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BIOCHIMIE METABOLIQUE (BIOL-F208) Mme. Véronique Kruys Université Libre de Bruxelles FACULTES DES SCIENCES/ Pharmacie 1 Véronique Kruys Laboratoire de « Biologie Moléculaire du Gène » Département de Biologie Moléculaire Gosselies Tel : 02 650 98 01 Mail : [email protected] Note d’utilisati...

BIOCHIMIE METABOLIQUE (BIOL-F208) Mme. Véronique Kruys Université Libre de Bruxelles FACULTES DES SCIENCES/ Pharmacie 1 Véronique Kruys Laboratoire de « Biologie Moléculaire du Gène » Département de Biologie Moléculaire Gosselies Tel : 02 650 98 01 Mail : [email protected] Note d’utilisation: Ce syllabus a été réalisé à partir de notes du cours de Biochimie métabolique et structurale (CHIM-F202). Il vient en complément du cours magistral mais ne le remplace pas. En particulier, un grand nombre de schémas et de dessins de structures qui sont exposés au cours ne sont pas inclus dans le syllabus. Il faut donc utiliser ce document en complément des dias présentées au cours et qui sont disponibles sur l’université virtuelle. Lorsque cela sera jugé utile, un complément de notes comportant des commentaires sur les schémas présentés au cours sera disponible sur l'U.V. Des remarques ou "errata" éventuels seront diffusés également sur l'U.V. Je voudrais remercier chaleureusement Phidéline Gérard, Aurélie Roth et Sébastien Penninckx qui ont gracieusement mis leur manuscrit à notre disposition pour réaliser ce syllabus et Marylin Boutchon pour la finalisation de la mise en page. En complément, il est utile de consulter les livres de référence suivants qui sont disponibles à la BST: 1. Biochemistry, Berg, Tymoczko, Stryer, 7e WH Freeman 2. Lehninger Principles of Biochemistry, DL Nelson and MM Cox, 6e WH Freeman 3. Biochimie, tout le cours en fiche, N Latruffe, F Bleicher-Berdeletti, B Duclos, J Vamecq, ed. Dunod 2 Table des matières Biochimie Métabolique A) Catabolisme du glucose (rappel) ........................................................................................ 4 Chapitre 1: La Glycolyse ............................................................................................................ 4 Chapitre2: Le cycle de Krebs .................................................................................................... 14 Chapitre 3: La chaine respiratoire ............................................................................................. 23 Chapitre 4 : La synthèse d’ATP ................................................................................................ 35 B) Autres voies métaboliques du glucose ............................................................................ 46 Chapitre 1: Le métabolisme du glycogène................................................................................ 46 Chapitre 2: La gluconéogenèse ................................................................................................. 57 Chapitre 3: La voie des pentoses phosphates ............................................................................ 67 C) Le métabolisme des acides gras ........................................................................................ 73 Chapitre 1 : Les triacylglycérols constituent d’importantes réserves d’énergie ....................... 73 Chapitre 2 : Digestion des graisses alimentaires....................................................................... 74 Chapitre 3 : Utilisation des acides gras comme source d’énergie ............................................ 75 Chapitre 4 : Biosynthèse des acides gras .................................................................................. 82 Chapitre 5 : Contrôle du métabolisme des acides gras ............................................................. 87 D) Conclusions ........................................................................................................................... 88 EXEMPLES DE QUESTIONS D’EXAMEN .................................................................................. 90 3 Biochimie Métabolique A) Catabolisme du glucose (rappel) Chapitre 1: La Glycolyse La glycolyse est un processus qui permet à la cellule, grâce à la transformation du glucose en pyruvate par une série d’étapes, de récupérer de l’énergie La glycolyse consiste en une série de 10 réactions qui dans une cellule eucaryote, se déroulent dans le cytosol. La glycolyse peut être décomposée en 3 parties : - La séquestration et l’activation du glucose. - Le clivage du glucose en 2 entités à 3 carbones. - La formation d’ATP par oxydation des 2 entités à 3 carbones en pyruvate.  1ère réaction: phosphorylation du glucose Bilan: ATP + α-D-glucose → ADP + α-D-glucose 6-P. Cette réaction est catalysée par des enzymes : hexokinase (dans le cas de la levure) ou glucokinase (dans le cas du foie). La réaction est un équilibre que l’on tire vers la droite grâce à un couplage énergétique avec l’hydrolyse de l’ATP. Le ∆G de la réaction est alors très négatif, ce qui en fait une réaction exergonique. Sous forme phosphorylée, le glucose 6-P est séquestré dans la cellule. Il ne peut plus sortir de la cellule via les transporteurs de glucose. Il est chargé négativement et ne peut donc pas franchir la barrière hydrophobe de la membrane cellulaire. En plus d’être un intermédiaire de la glycolyse, le glucose 6-P est un point de branchement entre différentes voies métaboliques, comme la synthèse de glycogène et la voie des pentoses phosphate (voir chapitres suivants). 4  2ème réaction: isomérisation du glucose 6-phosphate en fructose-6-phosphate Bilan: α-D-glucose 6-P ↔ α-D-fructose 6-P. La réaction est catalysée par la phosphoglucose isomérase. Notons que l’isomérisation de l’aldose en cétose se produit après décyclisation du glucose-6-phosphate.  3ème réaction: phosphorylation du fructose 6-phosphate en fructose 1,6biphosphate. Bilan: α-D-fructose 6-P + ATP → α-D-fructose 1-6-biphosphate + ADP La réaction est catalysée par la 6-phosphofructokinase, une enzyme dont l’activité est fortement régulée. Son activité augmente en présence d’AMP et d’ADP mais diminue s’il y a un excès d’ATP. La réaction possède un ∆G négatif et est donc spontanée (hydrolyse d’ATP).  4ème réaction: clivage aldolique du fructose 1,6-biphosphate. 5 Bilan: α-D-fructose 1-6-biphosphate ↔ glycéraldéhyde 3-P + dihydroxyacétone-P. La réaction, catalysée par l’aldolase, consiste à cliver le fructose 1,6-biphosphate en 2 trioses phosphatés au niveau des carbones 3 et 4. Parmi ces 2 trioses phosphatés, seul le glycéraldéhyde 3-P est directement dégradé dans les étapes suivantes de la glycolyse. La réaction possède un ∆G positif, ce qui indique qu’elle est défavorable mais elle est entrainée par la disparition des produits dans les étapes ultérieures. Une diminution de la concentration des produits entraine une diminution de l’énergie libre de Gibbs.  