Negativ Strang RNA-Viren Vorlesung 2024 PDF

Negativ Strang RNA Viren — PD Dr. Thomas Grunwald RSV wird immer noch stark unterschätzt ! Vertraulich Leasons learned - Corona-Pandemie (CoVID-19) - Masken, Virusdiagnostik und Desinfektion sind ein effektiver Schutz, um die Verbreitung von respiratorischen Erregern abzuschwächen (verhindern) - Nat...

Negativ Strang RNA Viren — PD Dr. Thomas Grunwald RSV wird immer noch stark unterschätzt ! Vertraulich Leasons learned - Corona-Pandemie (CoVID-19) - Masken, Virusdiagnostik und Desinfektion sind ein effektiver Schutz, um die Verbreitung von respiratorischen Erregern abzuschwächen (verhindern) - Nationale Institute (RKI, PEI) und wissenschaftliche Gremien (insb. STIKO, u.a.) können die Politik effizient beraten und behalten den Überblick über das globale Wissen. Einschneidende Entscheidungen benötigen Zeit. - Interaktion zwischen internationalen Gremien, Behörden, der Industrie und molekularbiologisches Wissensträgern führt zu schnellen Erkenntnissen und zu einer wirksamen Pandemiebekämpfung (Vergleich Influenza u.a.) - Inzidenzraten sind wichtig, um Verbreitungsgeschwindigkeiten zu messen Taxonomie – Negativ-Strang (RNA) Viren  Mononegavirales Rhabdoviridae Bornaviridae Paramyxoviridae Filoviridae  Arenaviridae  Bunyaviren  Orthomyxoviren 4 © Fraunhofer Paramyxoviridae – Virion im EM und schematisch Masernvirus im EM Page 5 6/2/2022 © Fraunhofer IZI RSV im EM Paramyxoviridae – Infektion – Replikation - Vermehrung  Einfacher Vermehrungszyklus  Keine Lantenz  Replikation im Zytoplama mit Hilfe einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase Page 6 6/2/2022 © Fraunhofer IZI Paramyxoviridae – Genomaufbau PIV-3 Mumps Masern RSV Einige Besonderheiten der Nutzung der (–) Strang RNA bei Paramyxoviren:  Genome sehr ähnlich aufgebaut  -ssRNA; nicht-segmentiert; Gene durch konservierte Sequenzbereiche getrennt  3´Leader- und Promotorsequenz führt zu +ssRNA Matrize; 5´Trailer-Sequenz  RNA-Editing: Expression unterschiedlicher Proteine aus einem mRNA-Transkript  Alternative Nutzung von Startcodons für die Translation Page 7 6/2/2022 © Fraunhofer IZI Paramyxoviridae – Replikation im Detail - Expressionsgradient  Minusstrang-Genom wird durch die RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des L-Proteins in mRNA transkribiert  Von mRNAs werden die Proteine translatiert  RNA-Pulsstrang dient als Matrize für die Bildung der RNA-Minusstränge Page 8 6/2/2022 © Fraunhofer IZI Replikation im Detail - Expressionsgradient FIGURE 2. Nucleocapsid (NC) architecture. (A) Illustration of the bipartite promoter organization by example of the MuV NC (EMD-2630; Cox et al., 2014). N protein protomers encapsidating promoter regions in genomic RNA are highlighted in tan. (B) Typical ‘herring-bone’ structure of the paramyxovirus NC. (C) The paramyxovirus N protein is composed of two core domains (NCore), NTD (blue), and CTD (tan). A schematic of the N protein is shown below the cartoon model. For paramyxoviruses, the extreme C-terminus of N, NTail, extends out from the NC and interacts with P. (D) Extensions from these domains, N-arm and C-arm interact with neighboring N subunits in the helical NC. (D,E) N subunits assemble side by side along the genomic RNA. (E) The structure of the RSV NC showing the encapsidated RNA in red. PDB code 4BKK (Bakker et al., 2013). The insert shows an enlargement of a single N protein protomer, color coded as in (C). Seite 9 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Cox Front Micro 2015; doi.org/10.3389/fmicb.2015.00459 RNA-Replikation über das L-Protein Illustration of the NC-P-L replication complex. The unique orientation of the MuV P tetramer places both PNTD and PCTD at each end of the P tetramer. We hypothesize that PNTD and PCTD act together to induce changes in NC for viral RNA synthesis by vRdRp. The primary role of PCTD is to target the vRdRp to