM koncentracija Vienos baltymo molekulės ~0,1 s ~10 s ~100 s difuzijos skersai ląstelę trukmė Vienos mažos molekulės ~1 ms ~10 ms ~100 ms difuzijos skersai ląstelę trukmė 17 Pagrindinės RNR rūšys Ribosominė RNR sudaro ribosomas, katalizuoja peptidinio ryšio susidarymą. Informacinė RNR koduoja aminorūgščių seką baltyme. Pernašos (transportinė) RNR į ribosomas perneša prijungtas aminorūgštis. 18 Pagrindinės RNR rūšys 19 Ribosominė RNR Turi sudėtingą antrinę struktūrą. Kartu su baltymais sudaro ribosomas. Prokariotų ląstelėse randamos 5S, 16S, 23S rRNR. Eukariotų ląstelėse randamos 5S, 5,8S, 18S, 28S rRNR. S (Svedberg) – sedimentacijos koeficientas, molekulės arba dalelės nusėdimo greitis centrifuguojant. Pavadintas Victor Svedberg vardu, kuris 1926 m. gavo Nobelio premiją chemijos srityje. Techniškai lygus 10-13s (100 fs). Pvz., 50S reiškia 50×10−6 m/s greitį, esant milijono g (~107 m/s2) pagreičiui. 20 RNR struktūros reikšmė 21 Ribosomų sudėtis Prokariotų ląstelėse randami 30S ir 50S subvienetai Eukariotų ląstelėse randami 40S ir 60S subvienetai 22 Ribosomos modeliai 23 Prokariotų informacinė RNR Prokariotuose viena iRNR molekulė gali turėti informacijos kelioms polipeptidinėms grandinėms sudaryti. Tokia iRNR vadinama policistronine. 24 Eukariotų informacinė RNR Yra monocistroninė. Turi egzonus ir intronus, kurie atitinkamai koduoja ir nekoduoja baltymų. Turi 7-metilguanozino-5’-trifosfato kepurę (“cap”) 5’ gale. Turi 100-200 nukleotidų seką 3’ gale – poliA. 25 iRNR “kepurės” struktūra Svarbu palaikyti iRNR stabilumui eukariotuose. Galimos papildomos modifikacijos hidroksi grupių metilinimas. Bakterijose ir galbūt aukštesniuose organizmuose kai kurios RNR yra kepurinamos NAD+, NADH arba 3′- defosfo-kofermentu A. 26 Aminoacilinta tRNR Aminorūgštis prijungiama esteriniu ryšiu prie tRNR 3‘-OH. 27 Kodono-antikodono sąveika 28 Wobble bazių poros tRNA 5' anticodon base mRNA 3' codon base (Crick) mRNA 3' codon base A U U, C, G, or (A) C G G G C or U C or U U A or G A, G, U, or (C) I A, C, or U A, C, or U k2C A xm5s2U, xm5Um, Um, xm5U A or (G) xo5U U, A, or G 29 Pagrindinės bazių poros Inozinas (kartais vadinamas hipoksantinu) gali sudaryti vandenilinius ryšius su adeninu, citozinu, uracilu. Guaninas sudaro su uracilu. 30 Kitos galimos poros 31 Kitos RNR rūšys miRNA (micro RNA) ir siRNA (small interfering siRNA) - viengrandininės 18-25 nukleotidų ilgio RNR. Reguliuoja genų raišką, slopina baltymų biosintezę piRNA (Piwi interacting RNA, P-element induced wimpy testis) - 26-31 nukleotidų ilgio. Sąveikauja su Piwi baltymais, reguliuoja spermatogenezę snRNA (small nuclear RNA) – mažos branduolio RNR. Dalyvauja RNR brendime, taip pat pernešant RNR iš branduolio į citozolį snoRNA (small nucleolar RNA) – mažos branduolėlio RNR. Dalyvauja ribosominių RNR (rRNR) brendime ir modifikacijoje scaRNA – mažos branduolėlio RNR, esančios Kachalio kūnelyje (Cajal body). Reikalingos snRNR modifikacijoms lncRNA – skirtingo ilgio RNR, nurašomos nuo nekoduojančios DNR grandinės......... 32  Apie 90% RNR, nurašomų nuo žmogaus genomo, funkcijos nežinomos. 