5ème réaction: isomérisation des 2 trioses. Bilan: Dihydroxyacétone-Phosphate ↔ glycéraldéhyde 3-Phosphate La dihydroxyacétone-phosphate est réversiblement transformé en glycéraldéhyde 3-phosphate par un enzyme (triose phosphate isomérase). La réaction possède un ∆G positif mais la consommation du GAP dans les étapes ultérieures va pousser l’équilibre de la réaction vers la droite. L’enzyme impliquée dans cette réaction est une structure cylindrique α β complexe (8 feuillets β parallèles, 8 hélices α). La boucle de son site catalytique est composée de glutamate (acide faible) et d’histidine (base faible). Dans l’espace, cette boucle forme une espèce de couvercle au-dessus du cylindre. Lorsque le DHAP entre dans le site catalytique de l’enzyme, le glutamate capte un proton au niveau du carbone (permet de passer de sa forme carboxylate à sa forme acide carboxylique) et le carbonyle du DHAP capture un proton de l’histidine. Après cette prototropie, on forme un intermédiaire ènediol. Ensuite, l’histidine déprotonne le groupement hydroxyle du carbone 1. Il s’en suit le rabattement du doublet nonliant de l’oxygène sur la liaison C-O, ce qui induit l’attaque de la double liaison C=C sur le proton du glutamate. Ainsi, se forme le GAP. Cette réaction transforme un cétose en aldose. Lors de cette réaction, se forme un intermédiaire ènediol. Celui-ci pourrait se convertir spontanément en méthylglyoxal en éjectant dans le milieu son groupement phosphate. Pourtant, on observe la poursuite de la réaction décrite plus haut qui est moins favorable thermodynamiquement parlant. Ceci peut s’expliquer par la structure tridimensionnelle de la triose phosphate isomérase. En effet, la boucle de l’enzyme ferme le site actif empêchant l’entrée d’eau nécessaire à l’hydrolyse en méthylglyoxal. La formation de ce méthylglyoxal serait une impasse métabolique car le produit stopperait la série de réactions menant au pyruvate. 6  6ème réaction: oxydation-phosphorylation du GAP en 1,3-biphosphoglycérate Bilan : Glycéraldéhyde 3-phosphate +Pi + NAD+ ↔ NADH + H+ + 1,3-biphosphoglycérate La réaction est catalysée par la D-glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et est particulière pour deux raisons : – c’est la première réaction de la voie métabolique qui produit de l’énergie. – cette réaction fait intervenir un agent oxydant particulier : le nicotinamide adénine dinucléotide. La réaction de phosphorylation (oxydative) est couplée à la réduction du NAD+ en NADH. C’est donc une réaction redox. Le NAD+ (nicotinamide adénine dinucléotide) intervient comme accepteur d’électrons. C’est un coenzyme d’oxydoréduction. (Rem : un coenzyme est une molécule indispensable à la réaction. Il agit au niveau du site actif de l’enzyme. Il est transformé par la réaction mais sera régénéré ultérieurement. Il faut noter que toutes les enzymes n’ont pas besoin d’un coenzyme) La forme oxydée (NAD+) passe à la forme réduite (NADH) par capture d’un hydrure H- (1 H+ + 2 e-). Il existe d’autres agents réducteurs mais le couple NAD+/NADH est principalement utilisé dans les réactions d’oxydation d’un alcool en aldéhyde ou cétone. Les deux structures se ressemblent beaucoup mais on peut aisément les distinguer par spectrophotométrie. En effet, à 260 nm, on observe l’absorbance des deux composés. A 340 nm, on n’observe l’absorbance que de la forme réduite (NADH). 7  7ème réaction: formation d’ATP par transformation du 1,3-biphosphoglycérate en 3phosphoglycérate. Bilan: 1,3-biphosphoglycérate + ADP ↔ 3-phosphoglycérate + ATP. Cette réaction est catalysée par la phosphoglycérate kinase. Le clivage de la liaison anhydride libère beaucoup d’énergie. Cette énergie est suffisante pour former une autre liaison riche en énergie sous forme d’ATP. Il y a donc couplage entre le clivage de la liaison anhydride et la formation d’ATP. C’est la première étape qui génère de l’ATP dans le processus de glycolyse. Comme deux trioses sont formés à partir d’une molécule de glucose (cfr. réaction 5), deux molécules d’ATP sont générées.  8ème réaction: isomérisation du 3 phosphoglycérate en 2 phosphoglycérate. Bilan: 3-phosphoglycérate ↔ 2-phosphoglycérate Cette réaction est catalysée par la phosphoglycérate mutase qui transfère le groupement phosphate du carbone 3 au carbone 2. 8  9ème réaction: déshydratation du 2-phosphoglycérate en phosphoénolpyruvate. Bilan: 2-phosphoglycérate ↔ phosphoénol pyruvate + H2O La réaction est catalysée par l’énolase. Il s’agit en fait d’une réaction rédox intramoléculaire : Le carbone 2 est oxydé tandis que le carbone 3 est réduit. Cette réaction va augmenter le potentiel de transfert du groupement phosphate par la création d’une double liaison.  10ème réaction: formation d’ATP par transformation du phosphoénolpyruvate en pyruvate. Bilan: Phosphoénolpyruvate + ADP ↔ pyruvate + ATP Cette réaction est catalysée par le pyruvate kinase et consiste à cliver une liaison riche anhydride, libérant beaucoup d’énergie et permettant la formation d’ATP. La toute dernière étape est une tautomérie énol-cétone. La forme cétone est plus stable que la forme énol. Maintenant, nous pouvons faire le bilan global de la glycolyse: Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ → 2 pyruvates + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O Régulation de la glycolyse: Ex: quand un muscle est au repos, il n’a pas besoin d’une grande source d’énergie. Les 2 enzymes [la phosphofructokinase (PFK) et la pyruvate kinase (PK)] qui régulent la production de pyruvate sont alors inhibées par complexation avec l’ATP. Il n’y a donc pas de production de pyruvate. Une troisième enzyme joue un rôle dans la régulation de la glycolyse, c’est l’hexokinase. Elle catalyse la transformation du glucose en glucose-6-phosphate (1ème réaction). Son 9 activité est régulée par une augmentation de la concentration de glucose 6-phosphate, son produit. Il s’agit donc d’un mécanisme de rétroinhibition. Si le glucose est le substrat majeur de la glycolyse, d’autres oses peuvent aussi alimenter la glycolyse. Parmi ceux-ci: * Le glucose 1-phosphate qui est produit à partir de glycogène, la réserve animale de glucose (voir chapitre ultérieur). * Le fructose: Il y a deux possibilités: a. fructose + ATP → fructose 6-phosphate + ADP C’est une réaction qui se produit dans les muscles et qui est catalysée par l’hexokinase. b. fructose + ATP → fructose-1-phosphate + ADP C’est une réaction qui se fait dans le foie. fructose-1-phosphate → glycéraldéhyde + dihydroxacétone phosphate. La dihydroxacétone phosphate peut entrer dans la glycolyse, mais le glycéraldéhyde doit encore être transformé. Glycéraldéhyde + ATP → glycéraldéhyde 3-phosphate + ADP Cette dernière réaction est catalysée par l’ATP triose kinase. * Le mannose: Le mannose est un épimère du glucose (il diffère de celui-ci par la position d’un groupement hydroxyle). Pour entrer dans la glycolyse, il est transformé d’abord en mannose 6phosphate, puis en fructose 6-phosphate. * Le galactose: C’est également un épimère du glucose. Le galactose entre par une voie très particulière dans la glycolyse. Il est tout d’abord transformé en galactose 1-phosphate. Galactose + ATP → galactose 1-P + ADP Le galactose 1-phosphate est lui-même transformé en glucose 1-phosphate par un processus cyclique faisant intervenir l’UMP, l’UDP galactose et l’UDP glucose. Ensuite, le glucose 1-phosphate est transformé en glucose 6-phosphate qui peut