the NC. PNTD acts primarily to uncoil the MuV NC and allow vRdRp to gain access to the sequestered vRNA. Robert Cox, et al., 2014 PNAS: Structural studies on the authentic mumps virus nucleocapsid showing uncoiling by the phosphoprotein Seite 10 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Paramyxoviren - Infektion von Zellen - Fusionsvorgang Seite 11 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Paramyxoviridae  Masern (Measles)  Mumps (Rubella)  Respiratorisches Syncytial Virus (RSV)  Parainfluenzaviren (PIV)  Metapneumovirus (hMPV) Seite 12 23.04.2024 © Fraunhofer IZI History of human respiratory syncytial virus (RSV) R. Chanock 1924 - 2010 13 4/23/2024 © Fraunhofer IZI Illustration created with BioRender.com RSV disease High-risk population 14 infants elderly immunocompromised patients 4/23/2024 © Fraunhofer IZI Annual burden in children 33,000,000 acute infections 3,000,000 hospitalizations 120,000 deaths Openshaw et al. 2017 Li et al. 2022 Das Respiratorische Syncytial Virus (RSV) DAS Kinderhustenvirus Weltweite Verbreitung (Subgruppen= Serotypen A u. B) Ausschließlich Mensch als natürliches Reservoir bekannt Übertragung: Tröpfcheninfektion, aerogen, Schmierinfektionen? (Türklinken) Initiale Vermehrung auf Nasen- und Rachenepithel Durchseuchung: Vollständig im 2. Lebensjahr Epidemisches Auftreten Häufung der Erkrankungen im Winter  Verwandt: Humanes Metapneumovirus (hMPV) Immunschutz: Seite 15 unzureichend, Impfung Reinfektionen bereits im Säuglings- und Kleinkindalter 23.04.2024 © Fraunhofer IZI RSV-Klinik Vergleich der Patientengruppen Inkubationszeit 3-5 Tage Erstinfektion überwiegend symptomatisch; leichter bis schwerer grippaler Infekt, Fieber, Schnupfen Pharyngitis, Tracheitis, Bronchitis, Bronchiolitis bis Pneumonie 5% der Kinder entwickeln Pseudokrupp Lebensbedrohlicher Verlauf selten, aber wenn, dann in den ersten vier Lebensmonaten Kinder, die schwere RSV-Infektion durchgemacht haben, weisen erhöhtes Asthma Risiko auf Bei Älteren > 65 Jahre RSV 5%; 1/3 Arztkontakt; problematisch bei chronischen Herz-Lungen-Erkrankte: 7% pro Jahr 80% davon Arztkontakt; 16% stationär; Generell: Verlauf ähnlich Influenza Außerdem: RSV-Nachweis in 10% der wegen Atemwegsinfektionen stationär aufgenommen Patienten >65 oder chronisch-Erkrankten Seite 16 23.04.2024 © Fraunhofer IZI RSV-Saison Reiche et al., J Virol. 2009  RSV Saison von Herbst bis Frühjahr  RSV-Ausbrüche sind variabel  Normalerweise zweiphasiger Zyklus Seite 17 23.04.2024 © Fraunhofer IZI RSV: Therapie-Impfung RSV-Impfstoffe seit 2023 auf dem Markt (Protein-Impfstoffe) Passive Immunisierungen mit Antikörper sind wirksam (Impact-Study 1998) Palivizumab wurde 5 malig monatlich im verabreicht, nun Nirsevimab mit verlängerter Halbwertszeit Ribavirin kann bei schweren Krankheitsverläufen gegeben werden, Datenlage aber nicht eindeutig Seite 18 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Fusion of RSV mediated by structure conformation change of RSV-F D25 antibody-prefusion F complex Viral membrane Cell membrane Fused membrane Prefusion-F Intermediate Postfusion-F Postfusion F trimer Prefusion F trimer Neutralizing potency 19 4/23/2024 © Fraunhofer IZI Location Griffiths et al.· 2017; Graham 2017; McLellan et al. · 2013 Targeting RSV fusion by DNA nanostructures Identification of a linear binding motif of the antibody against prefusion RSV-F (D25) In silico analysis of D25-prefusion F complex Starting point for inhibitor design Issmail et al. 2022 20 4/23/2024 © Fraunhofer IZI Targeting RSV fusion by DNA nanostructures Structure-activity relationship analysis & optimization of lead peptide Alanine-scanning analysis Issmail et al. 2022 21 4/23/2024 © Fraunhofer IZI Targeting RSV fusion by DNA nanostructures In vitro evaluation of selected peptide inhibitor Issmail et al. 2022 22 4/23/2024 © Fraunhofer IZI IC50, half-maximal inhibitory concentration