33 RNR cheminės savybės 2’-hidroksilo grupė RNR molekulėje gali sudaryti vandenilinius ryšius, dalyvauti specifinėse cheminėse ir fermentinėse reakcijose DNR praskiesta rūgštimi depurinizuojama RNR atspari praskiestai rūgščiai DNR atspari bazėms RNR bazėmis hidrolizuojama 34 Šarminė RNR hidrolizė Vyksta vgRNR esant šarminėmis sąlygomis. Metalo jonai gali pagreitinti reakciją. 35 Ribonukleazės A reakcijos mechanizmas RNazė A katalizuoja fosfodiesterio hidrolizę dviem etapais: penkiavalenčio fosfato pereinamosios būsenos susidarymu ir vėlesniu 2'3' ciklinio fosfato tarpinio junginio hidrolize. Svarbi reakcijos dalis yra histidino (His 12 ir His119) gebėjimas priimti ir atiduoti protonus, todėl šie histidinai gali būti rūgštimi arba baze. 36 Deamininimas Kaip mutagenenis veiksnys nėra svarbus. Vienas iš būdų keisti RNR sekas. Gali sukelti įvairias ligas, ypatingai susijęs su netinkamai dirbančiais fermentais. 37 RNR aptamerai Dauguma aptamerių 20–100 bazių ir 3–20 kDa dydžio. Turi skirtingas antrines struktūras. Įprastas RNR turi prastą cheminį turtingumą. Galima sukurti tiek prieš mažas molekules, tiek prieš dideles. 38 Ribojungtukai (angl. riboswitch) Aptinkami 5’ netransliuojamoje dalyje. Prisijungia metabolitus ir užslopina transliaciją. Yra daugybė grupių su savita antrine struktūra ir savybėmis. 39 Ribozimai Ribozimai (angl. ) yra RNR molekulės, galinčios katalizuoti specifines biochemines reakcijas: RNR splicing; RNR hidrolizę;... 40 Selex Sisteminė ligandų evoliucija eksponentinio praturtinimo būdu (angl. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX) 41 RNR cheminė sintezė RNR cheminės sintezės metu būtina blokuoti šias funkcines grupes: amino grupes heterociklinėse bazėse (Ade, Cyt, Gua); ribozės 5’ arba 3’ hidroksigrupes; fosfatus (monoesteriuose ir diesteriuose); ribozės 2’ hidroksigrupę. Cheminė RNR sintezė vystėsi kartu su DNR sintezės metodais. Taikyti tiek fosfodi-, tiek ir fosfotri-esteriniai metodai. Šiuo metu pramoninė oligoribonukleotidų sintezė vykdoma fosfoamiditiniu (fosfitiniu) metodu ant kietos fazės nešėjų. 42 2’ hidroksi blokuotės Svarbiausia užblokuoti 2’ hidroksi grupę. Pasirinkimas platus. Dažniausiai naudojama TBDMS ir TOM. 43 2’-hidroksi blokuoto komponento sintezė Neregioselektyvus blokavimas duoda abi blokuotas 3’ ir 2’ hidroksi grupes. Izomerus galima išsigryninti ir panaudoti fosforoamidato grupės prijungimui. 44 Markiewicz metodas Dviguba apsauga 3' ir 5’ hidroksi grupių leidžia regiospecifiškai blokuoti 2’ hidroksilą. Nors tetra-izopropilsisiloksano chloridas (TIPDS) plačiai naudojamas, yra nesuderinamas su fluoridui labilioms bluokotėmis. Pašalinimui naudojma tetra-n- butilamonio fluoridas. Beigelman pasiūlė naudoti di- tretbutilsilileno chloridą (DTBS), kur šios grupės pašalinimas yra suderinamas su TBDMS. Pašalinimui naudojmas HF piridine. 45 2’ hidroksi blokuotės pašalinimas Blokuotės pavadinimas Pašalinimas Privaloksiloksimetilas (PivOM) Bazės (koncentruotas amoniakas) 2-(4-tolsulfonil)etoksimetilas (TEM) Tetra-n-butilamonio fluoridas 2-cianoetoksimetilas (CEM) Tetra-n-butilamonio fluoridas Cianoetilintas (CE) Bazės (koncentruotas amoniakas) Tret-butildimetilsililas (TBDMS) Tetra-n-butilamonio fluoridas Tetra-izo-propilsililoksimetilas (TOM) Tetra-n-butilamonio fluoridas Tret-butilditiometilas (DTM) 1,4-ditiotreitolis arba