alors rentrer dans la glycolyse. Remarque: ce processus est fort compliqué. On pourrait imaginer un chemin direct depuis le galactose 1-phosphate jusqu’au glucose 1-phosphate, mais l’enzyme nécessaire à cette réaction n’existe pas. 10 Pourquoi l’Arsenic est-il un poison ? Dans l’organisme, l’arsenic est sous forme d’arsénate (AsO43-). Il peut entrer dans la glycolyse en réagissant avec le glycéraldéhyde 3-phosphate pour former le 1-arséno-3phosphoglycérate. Ce dernier se transforme sans activité enzymatique en 3phosphoglycérate (un intermédiaire ultérieur de la glycolyse) sans production d’ATP. Un abaissement important de la production d’énergie (ATP) entraine la mort cellulaire. Comment le NAD+ est-il régénéré dans la cellule ? Il y a un réservoir limité de NAD+ dans la cellule. Il doit donc être régénéré pour que la glycolyse continue. Ceci est possible grâce au métabolisme du pyruvate. Le pyruvate peut être dégradé selon : - 2 voies anaérobies (sans oxygène) : processus de fermentation: alcoolique → production d’éthanol. lactique → production de lactate. - 1 voie aérobie plus complexe spécifique aux organismes aérobies : la respiration cellulaire. Nous allons détailler ces 3 mécanismes. 11 a) Fermentation alcoolique: Ce processus était déjà pratiqué dans l’antiquité par les Romains pour la fabrication du vin. Louis Pasteur a par la suite démontré l’importance des levures dans la fermentation du vin. En 1925, Embden et Meyerhof ont élucidé les mécanismes de fermentation. Ce processus transforme tout d’abord le pyruvate en un acétaldéhyde grâce à une enzyme (la pyruvate décarboxylase): il y a donc perte d’un carbone sous forme de dioxyde de carbone. Une deuxième enzyme permet la réduction de l’acétaldéhyde en éthanol. Cette étape génère du NAD+ par l’oxydation du NADH. Le bilan réactionnel de la fermentation alcoolique est: 1 glucose + 2 Pi + 2 ADP + 2 H+ → 2 ethanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O Même s’ils sont essentiels au processus global, le NADH et le NAD+ n’apparaissent pas dans le bilan réactionnel. En effet, le NADH généré par l’oxydation du glycéraldéhyde 3phosphate est consommé lors de la réduction de l’acétaldéhyde en éthanol. Ces éléments sont ainsi « recyclés ». Ils sont par contre bien présents dans le bilan réactionnel de la glycolyse (voir précédemment). b) Fermentation lactique: La fermentation lactique a lieu dans des microorganismes anaérobiques (bactéries lactiques par exemple) ou dans des organismes unicellulaires ou pluricellulaires aérobiques lorsque la quantité d’oxygène est limitée (hypoxie). C’est notamment le cas chez l’Homme lors d’un effort intense et rapide, les muscles en hypoxie vont produire du lactate. Dans une tumeur en croissance rapide, la partie intérieure de la masse cellulaire mal irriguée par la circulation sanguine est aussi en hypoxie et génère son énergie en consommant beaucoup de glucose par fermentation lactique. 12 La fonction cétone du pyruvate est réduite en une fonction alcool avec l’intervention d’une enzyme appelée lactate déshydrogénase pour former du lactate. Il y a oxydation du NADH en NAD+. La réaction globale dans la conversion du glucose en lactate est: 1 glucose + 2 Pi + 2 ADP → 2 lactates + 2 ATP + 2 H2O Ici aussi, le NADH et NAD+ n’apparaissent pas car ils sont recyclés. Le NADH formé dans l’oxydation du glycéraldéhyde 3-phosphate est consommé dans la réduction du pyruvate. Remarque: il est aussi possible de régénérer le NAD+ en absence de pyruvate. Dans ce cas, c’est la dihydroxyacétone-phosphate, créée à l’étape de clivage, qui est réduit. Il y a ainsi oxydation du NADH en NAD+. L’autre triose (glycéraldéhyde 3-phosphate) suit quant à lui la voie classique de la glycolyse. c) Respiration cellulaire: De l’énergie peut aussi être générée en aérobiose (présence d’O2) par l’intermédiaire du cycle de Krebs ou cycle de l’acide citrique. Dans un premier temps, le pyruvate est dégradé par élimination de 3 CO2. Ce n’est que plus tard que l’oxygène intervient. Ce procédé a un double avantage : il y a non seulement régénération de NAD+, mais aussi production d’ATP. Le cycle de Krebs constitue la première phase de la respiration cellulaire. Il consiste à capturer des électrons de haute énergie à partir de molécules énergétiques carbonées. Ce n’est que par la suite que ces électrons serviront à réduire O2 pour créer un gradient de protons utilisé pour synthétiser l’ATP. Ces deux dernières étapes constituent la phosphorylation oxydative. 13 Chapitre2: Le cycle de Krebs La dégradation aérobie du glucose génère de l’ATP. Elle commence par l’oxydation des dérivés du glucose en CO2. Cette oxydation s’effectue par le cycle de l’acide citrique, aussi appelé cycle de Krebs ou cycle des acides tricarboxyliques (cycle ATC). Le précurseur de ce cycle est l’acétyl coenzyme A (Acétyl CoA). Ce cycle aboutit à la dégradation complète du pyruvate. Il a pour fonction de récolter des électrons de haute énergie à partir des carbones des molécules énergétiques. 2.1. Historique - En 1935, Szent-Gyorgyi étudie la consommation d’O2 par des fragments de muscles de pigeon. Il découvre que ces fragments incubés dans une solution physiologique (dans une capsule barométrique) consomment de l’oxygène. Après une vingtaine de minutes, la consommation de dioxygène cesse. Il observe qu’avec un jus de muscle pressé, la consommation reprend. Il analyse alors le jus pour trouver la molécule qui est à la base de ce phénomène. Il détecte du succinate (un acide à 4 carbones). Il en ajoute à ses morceaux de muscles et la consommation d’O2 reprend, mais de façon beaucoup trop importante pour que ce soit simplement dû à une oxydation du succinate. A la place de 3/2 O2, il constate une consommation de 70 à 100 oxygènes. Il en déduit que le succinate a un rôle catalytique. Szent-Gyorgyi continue ses recherches et trouve qu’on peut avoir le même type de phénomène avec de l’acide formique, de l’oxaloacétate ou du malate. Il observe que le rapport CO2 libéré/O2 consommé dans la capsule est constant et émet alors l’hypothèse suivante : C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O Succinate, Oxaloacétate, Malate - En 1953, Krebs reçoit le prix Nobel pour avoir découvert le rôle de l’acide citrique et le mécanisme cyclique. - Plus tard, on découvre le compartiment cellulaire dans lequel se déroule ce cycle. La cellule eucaryote se distingue de la cellule procaryote non seulement par certains organites, mais aussi par la présence d’une compartimentation du métabolisme. Alors que la glycolyse a lieu dans le cytosol, la dégradation du pyruvate et le cycle de Krebs ont lieu dans les mitochondries, et plus exactement dans la matrice mitochondriale. On 14 peut apparenter la mitochondrie à une usine énergétique de la cellule eucaryote. La mitochondrie est composée de 2 membranes: - Membrane interne: Elle comporte une grande surface car elle comprend de nombreuses invaginations appelées crêtes. Cette membrane est imperméable. - Membrane externe: Elle est riche en porines (canaux laissant passer les petites molécules). Elle est donc perméable aux petites molécules. L’entrée du pyruvate dans la matrice mitochondriale se fait en échange de la sortie d’un hydroxyle. 