h, hour Pep30 Pep30 Targeting RSV fusion by DNA nanostructures In vivo evaluation of selected peptide inhibitor Peptide RSV LOD LOD Issmail et al. 2022 23 4/23/2024 © Fraunhofer IZI BALF, bronchoalveolar lavage fluid LOD, limit of detection = 50 RNA copies Mann–Whitney U test; ** , P < 0.01 Targeting RSV fusion by DNA nanostructures Functional evaluation of peptide-DNA construct Dose-response Cytotoxicity controls IC50 27 nM LOD Issmail et al. 2022 24 4/23/2024 © Fraunhofer IZI DBCO, dibenzocyclooctyne LOD, limit of detection = 50 RNA copies Mann–Whitney U test; ** , P < 0.01 Targeting RSV entry by small molecules Dicaffeoylquinic acid (DCQA) DCQA 2x caffeic acid quinic acid Lead structure for designing RSV inhibitors 25 4/23/2024 © Fraunhofer IZI Protective effects in plants Biomedical and antiviral applications Low toxicity Isomerization Low stability Targeting RSV entry by small molecules In vitro evaluation Activity against RSV strains Activity on different cell lines Chemical stability via HPLC DCQA Effects on cell viability Activity in presence of lung fluid 2f Issmail et al. 2023 26 4/23/2024 © Fraunhofer IZI IC50, half-maximal inhibitory concentration LLC1, mouse Lewis lung carcinoma cells HPLC, high-performance liquid chromatography CC50, half maximal cytotoxic concentration A549, human lung carcinoma cells rt, retention time BALF, bronchoalveolar lavage fluid Vero E6, African green monkey kidney cells Targeting RSV entry by small molecules Mode of action Prophylactic activity Therapeutic activity Issmail et al. 2023 27 4/23/2024 © Fraunhofer IZI Washout assay Time-of-addition assay Masern Nakai et al., JVI, 1969 Seite 28 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Klinik der Masernerkrankung Schwere, hochfieberhafte Erkrankung, selten asymptomatisch. Erwachsene erkranken besonders schwer! Inkubationszeit 9-11 Tage Erste Symptome: Bindehautentzündungen, Lichtscheue, Husten, Schnupfen, schnell ansteigendes Fieber Sicheres Zeichen für eine Maserninfektion sind die Koplikschen Flecken in der Mundschleimhaut Nach 2-3 Tagen fällt das Fieber wieder ab. Danach Fieberanstieg auf 40°C mit Hautausschlag zuerst hinter den Ohren und Nackenbereich, dann Gesicht und später über den gesamten Körper. Exanthem klingt nach 2-3 Tagen wieder ab, symptomatische Phase dauert noch 10 Tage Komplikationen: Pneumonie, Bronchopneumonie, Mittelohrentzündung, Thrombocytopenie, parainfektiöse Enzephalitis bzw. postinfektiöse Autoimmunencephalitis Seite 29 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Die Masernerkrankung – wichtige und interessante Features Einziger Empfänger für Masern ist der Mensch. Die Erkrankung ist schon lange bekannt. Das Virus ist hochansteckend. Epidemien im Zuge der höheren Bevölkerungsdichte im späten Mittelalter beschrieben. Die europäischen Eroberer schleppten das Masernvirus auf den amerikanischen Kontinent mit. Schwere Epidemien in der indianischen Bevölkerung mit tödlichen Krankheitsverläufen (ähnliche Berichte bei Fidji, Faröer Inseln und Afrika) Das Masernvirus ist sehr empfindlich gegenüber äußeren Einflüssen, wie erhöhten Temperaturen, Licht, UV-Strahlen, fettlösenden Substanzen und Desinfektionsmittel. Masernviren sind antigenisch stabil und bilden nur einen Serotyp. Jedoch unterscheidet man 20 Genotypen, die in acht Stämme eingeteilt werden (A-H). Virus-neutralisierende Antikörper sind hauptsächlich gegen das virale Oberflächenglykoprotein Hämagglutinin gerichtet. Seite 30 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Masern-Enzephalitiden  parainfektiöse Enzephalitis bzw. postinfektiöse Autoimmunenzephalitis:  bei 1 von 1000-2000 Maserninfektionen, Kindern >2 Jahre,  tritt mit oder eine Woche nach Exanthem auf  Entmarkung der Myelinscheiden durch Autoimmunreaktion  Bei Immunsupprimierten/zellulären Immundefekten verläuft Maserninfektion mit keinem oder kaum einem Masernexanthem auf  Es