tris(2-karboksietil)fosfinas (po NH4OH) bis(2-acetoksietiloksi)metilas (ACE) pH 3, 10 min., 55 °C tionokarbamatas (TC) Etilendiaminas o-nitrobenziloksimetilas (2-Nbom) Fotolabilus p-nitrobenziloksimetilas (4-Nbom) Tetra-n-butilamonio fluoridas Acetalio levulinilo esteris (ALE) Hidrazino hidratas 2-ciano-2,2-dimetiletanimino-noksimetilas (CDEO) Tetra-n-butilamonio fluoridas 46 Iminooksimetiletilo proponatas (IEP) Tetra-n-butilamonio fluoridas Sujungimas Naudojami aktyvatoriai: 1H-tetrazolas; 5-etiltio-1H-tetrazolas; 5-benziltio-tetrazolas. 5-benzilmerkaptotetrazolas padidina reakcijos išeigą ir leidžia sintetinti >100 b ilgio RNR. 47 “Capping” ir fosfito oksidacija Nesureagavę nukleotidai (paprastai būna iki 2 %) acetilinami, siekiant išvengti jų dalyvavimo tolimesnėse reakcijose (arba tarpinio gryninimo). Reakcijai naudojama acto anhidridas ir N-metilimidazolas. Fosfito oksidacijai naudojamas jodas arba tret-butyl peroksidas. 48 Bendras sintezės ciklas 49  XNR Pristato Algirdas Mikalkėnas Nukleozidų/nukleotidų modifikacijos 2 Cukraus modifikacijos Dažniausia cukraus modifikacija 2’ hidroksi grupės metilinimas. Galimos plačios modifikacijos su tam tikra tolerancija. Cukraus modifikacijos suteikia naujų savybių. 3 Nukleozidai su treose Neturi 5’ hidroksi grupės. 3’ hidroksi grupė aktyvumas mažas ir panašus į 2’ hidroksi grupės aktyvumą. 4 Dideoksinukleozidų sintezė Dideoksi cukraus sintezė yra sudėtinga: Alkenų aktyvacija su jodo, sieros ar seleno halogenidais; Paladžio katalizuojamas kryžminis sujungimas; Corey-Winter olefinacija; Įvairios eliminacijos reakcijos... 5 Anhydronukleozidų panaudojimas cukraus modifikacijoms Jei 2’ ar 3’ hidroksi grupės turi gerai nueinančias grupės, šarminėmis sąlygomis susidaro anhydronukleozidas (tik su pirimidinais). Anhydronukleozidai kaip tarpiniai produktai, gali dalyvauti skirtinguose reakcijuose. 6 Karbocikliniai nukleozidai Didelis stabilumas. Naudinga vaistų sintezėje. Didelės problemos sintezėje. Reikia išlaikyti stereo būseną, sintezės būdai: Konvertuoti cukrų į karbociklą; Konstruoti nuo ciklopentadieno; Baigti reakcijas suformuojant ciklopentadieną. 7 Abacavir sintezė 1 Naudojant komercinį Vince Lactam ir konstruojant bazę. 8 Abacavir sintezė 2 Crimmins sintezė: Asimetrinis aldolis; Žiedo uždarimas naudojant Grubbs katalizatorių; Trost tipo alilinis pakeitimas. 9 Abacavir sintezė 3 Naudojama Lipazė B, kad gautų stereoizomerą. 10 Lamvudine sintezė L nukleozido sintezė iš L- gulozės. Nukleobazė prijungiama naudojant TMSOTf. Kitas būdas naudojant mentolį, kad chiralinį junginį išsigryninti ir naudoti tolimesnei sintezei. 11 Oxetanocin sintezė Keisto cukraus panaudojimas. Senas būdas sudėtingas D- ribopiranozės cheminė transformacija. Kordycepino (išskirto iš Cordyceps militaris). 12 Aciklinių nukleozidų sintezė Cukrus suredukuotas iki minimum. Pritaikoma kaip antivirusiniai vaistai. 13 Fosforo rūgšties modifikacijos Sulfurilinimas; Bohidrinimas; Tarpfosfatinės modifikacijos; 14 Borhidridų įjungimas Naudojant fosfitus, tereikia borhidrido donoro. Borhidrido įjungimas sumažina jautrumą desfosforilazėms arba nukleazėms. 15 Prieš vėžiniai vaistai Galimos įvairios modifikacijos. Galimi skirtingi veikimo mechanizmai. Šalutinis poveikis. 