2.2. Réactions du cycle de Krebs Le pyruvate doit subir une transformation avant d’entrer dans le cycle de Krebs: une décarboxylation oxydative. Cette réaction irréversible constitue l’étape liant la glycolyse et le cycle de Krebs. - 1e étape: élimination de CO2 → formation d’un carbanion (entité très instable). - 2e étape: oxydation du carbanion → formation d’un carbocation. Cette étape est couplée à la réduction de NAD+ en NADH en captant les 2 électrons émis (+ 1 H+). - 3e étape: formation d’une liaison thioester (liaison entre l’atome de carbone et l’atome de souffre) dans l’Acétyl Coenzyme A (AcétylCoA). ∆G°’ réaction = -33,4kJ/mol Cette réaction est catalysée par la pyruvate déshydrogénase (complexe multienzymatique : 3 enzymes et 5 co-enzymes). Bilan: Pyruvate + NAD+ + CoA(SH) → CO2 + NADH + AcétylCoA Le CoA(SH) est composé d’un nucléotide diphosphate, d’une unité pantothénate et d’un groupement thiol. C’est un transporteur de groupements acyl. Le site réactif est le groupe sulfhydryle terminal du CoA. Les groupes acyl se lient au CoA par une liaison thioester 15 pour former des acyl CoA. Cette liaison thioester est très énergétique (l’hydrolyse de l’acétyl CoA est très exergonique). Acétyl CoA + H2O Acétate + CoA(SH) + H+ ∆G°’= -31,4kJ/mol Notons la différence par rapport aux autres modes de transformation du pyruvate. Ici, celui-ci est oxydé tandis que dans les fermentations, le pyruvate est réduit. Le cycle proprement dit, comporte 8 réactions rassemblées en 6 étapes: a) Condensation de l’actéyl CoA et de l’oxalo-acétate: Le cycle de Krebs commence par une condensation aldolique suivie d’une hydrolyse. Cette réaction est catalysée par la citrate synthase. L’oxaloacétate se condense d’abord avec l’acétyl CoA à la suite de l’attaque nucléophile du carbone du carbonyle de l’oxaloacétate sur l’acétyl CoA pour former le citryl CoA. C’est son hydrolyse en CoA, très exergonique, qui donne à la réaction un ∆G°’négatif. Bilan: oxaloacétate + acétyl CoA + H2O → citrate + CoA(SH) + H+ b) Isomérisation du citrate en isocitrate: Le citrate comporte 3 fonctions acides carboxyliques, d’où le nom de cycle des acides tricarboxyliques que l’on donne aussi au cycle de Krebs. Le citrate n’a pas de carbone asymétrique mais est chiral à une transformation près. On parle alors d’une molécule pro-chirale. Le citrate subit d’abord une isomérisation stéréospécifique pour donner le cis-aconitate. Cette étape comprend la capture de l’hydrogène R de l’extrémité pro-R du citrate, la formation d’une double liaison temporaire ainsi que l’élimination de H2O. L’enzyme qui catalyse cette réaction est l’aconitase. 16 Notons que la réaction est stéréospécifique car l’enzyme ne capte que l’hydrogène R de l’extrémité pro-R du citrate. La deuxième étape est l’hydratation stéréospécifique du cis-aconitate en isocitrate. L’aconitase est une protéine à groupement fer-soufre. Un atome de fer est disponible pour la fixation du citrate par l’intermédiaire des groupes carboxyles et hydroxyles. Le citrate peut se lier selon deux configurations différentes à l’aconitase: * L’ion Fe2+ de l’aconitase est en liaison ionique au carboxyle C-1 et aux groupes carboxyle et hydroxyle du C-3 du citrate. Dans ce cas, l’hydrogène R de l’extrémité pro-R du citrate est dans une position qui permet qu’il soit arraché. Ce n’est pas le cas de l’hydrogène S qui est trop éloigné du lieu de captage. * L’ion Fe2+ de l’aconitase est en liaison ionique avec le carboxyle C-5 et les groupes carboxyle et hydroxyle du C-3 du citrate. Dans ce cas, les hydrogènes de l’extrémité pro-R du citrate sont trop éloignés pour pouvoir être arrachés. Le citrate peut donc se lier à l’aconitase de 2 façons, mais seule la première d’entre elle permet d’arracher le proton HR. c) Oxydation et décarboxylation de l’isocitrate: Cette étape est la première réaction d’oxydationréduction du cycle de Krebs. Elle est catalysée par l’isocitrate déshydrogénase. L’isocitrate est oxydé en un intermédiaire instable: l’oxalo-succinate. Le NAD+ est quant à lui réduit en NADH, créant ainsi le premier transporteur d’électrons de haut potentiel de transfert du cycle. L’intermédiaire est par la suite décarboxylé pour donner l’α-cétoglutarate. 17 d) Décarboxylation oxydative de l’α-cétoglutarate: La décarboxylation oxydative de l’α-cétoglutarate aboutit à la formation du succinyl-CoA. Cette réaction est semblable à la décarboxylation oxydative du pyruvate (élimination de CO2), formation d’un carbanion oxydé en un carbocation puis formation d’un lien thioester riche en énergie. Les deux enzymes impliquées, α-cétoglutarate déshydrogénase et pyruvate déshydrogénase, utilisent le même chemin réactionnel. Bilan: α-cétoglutarate + NAD+ + CoA(SH) → CO2 + NADH + H+ + succinyl CoA Pour rappel : les décarboxylations oxydatives sont des réactions irréversibles. e) Conversion du succinyl CoA en succinate: Le succinyl CoA est un composé riche en énergie par la présence de la liaison thioester. Le clivage de cette liaison carbone-souffre est couplé à la phosphorylation du GDP en GTP. Cette réaction est catalysée par la succinyl CoA synthétase. Clivage du lien C-S: ∆G°’ = -8 kcal/mol Formation de GTP : ∆G°’ = 7,3 kcal/mol ∆G°’ réaction = -0,7 kcal/mol. 18 f) Régénération de l’oxaloacétate par oxydation du succinate: La dernière partie du cycle correspond à la régénération de la molécule de départ: l’oxaloacétate. Cette réaction convertit un groupe méthylène (CH2) en un groupe carbonyle (C=O) en 3 étapes : 1. Oxydation: le succinate est oxydé en fumarate grâce à la succinate déshydrogénase. Il y a formation d’une double liaison entre le carbone 2 et le carbone 3. Cette réaction nécessite l’intervention d’un autre cofacteur que le NAD+ : le FAD (Flavine Adénine Dinucléotide), qui constitue l’entité réactive. Les azotes des 3 cycles sont les sites capteurs d’hydrogènes (voir plus bas). Sa forme réduite, le FADH2, est créée au cours de cette étape. Alors que le NAD+ intervient dans les oxydations d’alcools en aldéhydes puis en acide carboxylique, le FAD est quant à lui spécifique des réactions d’oxydation avec formation d’une double liaison C=C. 19 2. Hydratation du fumarate en L-malate avec l’intervention de la fumarase qui catalyse une addition trans-spécifique d’un atome d’hydrogène et d’un groupe hydroxyle. La fumarase qui catalyse cette réaction, est stéréospécifique car le groupe hydroxyle ne s’additionne que d’un seul côté de la double liaison du fumarate. Seul l’isomère L du malate est formé. 