können sich als schwere Organkomplikationen eine progrediente Riesenzellpneumonie oder die Masern-Einschlusskörper-Enzephalitis (MIBE) entwickeln  Letalität etwa 30 %  SSPE: subakute sklerosierende Panenzephalitis  Häufigkeit 1:1 Mio. Infektionen: seltene Spätfolge nach Jahren der Viruspersistenz  Immer tödlich Seite 31 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Masern sind noch nicht eradiziert  Ausbrüche und Wiederaufflammen der Masern in NRW, Hessen, Mecklenburg-Vorpommern und Bayern in den letzten 10 Jahren  Dramatisches Auftreten der Masern im Frühjahr 2006 in NRW mit 1700 Infektionsereignissen, davon 263 stationäre Behandlungen mit schweren Komplikationen (6 Encephalitiden, 1 Meningitis)  Ausbruchsursache: unzureichende Herdimmunität, als Folge von steigender Impfkritik und damit nachlassender Durchimpfung der Bevölkerung  Kontrolle der eigenen Immunität: Kontrolle des Impfausweises: 2 Impfungen für einen guten Schutz notwendig; durchgemachte Masern schützen lebenslang (?), Immunitätskontrolle beim Arzt durch Blutentnahme feststellbar (IgG-Status)  2010 Ausbruch in Essener Waldorfschule Seite 32 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Masern Impfung  Impfstamm: attenuiertes Masernvirus (Stamm Schwarz)  Schutzwirkung lang anhaltend. Entstanden durch Adaptation an bebrüteten Hühnereiern und mehrfacher Passagierung in CEFs.  Verfügbar als Monovakzine, meist aber mit Mumps und Röteln kombiniert als MMR-Impfstoff  Kinder sollten ab dem 15. Lebensmonat geimpft werden (2 Mal)  Personen mit unklarem Impfstatus, ohne Impfung oder mit nur einer Impfung in der Kindheit sollten geimpft werden  Postexpositionsprophylaxe möglich durch Gabe innerhalb von 96 Stunden nach Kontakt vorzugsweise mit dem MMR-Impfstoff Seite 33 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Pathogenese des Mumpsvirus Tröpfcheninfektion in die Schleimhaut des Rachens, Hals- und Nasenraumes, Vermehrung in Epithelzellen Infektion von Lymphozyten, Transport zu Lymphknoten, Ausbreitung im Blut Infektion von Speicheldrüsen, Pankreas, Testes, Ovarien mit Zellzerstörung Systemischen Infektion mit Virus-Ausscheidung im Speichel, Urin Körper reagiert mit Schwellungen, generalisiertem Exanthem, Virämie kann zur Infektion der Gehirn- und Rückenmarkshäuten führen, mglw. Virusvermehrung im ZNS Durchgemachte Erkrankung hinterlässt lebenslange Immunität (!) Infektion führt zur Bildung von IgM, IgA und IgG-Antikörper, nachweisbar im ELISA Diagnostik einer aktuellen Infektion durch RT-PCR Schwellung der Parotis Parotitis Teigige nicht abgrenzbare Schwellung, fast immer einseitig! Seite 34 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Mumps – wichtige und interessante Features Erkrankung bricht zwei bis drei Wochen nach Kontakt aus. 30% der Erkrankungen asymptomatisch 95% der symptomatischen Erkrankungen Entzündungen der Speicheldrüsen (va. Ohrspeicheldrüse) mit starken Schwellungen Mäßiges Fieber 10% bekommen eine Menigoenzephalitis 25% der erkrankten Männer Hodenentzündung (Orchitis) mit Sterilität nach durchlaufener Pubertät 1-5% der Frauen entwickeln Eierstockentzündungen ohne weitere Komplikationen Virusinfektion und Entzündung von Pankreas, Schilddrüse und Nieren Spätfolgen: Schwerhörigkeit, mglw. Diabetes mellitus Seite 35 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Die Impfung gegen das Mumpsvirus Impfung durch einen attenuierten Virusstamm (im 2. Lebensjahr) Adaptation an bebrütete Hühnereier und anschließende Kultivierung in CEFs Molekulare Basis der Attenuierung nicht bekannt Keine Therapie vorhanden Verlauf der Mumpsinfektionsrate nach Einführung der Vakzine in den USA Seite 36 23.04.2024 © Fraunhofer IZI Contact — PD Dr. Thomas Grunwald Preclinical Validation Department of Vaccines and Infection Models [email protected] Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI Perlickstraße 1 04103 Leipzig www.izi.fraunhofer.de