16 Nukleozidiniai slopikliai prieš DNR polimerazes Neturi 3’ hidroksi grupių. Imituoja įprastas nukleobazes. Aktyvumas priklauso nuo kinazių, pirmas fosforilinimo žingsnis yra sunkiausias. Šalutinis poveikis. 17 Veikimo mechanizmas 18 Kiti nukleozidiniai slopikliai Steriniai trukdžiai; Mutageniniai nukleotidai; Anti pyrofosfolizinis aktyvumas... 19 EFdA veikimo mechanizmas 20 8iPrNdA veikimo mechanizmas. 21 Bazių modifikacijos 22 Kontroliuojama transkripcija 5-hidroksimetil (5 hm) modifikacija ant uracilo ir citozino veikė kaip epigenetinė žymė. Nitrobenzilu (NB), modifikuoti 5- hm-uracilai arba citozinai neveikia kaip epigenetinė žymė. Nirtrobenzilas gali būti pašalinamas apšvietus 400 nm spinduliuote. 23 Dirbtinės bazių poros Dirbtinių bazių savybės: turėtų sudaryti stabilią porą su savo partnerio nukleotidu; išvengti klaidingo poravimosi su natūraliais nukleotidais; Pasižymėti termostabilumu, kad atlaikytų PGR procedūrą; gauti modifikuoti biopolimerai turėtų būti tiksliai transkribuojami į RNR su nenatūraliomis bazėmis. 24 XNR PNR Kseno nukleorūgštys (angliškai Xeno nucleic acids, XNR) yra chemiškai modifikuotų nukleorūgščių analogų grupė su pakeistomis savybėmis, kas leidžia išplėsti nukleorūgščių naudingumą biotechnologijoje ir nanotechnologijoje. 25 Cukraus pasirinkimas DNR ir RNR Pakeitus cukrumi galimos kitokios struktūros DNR ir RNR. Tm °C AAAAAAAAA: Ribofuranozė 16,3; Ribopiranozė 46; Ksilopiranozė 47,3; Liksopiranozė 51; Arabinopiranozė 79,7. 26 PNR Peptidinė nukleorūgštis (angl. peptide nucleic acid, PNA) yra nukleorūgšties analogas, kuriame normalus fosfatodiesteris pakeistas neutraliu peptidu N-(2-aminoetil)glicino pagrindu. Sintezė kietafazinė. 27 Komponentai Galimos skirtingos blokuotės, tiek laikinos, tiek pastovios. 28 Sintezė 29 Sujungimo reakcija 30 Šalutinės reakcijos 31 LNA (UNR) Užrakinta nukleorūgštis (angl. locked nucleic acid LNA) yra nenatūralus, riboto konformacijos oligonukleotido analogas, labai panašus į RNR, tačiau turintis monomerų vienetų su 2'-O-4'-C- metileno tilteliu. Biciklinė struktūra užrakina molekulę C3'-endo konfigūracijoje, užtikrindama, kad oligonukleotidas perimtų A formos spiralę. 32 Cheminė sintezė UNR oligonukleotidus galima susintetinti standartiniais automatiniais DNR sintezatoriais naudojant komerciškai prieinamus UNR fosforamidito monomerus. Vieninteliai DNR sintezės ciklo pakeitimai yra sujungimo ir oksidacijos etapų reakcijos laikas. UNR oligonukleotidai gali būti pažymėti fluorescenciniais dažais ir kitomis cheminėmis modifikacijomis taip pat, kaip ir DNR ir RNR oligonukleotidai. 33 ANR Atrakinta nukleino rūgštis (angl. unlocked nucleic acid UNA) yra RNR analogas, kuriame C2'-C3' ryšys nutrauktas. Nors UNR yra apribota konformaciniu požiūriu (palyginti su DNR ir RNR), UNA yra labai lanksti. 34 Cheminė sintezė Oligonukleotidus galima susintetinti standartiniais automatiniais DNR sintezatoriais naudojant komerciškai prieinamus ANR fosforamidito monomerus. 35 Triazolu sujugta DNR Triazolu sujungta DNR oligonukleotidai, kuriuose viena ar daugiau fosfatų jungčių yra pakeistos triazolo jungtimis, buvo susintetinti naudojant Click chemiją. Triazolo jungties buvimas nepažeidžia dgDNR struktūros. 36