3. Oxydation: le malate est oxydé en oxaloacétate. On observe la transformation d’une fonction alcool en une fonction cétone. Cette réaction est catalysée par la malate déshydrogénase. Le NAD+ capte 2 électrons et un H+ et est réduit en NADH. Le ∆G°’ de cette réaction est positif. L’oxydation du malate est néanmoins favorisée car l’oxaloacétate est réutilisé dans le cycle de Krebs. Globalement, le cycle de Krebs se schématise comme suit: La réaction globale du cycle de Krebs est: Acétyl CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O →2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP + 2H+ +CoA 20 - Il y a production d’énergie via le GTP, le NADH et le FADH2. - Deux atomes de carbone entrent dans le cycle par condensation de l’acétyl CoA avec l’oxaloacétate et 2 atomes de carbone quittent le cycle sous forme de CO2 lors des décarboxylations. - 4 paires d’atomes d’hydrogène (c’est-à-dire 8 électrons) quittent le cycle lors des quatre réactions d’oxydation: 3 molécules de NAD+ et une molécule de FAD sont réduites. Finalement, le pyruvate a été complètement dégradé, générant du GTP, du CO2 et des électrons de haute énergie sous forme de NADH et FADH2. Remarques: - Cette voie métabolique permet de récupérer de l’énergie (ATP, GTP) et fait intervenir des réactions chimiques complexes (oxydation du pyruvate, du méthyl) dans des conditions ménagées. - On n’a pas encore vu le rôle de l’O2 dans la respiration qui doit pourtant être aérobie. Les atomes d’oxygène du CO2 produit ne proviennent pas de l’utililsation d’O2 . - Les cofacteurs doivent encore être régénérés. Il y a production d’un NADH dés l’entrée du cycle et de trois autres ensuite, plus un FADH2. - La récupération d’énergie paraît faible jusqu’ici: seulement 1 GTP et 2 ATP de la glycolyse sont générés, alors qu’on sait que 38 ATP sont produites par molécule de glucose oxydé. 2.3. Contrôle du cycle de Krebs L’entrée dans le cycle de Krebs et le métabolisme en son sein sont contrôlés. Le pyruvate peut être retransformé en glucose. Les 2 voies, glycolyse et néoglucogenèse ne sont bien sûr pas opérationnelles en même temps dans la cellule. Il y a donc des voies de régulation. La synthèse de l’actéyl CoA est quant à elle, une étape irréversible. L’acétyl CoA est un intermédiaire métabolique qui intervient dans différentes voies métaboliques. L’acétylCoA peut entrer dans deux voies métaboliques différentes: l’oxydation en CO2 via le cycle de Krebs avec création d’énergie ou la synthèse des lipides. 21 a) Régulation de la pyruvate déshydrogénase La pyruvate déshydrogénase joue un rôle important dans le cycle de Krebs. Son activité est régulée. Le complexe est inhibé par ses produits immédiats : le NADH et l’acétyl CoA. En présence d’un rapport ATP/ADP élevé, une kinase spécifique phosphoryle un résidu sérine de la pyruvate déshydrogénase, rendant celle-ci inactive. Si le rapport ATP/ADP est bas, une autre enzyme, une phosphatase, entre en jeu pour réactiver la pyruvate déshydrogénase en éliminant le groupement phosphate. b) Le cycle de Krebs est contrôlé à différentes étapes. Le cycle de Krebs est régulé essentiellement par la concentration d’ATP et de NADH. Les points de contrôle sont les enzymes isocitrate déshydrogénase et l’α-cétoglutarate déshydrogénase. L’isocitrate déshydrogénase est activée si la cellule est appauvrie en énergie et inhibée en présence de taux élevés d’ATP et de NADH. L’α-cétoglutarate déshydrogénase est inhibée par les produits de la réaction qu’elle catalyse et en présence d’un taux élevé d’ATP. La vitesse du cycle est donc réduite lorsque la cellule a un taux élevé d’ATP. Le cycle de Krebs est la voie majeure de dégradation du pyruvate pour la génération d’ATP. Ce cycle est un centre métabolique pour la cellule. Ainsi, les intermédiaires qui sont produits par le cycle de Krebs, interviennent aussi dans d’autres voies biosynthétiques. Si les intermédiaires du cycle sont utilisés pour des biosynthèses, cela signifie qu’ils doivent être régénérer. L’oxaloacétate peut être généré par carboxylation du pyruvate, réaction catalysée par la pyruvate carboxylase. Cette réaction consomme de l’énergie puisque de l’ATP est hydrolysé en ADP. Pyruvate carboxylase Pyruvate + CO2 + ATP + H2O oxaloacétate + ADP + Pi + 2H+ Néanmoins, comme le cycle de Krebs est un cycle, il peut être rechargé par la génération de n’importe lequel de ses intermédiaires. 22 Chapitre 3: La chaine respiratoire Le NADH et le FADH2 formés lors de la glycolyse et du cycle de l’acide citrique sont des molécules riches en énergie car elles possèdent chacune une paire d’électrons de haut potentiel de transfert. Plusieurs paires d’électrons de ce type sont générées. Ces électrons sont utilisés pour réduire l’oxygène en eau, libérant ainsi une grande quantité d’énergie qui peut être utilisée pour créer de l’ATP. La phosphorylation oxydative est le processus au cours duquel l’ATP est formé lorsque des électrons sont transférés du NADH ou du FADH2 à O2 par une série de transporteurs d’électrons. C’est l’aboutissement de la respiration cellulaire. Ce processus s’effectue grâce à un gradient de protons établi de part et d’autre de la membrane mitochondriale interne. 431. Introduction: La synthèse d’ATP par phosphorylations oxydatives Les électrons à haut potentiel de transfert sont les produits des réactions d’oxydoréduction. Forme oxydée + e- → forme réduite ΔG°’= -nF ΔE°’ Où ∆E°’ = différence de potentiel standard d’oxydoréduction à pH7 et 25°C défini par rapport à H2 → 2H+ + 2e- où E°’= 0 Ex : Pour l’oxydation du NADH et du FADH2 NAD+ + 2H+ + 2e- → NADH + H+ FAD + 2H+ + 2e- → FADH2 ΔE°’= - 0,32 V ΔE°’= - 0,22 V On peut donc calculer le ΔG°’ de leur oxydation : NADH → NAD+ + 2e-+ H+ ΔG°’= -2 × 96,48 kJ.mol-1 V-1× (+0,32V) = - 61 kJ.mol-1 ou -14,8 kcal.mol-1 FADH2 → FAD + 2e- + 2H+ ΔG°’= -2 × 96,48 kJ.mol-1V-1 × (+0,22V) = - 42 kJ.mol-1 ou -10,1 kcal.mol-1 23 L’oxydation du NADH et du FADH2 est exergonique. L’énergie libérée est utilisée pour créer un gradient de protons qui est ensuite utilisé pour la synthèse de l’ATP. L’oxydation du NADH et du FADH2 est couplée à la réduction d’O2 en H2O. Il y a un transfert des électrons captés par le NADH et le FADH2. NADH → NAD+ + H+ + 2eE’°= + 0,32 V ½ O2 + 2H+ + 2e- → H2O E’°= + 0,82 V ----------------------------------------------NADH + ½ O2 + H+ → H20 + NAD+ ΔG°’= -2 × 96,48 kJ.mol-1 V-1× 0,32V – 2 × 96,48 kJ.mol-1V-1 × 0,82V = -220,1 kJ.mol-1 Pour le FADH2 : FADH2 + ½ O2 → FAD + H2O Ces réactions ont un ΔG°’ < 0. Elles sont ensuite couplées avec la production d’ATP. La réduction très exergonique de l’oxygène moléculaire par le NADH et le FADH2 s’effectue via de nombreuses réactions de transfert d’électrons au sein d’un groupe de protéines membranaires composant la chaîne de transport des électrons. Le cycle de Krebs ne consomme pas d’O2 bien qu’il ne s’opère qu’en aérobie. Acétyl CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O → 2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP+2H++ CoA Nous avons vu que le NADH est un rétro-inhibiteur du cycle de Krebs. Comme il est aussi utilisé pour réduire l’O2, si l’activité du cycle diminue, la réduction d’O2 en H2O sera moins importante. Rem : un homme consomme environ 2000 kcal/jour, ce qui représente l’hydrolyse de 83 kg d’ATP. Comme le corps humain ne contient que 250 g d’ATP, une molécule d’ATP doit alors subir le cycle ADP Pi ATP 300 fois par jour. Historique: En 1935, Engelhardt découvre le rôle du dioxygène pour la production d’ATP en étudiant la respiration cellulaire dans les globules rouges. Il étudie la respiration sur des globules rouges, et observe leur capacité à produire de l’ATP, mais seulement en présence d’O2. Il établit donc un parallélisme entre la ventilation et la production d’ATP. Par contre, si les globules rouges sont lysés, il n’observe pas de production d’ATP (inhibition de la synthèse d’ATP), même en présence d’O2. De plus, si on ajoute de l’ATP, celui-ci est consommé. En fait, en lysant les globules rouges, il a libéré des ATPases qui clivent l’ATP. - En 1937, Kalckar met au point un test dans lequel l’activité biologique de l’ATPase est bloquée. Dans ce test, il ajoute l’hexokinase, dont le Km (= 10-6M) est nettement plus petit que le Km de l’ATPase (= 10-2M). L’hexokinase utilise donc l’ATP beaucoup plus rapidement que l’ATPase pour transformer le glucose en glucose-6P. (rappel: Km = concentration du substrat à laquelle la vitesse de réaction de l’enzyme est égale à la moitié de la vitesse maximale). Le dosage du glucose 6P donne la concentration d’ATP généré dans le test car l’hexokinase catalyse la réaction suivante : Glucose + ATP → glucose-6-phosphate + ADP 24 Kalckar montre ainsi qu’il y a une grande production d’ATP à partir d’extrait. En mesurant la concentration de glucose-6-phosphate, il établit un rapport ATP /O2(absorbé) valant 5. Comment sont produites ces molécules d’ATP? - Keelin, parasitologue, observe un changement de couleur des pattes de moustiques en fonction de leur mouvement: au repos ou agité. Au repos : Les pattes sont oxygénées (présence d’O2)  la molécule colorée est sous la forme oxydée Agitation : Les pattes ne sont pas fort oxygénées  forme réduite de la molécule  3 raies nettes dans le vert. Keelin met ainsi en évidence des protéines (les cytochromes « c ») présentes dans les mitochondries des cellules des pattes. Ces cytochromes ont un petit poids moléculaire et comportent un groupement hème apparenté à l’hème de l’hémoglobine. La découverte des cytochromes a permis la compréhension des phénomènes d’oxydoréduction à la base de la récupération d’énergie. Localisation: La phosphorylation oxydative et la synthèse de l’ATP ont lieu au niveau de la membrane interne des mitochondries. 25 On compte de 1 à 500 000 mitochondries par cellule. Une cellule cardiaque en comprend un millier. La membrane externe est perméable aux petites molécules tandis que la membrane interne est imperméable. Celle-ci est composée de 80% de protéines et 20% de lipides. 3.2. La chaine respiratoire a) Vue d’ensemble : La chaîne respiratoire, ou chaîne de transfert des électrons, est constituée de 4 complexes : 3 pompes à protons et un lien physique avec le cycle de l’acide citrique. Les électrons sont transférés du NADH à l’O2 à travers 3 complexes protéiques: la NADH-Q oxydoréductase (complexe I), la Q-cytochrome c oxydoréductase (complexe III) et la Cytochrome c oxydase (complexe IV). Le complexe II, la succinate Q-réductase, est un « complexe de branchement ». Tous les complexes sauf le II sont des pompes à protons, c’est-à-dire qu’ils éjectent des protons vers l’espace inter-membranaire de la 26 mitochondrie. Le flux d’électrons à travers ces complexes transmembranaires conduit au transport de protons à travers la membrane interne de la mitochondrie. Le complexe I récupère 2 électrons qui sont transportés au complexe III par la forme réduite du coenzyme Q aussi appelé ubiquinol. L’ubiquinone transfère aussi les électrons du FADH2 produit dans la succinate déshydrogénase du cycle de l’acide citrique vers le complexe III par l’intermédiaire du complexe II. Le cytochrome c, petite protéine, transporte les électrons du complexe III au complexe IV qui catalyse la réduction d’O2. Les complexes I et II sont spécifiques respectivement du NADH et du FADH2. Ils sont constitués de groupements prosthétiques (groupes qui contiennent des entités organométalliques). b) Entrée des électrons dans la chaîne au niveau de la NADH-Q oxydoréductase 27 Les électrons qui proviennent de l’oxydation du NADH en NAD+ lors du cycle de Krebs entrent dans la chaîne respiratoire au niveau de la NADH-Q oxydoréductase aussi appelée NADH déshydrogénase. Il s’agit d’une enzyme très volumineuse dont la masse est supérieure à 900 kDa et qui est constituée de 46 polypeptides. Ces protéines sont codées par les génomes cellulaire et mitochondrial. Elle joue un rôle de pompe à protons vers l’extérieur de la mitochondrie. La NADH-Q oxydoréductase a une forme de L avec un bras horizontal situé dans la membrane et un bras vertical dans la matrice mitochondriale. Elle comporte 2 types de groupes prosthétiques : la FMN et un centre Fe-S. La réaction qu’elle catalyse est : NADH + Q oxidoreductase + 5 H+ matrice → NAD+ + Qoxidoreductase-H2 + 4 H+cytosol Cette réaction permet le transfert de 2 électrons et de 2 H+ au complexe I et libère 4 H+ à l’extérieur de la mitochondrie. Le NADH se lie à un site du bras vertical de la NADH-Q oxydoréductase et transfère ses 2 électrons de haut potentiel au FMN. Le FMN, Flavine Mononucléotide, est un groupe prosthétique de type organique dont les entités réactives sont les azotes (tout comme le FAD). Elle fixe des protons lorsqu’elle est réduite. Un intermédiaire radicalaire semi-quinone peut être produit si la FMN n’accepte qu’un électron, ou si la FMNH2 ne cède qu’un électron. Les électrons transitent ensuite dans le bras vertical depuis le FMNH2 vers 3 centres 4Fe-4S. Les centres fer-soufre interviennent dans de nombreuses réductions dans des systèmes biologiques : Fe3+ + e- → Fe2+. Il existe plusieurs types de centres fer-soufre qui peuvent tous subir des réactions d’oxydo-réduction. Celles-ci s’effectuent généralement sans libération ou fixation de protons. a) Un seul ion fer est lié à 4 résidus cystéine de la protéine. b) Ce centre contient 2 ions fer et 2 sulfures inorganiques. Ils sont généralement coordinés à 4 résidus cystéine. c) Ce centre contient 4 ions fer, 4 sulfures inorganiques et 4 résidus cystéine. C’est ce type de centre que l’on retrouve dans l’aconitase. 28 Après être passés dans les centres fer-soufre de la NADH-Q oxydoréductase, les électrons sont transférés au coenzyme Q qui est ensuite réduit en QH2 (ubiquinol) par capture de 2 protons. Le QH2 formé peut diffuser dans la membrane. C’est le flux d’électrons du NADH au coenzyme Q par l’intermédiaire de la NADH-Q oxydoréductase qui conduit au pompage de 4 protons hors de la matrice mitochondriale. Le coenzyme Q est constitué d’isoprènes, ce qui le rend hydrophobe et donc soluble dans la bicouche lipidique composant la membrane. Le coenzyme Q contient une benzoquinone dont les 2 oxygènes sont ses entités réactives. L’addition d’un électron et d’un proton forme une semi-quinone radicalaire (QH.) qui est facilement déprotonné pour former un anion radicalaire semi-quinone (Q.-). L’addition d’un second électron et d’un proton forme l’ubiquinol (QH2), forme complètement réduite de Q. Q + 2 e- + 2 H+ → QH2 L’ubiquinol est le point d’entrée des électrons du FADH2. L’enzyme succinate déshydrogénase qui permet l’oxydation du succinate en fumarate dans le cycle de Krebs 29 fait partie du complexe II: le complexe succinate-ubiquinone réductase. Ce complexe est une protéine de la membrane mitochondriale interne. Les électrons du FADH2 sont transmis à des centres fer-soufre puis à Q pour entrer dans la chaîne de transport des électrons. Le FADH2 ne quitte donc pas le complexe. D’autres entités interviennent pour transférer leurs électrons du FADH2 à Q. Ce dernier est ensuite réduit en QH2. Contrairement aux autres complexes, le complexe II n’est pas une pompe à protons. L’oxydation du FADH2 en FAD génère 4 H+ de moins que celle du NADH. Par Hème conséquent, moins d’ATP est formé par l’oxydation du FADH2 que par celle du NADH. Intéressons-nous au transfert des électrons de Q au cytochrome c via la QCytochrome c oxidoréductase. Celle-ci est la deuxième pompe à protons de la chaîne. Il catalyse le transfert des électrons de QH2 au cytochrome c oxydé. Il pompe en même temps des protons hors de la matrice mitochondriale. QH2 + 2 cyt. cox + 2 H+matrice → Q + 2 cyt. cred + 4 H+cyto Structure du complexe III: - 11 polypeptides - 3 groupements hèmes : 2 hèmes de type b, bL (low affinity) et bH (high affinity) au sein du cytochrome b, un hème de type c au sein du cytochrome c1. - 1 protéine fer-soufre avec un centre 2Fe-2S. Il est assez inhabituel car un des ions fer est coordiné à 2 résidus histidine et non cystéine comme c’est habituellement le cas. C’est ce centre qui est impliqué dans le transfert des électrons au cytochrome c. Un cytochrome est une protéine qui transfère des électrons. Il contient un groupe prosthétique hème qui est un groupement organométallique contenant un atome de fer coordiné à 4 azotes. Au cours du transfert des électrons, l’atome de fer change d’état d’oxydation. L’hème des cytochromes c est lié par covalence à la protéine via des liaisons de type thioester au niveau du soufre des cystéines. 30 c) Le cycle Q: Le cycle Q correspond au transfert des électrons de Q au cytochrome c et au transport transmembranaire des protons. Il permet le passage des électrons de l’ubiquinol, qui peut transporter 2 électrons, au cytochrome c, qui ne peut en transporter qu’un. En effet, le cytochrome c ne comporte qu’un groupement hème et donc qu’un seul atome de fer. Par conséquent, un seul électron est utilisé pour la réduction du Fe3+ en Fe2+. Le cytochrome est une protéine hydrosoluble mobile qui est adsorbée à la face externe de la membrane interne de la mitochondrie. Le cytochrome c est adsorbé à la membrane grâce à sa composition riche en acides aminés basiques portant de nombreuses charges positives qui peuvent interagir avec les charges négatives des phospholipides composant la membrane. Le complexe III contient 2 sites de liaison pour l’ubiquinone : Q0 et Qi, ce dernier est situé plus près de l’intérieur de la matrice. L’ubiquinol se fixe au site Q0 et transfère ses électrons l’un après l’autre. Ses protons sont libérés du côté du cytosol. Le premier électron est transféré au cytochrome c via le centre 2Fe-2S et le cytochrome c1. Le cytochrome c passe de la forme oxydée à la forme réduite. Il peut ensuite diffuser à l’extérieur de l’enzyme. Le deuxième électron est transféré au cytochrome bL, au bH, puis à un Q lié au site Qi. La quinone est réduite en un anion semi-quinonique Q.- . Au niveau du site Q0, le Q se dissocie puis est remplacé par un nouveau QH2 qui va réagir de la même façon: un des électrons est transféré via le centre 2Fe-2S et le cytochrome c1 pour réduire un deuxième cytochrome c. L’autre électron est transféré au cytochrome bL, au bH, puis au QH.- lié au site Qi. En même temps qu’il reçoit le deuxième électron, Q.- capte 2 protons du côté matriciel pour former QH2. Bilan du cycle: oxydation de 2 QH2 en 2 Q, réduction d’un Q en QH2, réduction de 2 cytochrome c, libération de 4 protons du côté cytoplasmique et extraction de 2 protons du côté de la matrice mitochondriale. Tous les électrons ont été transférés au cytochrome c. Lorsqu’il est réduit (Fe3+ → Fe2+), le cytochrome c se dissocie du complexe III et entre en interaction avec le complexe IV auquel il transfère son électron. 31 Ensuite, on observe le transfert des électrons du cytochrome c à la cytochrome c oxydase (complexe IV). La phase finale de la chaîne de transport des électrons est l’oxydation du cytochrome c (réduit précédemment par le complexe III). Cette oxydation est couplée à la réduction d’O2 en 2 molécules d’H2O. C’est le complexe IV qui catalyse cette réaction. La cytochrome c oxydase est composée de 13 polypeptides dont 3 sont codés par le génome mitochondrial. Il contient 3 groupes prosthétiques (Hème a, a3, centre Cu) dont 2 avec du cuivre, ce qui fait un total de 3 ions de cuivre : 2 dans un centre CuA/CuA où ils sont liés par des cystéines et un 3e, CuB, coordinné à 3 résidus histidines. C’est le centre CuA/CuA qui accepte l’électron du cytochrome c réduit (Cu2+ → Cu+). Cycle catalytique: 4 cyt. C (red.) + 8 H+ matrice + O2 → 4 cyt. C (ox.) + 2 H2O + 4 H+ cyto. 32 1) Au début du cycle, tous les groupes prosthétiques sont oxydés. Un cytochrome c réduit transfère son électron au centre CuA/CuA puis à l’hème a et finalement à l’hème a3, pour réduire le CuB (Cu2+ → Cu+). 2) Un deuxième cytochrome c cède son électron qui suit le même chemin que le premier, mais en s’arrêtant à l’hème a3 en réduisant son fer (Fe3+ → Fe2+). C’est sous cet état d’oxydation que le fer peut se lier à l’oxygène. 3) La cytochrome c oxydase contient du cuivre et du fer à l’état réduit permettant la fixation d’oxygène. 4) Le centre Fe2+ fixe l’oxygène. 5) L’oxygène lié à l’hème a3 est réduit en peroxyde (O22-) par la présence de CuB. Il y ainsi création d’un pont peroxyde entre le Fe3+ de l’hème a3 et le CuB2+. 6) Une troisième molécule de cytochrome c cède son électron tandis qu’un proton est capturé. La liaison O-O est clivée. On a donc un groupe ferryl Fe4+=O et un Cu2+-OH. 7) Grâce à un quatrième électron et à un deuxième proton, le groupe ferryl est réduit en Fe3+-OH. 8) Deux protons supplémentaires sont pompés de la matrice mitocondriale pour la formation et la libération de 2 molécules d’eau. L’enzyme revient ensuite dans sa forme totalement oxydée initiale. Les quatre protons de cette réaction viennent de la matrice. Quatre protons « chimiques » sont captés sur la face matricielle pour réduire O2 en H2O. Quatre protons « pompés » supplémentaires sont transportés hors de la membrane et libérés sur la face cytoplasmique lors de la réaction. Ces protons pompés augmentent l’efficacité de la mise en réserve d’énergie libre sous la forme d’un gradient de protons. Bilan: On établit un gradient de protons de part et d’autre de la membrane mitochondriale. L’oxydation de NADH entraîne + l’expulsion de 10 H : NADH → NAD+ + 2 e- 33 L’oxydation du FADH2 ne libère que 6 H+ : FADH2 →FAD + 2 eCette différence s’explique par le fait que le complexe II n’est pas une pompe à protons. On observe plusieurs chutes d’énergie libre lorsque les électrons passent du NADH vers l’O2 à travers les complexes I, III et IV. Groupements hèmes: Différents groupes hèmes sont présents dans les complexes de la chaîne respiratoire. Ils sont tous composés d’un atome de fer au milieu d’un groupement organique, la porphyrine. * Hème du cytochrome b: ne se lie pas par lien covalent avec la protéine. C’est le type d’hème qu’on retrouve dans l’hémoglobine et la myoglobine. * Hème du cytochrome c: contrairement à l’hème du cytochrome b, il est lié par covalence à la protéine. Les liaisons sont de type thioéther entre les groupes sulfhydriles de résidus cystéines et les groupes vinyles de l’hème. *Hème du cytochrome a: diffère de l’hème du cytochrome c de trois façons : il n’est pas lié par covalence à la protéine, un aldéhyde remplace un groupe méthyle et une chaîne hydrocarbonée en C15 remplace un des groupes vinyle. d) Conservation du cytochrome c au cours de l’évolution des espèces: Le cytochrome c est présent dans tous les organismes possédant des chaînes respiratoires mitochondriales. Il a évolué il y a plus de 1,5 milliards d’années et sa fonction a été conservée durant toute cette période. Ceci a été mis en évidence par le fait que le cytochrome c de n’importe quelle espèce eucaryote réagit in vitro avec le cytochrome c oxygénase de n’importe quelle autre espèce. De plus, on a observé que certains cytochromes des procaryotes, comme ceux d’une bactérie 34 photosynthétique ou dénitrifiante, ressemble assez fort au cytochrome c des mitochondries du cœur du thon. Ces observations montrent que le cytochrome c est une solution efficace de l’évolution dans le transfert des électrons. La similitude des cytochromes c se marque sur la séquence des acides aminés : 26 des 104 acides aminés du cytochrome c ont été conservés depuis plus d’1 milliard d’année. Un arbre phylogénétique a pu être établi à partir de la séquence en acides aminés des cytochromes c. Il montre les relations évolutives entre plusieurs espèces. La longueur des branches est proportionnelle au nombre de variations des acides aminés. Chapitre 4 : La synthèse d’ATP Le transfert de 2 électrons du NADH vers le dioxygène (O2) pour former une molécule d’eau est un processus exergonique: ∆G°= -52,6 kcal. mol-1 ou -220,1kJ/mol. ½ O2 + 2H+ + 2 e- → H2O E0’= 0, 82 V + + + NAD + 2H + 2 e- → NADH + H E0’= -0, 32 V Puisque la demi-réaction de réduction du NAD+ en NADH possède le potentiel redox standard le plus négatif, le NADH va être oxydé alors que le dioxygène sera réduit. La réaction globale s’écrit : NADH + ½ O2 + H+ → H2O + NAD+ ∆ E0’= 1,14 V Comme ∆G°’= -nF ∆E0’, la variation d’énergie libre standard d’oxydation du NADH est égale à -52,6 kcal. mol-1. Comment l’oxydation du NADH est-elle couplée à la formation d’ATP (processus endergonique) ? ADP + pi + H+ ATP+H2O 4.1 Hypothèse de Peter Mitchell (1961) Son idée est que le transfert d’électrons et la synthèse de l’ATP sont couplés par formation d’un gradient de protons (ou couplage chimiosmotique). Nous avons vu que la chaîne de transfert des électrons conduit au pompage de protons de la matrice vers le côté cytosolique de la membrane mitochondriale interne. La concentration en H+ devient plus importante dans l’espace inter-membranaire que dans la matrice, la face matricielle est alors chargée négativement. Cela crée un champ électrique. Cette force protomotrice apporterait l’énergie nécessaire à la synthèse de l’ATP par l’ATP synthase. On peut calculer la quantité d’énergie libre associée à ce gradient de protons. H+ matrice → H+ extérieur Δ G = 2,303 RT log 10 [ H + ext . ] + ZF Δ V [ H + matrice ] 35 Où Z = charge électrique de l’entité transportée ∆V = potentiel électrique à la membrane Or pH= - log [H+] ∆G = 2,303 RT (- log 10[H+ matrice] + log 10[H+ extérieur]) + ZF∆V ∆G = 2,303 RT (pH matrice – pH extérieur) + ZF∆V Le pH extérieur est de 1,4 unité plus bas que le pH matrice et ∆V = 0,14 V ∆G = (2,303 x 8,32 x 10-3 x 310 x 1,4) + (1 x 96,48 x 0,14) = 21,8 kJ/mol ou 5,2 kcal/mol. Le transport d’H+ de la matrice mitochondriale vers l’espace inter-membranaire correspond à une énergie libre de 5,2 kcal/mol d’H+. Plusieurs observations expérimentales sont en faveur de l’hypothèse de Mitchell: 1) L’ajout d’un détergent à une suspension de mitochondries abolit la synthèse d’ATP. Le détergent détruit la bicouche lipidique de la membrane. Cette expérience met donc en évidence le rôle de la compartimentation de la mitochondrie. 2) Isolement d’une ATP synthase mitochondriale, enzyme capable de générer l’ATP à partir d’ADP et de Pi. 3) Des vésicules synthétiques ont été préparées, contenant de la bactériorhodopsine et de l’ATP synthase. La bactériorhodopsine est une protéine qui pompe des protons lorsqu’elle est activée par une source lumineuse. Ainsi, exposées à la lumière, ces vésicules synthétisent de l’ATP. La chaîne respiratoire et l’ATP synthase sont donc des systèmes biochimiquement séparés. Ils sont uniquement liés par une force protomotrice. 4.2 L’ATP synthase a) Structure de l’ATP synthase: L’ATP synthase est constituée de 2 sous-unités: - F0 est le domaine hydrophobe qui traverse la membrane interne. C’est une structure cylindrique, anneau c, composée de canaux à protons (10 à 14 selon les espèces). Une sous-unité a est associée à l’anneau c et à la sous-unité b qui solidarise F0 et F1. 36 - F1 est le domaine extra-membranaire qui pointe vers la matrice mitochondriale. Il est constitué de 5 types de chaînes polypeptidiques : α, β, γ, δ et ε. Les 3 sous-unités α et les 3 sous-unités β sont agencées autour de la sous-unité γ. α et β se ressemblent du point de vue structural, mais seul β possède l’activité catalytique de synthèse d’ATP. La tige centrale est constituée de γ et ε. La sous-unité γ est très asymétrique. Chaque sousunité β est donc associée différemment avec la sous-unité γ. F0 et F1 sont liés de 2 façons : par la tige centrale γε et par une colonne extérieure constituée d’une sous-unité a, de la sous-unité b2 et de la sous-unité δ. L’anneau c et la tige γε sont les parties mobiles de l’enzyme, tandis que le reste de la molécule est statique. b) Rôle de l’ATP synthase: L’ATP synthase catalyse la formation d’ATP à partir d’ADP et de Pi. ADP 3- + HPO42- + H+ ATP 4- + H2O Mécanisme: Un atome d’oxygène de l’ADP attaque le phosphore du Pi ce qui forme un intermédiaire pentacovalent. Son hydrolyse libère de l’ATP et bien sûr, de l’eau. Des expériences d’échange isotopique ont permis de montrer comment le flux de protons fournit l’énergie nécessaire à la synthèse de l’ATP. Celles-ci consistaient à incuber de l’ATP synthase avec de l’ADP, du Pi et H218O. On observe que l’ATP se forme facilement en absence de protons. 18O est incorporé dans le Pi lors de la synthèse d’ATP et est ensuite hydrolysé, conduisant à la formation de Pi « lourd ». L’ATP synthase a des affinités différentes pour l’ATP et l’ADP : - ATP; Kd <10-12M - ADP; Kd ~ 10-5M Le rôle du gradient de protons n’est donc pas de former l’ATP mais de le dissocier et de le libérer du site catalytique. 37 4.3 Modèle de Paul Boyer (prix Nobel 1997) Sur base de ces observations, Paul Boyer propose un mécanisme de synthèse de l’ATP par changement de conformation et d’affinité. Selon lui, des changements de propriétés des sous-unités β de l’ATP synthase permettent la liaison entre l’ADP et le Pi, la synthèse de l’ATP et sa libération. La sous-unité γ est en rotation et a des interactions différentes avec les 3 sous-unités β. Celles-ci peuvent adopter 3 conformations qui ont des affinités différentes pour les substrats: - Conformat