MiBi VL6 Genom, Gentransfer und Replikation PDF

Struktur, Replika琀椀on und Transfer von mikrobiellen Genomen Prof. Haike Antelmann Institut für Biologie - Mikrobiologie  Struktur, Replika琀椀on und Transfer von mikrobiellen Genomen 1. Genome und DNA Struktur 2. DNA Replikatio...

Struktur, Replika琀椀on und Transfer von mikrobiellen Genomen Prof. Haike Antelmann Institut für Biologie - Mikrobiologie  Struktur, Replika琀椀on und Transfer von mikrobiellen Genomen 1. Genome und DNA Struktur 2. DNA Replikation 3. Gentransfer (Transformation, Transduktion, Konjugation) Genome und DNA Struktur  1995: 1. Genom eines Mikroorganismus entschlüsselt 580.000 bp Haemophilus in昀氀uenzae Fraser, et al. Microbial Genome Sequencing. Nature 406:799-803 4 Aus: Slonczewski, Foster, Mikrobiologie, 2.Auflage, Springer Verlag 2012  Genomgrößen von Viren, Bakterien, Menschen Wollte man die Basenpaare zählen (1 Paar pro Sekunde), bräuchte man dazu: Virus-Genom (3000 bp) = 1 Seite mit 3.000 Buchstaben = 50 Minuten Bakterien-Genom (3 Mio bp) = 1 Buch mit 1.000 Seiten = 34 Tage Menschen-Genom (3 Mrd bp) = 1 Bibliothek mit 1.000 Büchern = 95 Jahre Genomgrößen von Mikroorganismen  Das Chromosom von E. coli 4.639.221 bp 4288 ORFs Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson Gene im Genom von Bacillus subtilis http://subtiwiki.uni-goettingen.de/v3/index.php  DNA building blocks: Desoxyribose, purine and pyrimidine bases Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  DNA building blocks: Nucleotides are linked via Phosphodiester bonds Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  DNA synthesis from 5‘-phosphate to 3‘-OH Pyrophosphat dNTP Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  The structure of double-stranded DNA DNA form G:C and A:T base pairs The DNA double helix has anti-parallel strands Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson The structure of double-stranded DNA The DNA double helix has anti- parallel strands The DNA double helix has minor and major grooves One helix turn = 10.3 bp / 3.4 nm  Organisation of the bacterial nucleoid Nucleoid: DNA and DNA- associated proteins form a compact structure DNA in the nucleoid is in direct contact with the cytoplasm Compactness of the nucleoid varies with growth conditions DAPI-stain of the nucleoid (50% of cell volume) Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Organisation of the DNA in the bacterial nucleoid Osmotic lysed E. coli cell (black)  Organisation of the bacterial nucleoid The chromosome of E. coli is a circular DNA with 1 mm length - but: the entire cell is about 1-3 m in length ! How is the compactness of the DNA achieved and how this highly compact DNA allows replication and transcription ? Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Das bakterielle Chromosom Bakterien haben ein geschlossenes zirkuläres Chromosom Bildet > 50 Schleifen ausgehend vom Zentrum (Origin), die strahlenförmig verlaufen DNA superspiraliert und verdichtet durch DNA- Bindeproteine  The E. coli chromosome contains 500-600 supercoiled domains Relaxierte Überspiralisierte Chromosom mit ringförmige DNA DNA (Supercoil) vielen supercoils The principle of DNA supercoiling: DNA can be underwound or overwound Abb 6.8 Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Topoisomerases change state of DNA supercoiling https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Plasmid_emEN.jpg  Chromosom meistens negative Supercoils 2 Supercoils: negative (unterdreht) und positive (überdreht) Unterdreht Überdreht (negative (positive supercoils) supercoils) DNA meistens negative supercoils: entgegengesetzt gedreht von rechtdrehender DNA Doppelhelix (Unterdrehung) Supercoiling führt zur Kompaktierung der DNA Helix läßt sich leichter öffnen für Transkription oder Replikation Minsky A. et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 3: 50–60 (2002) doi:10.1038/nrm700 Topoisomerase I: Relaxierung von negative Supercoils Topoisomerase I introduces single strand breaks and catalyzes relaxation of negative supercoils Topoisomerase II (Gyrase) fügt negative Supercoils ein Topoisomerase II (Gyrase) introduces double strand breaks and adds negative supercoils using ATP hydrolysis  Gyrase inhibitors: Quinolones Nalidixinsäure Ciprofloxacin Inhibit breaking and joining of DNA strands Albicidin (Peptidantibiotika) https://de.wikipedia.org/wiki/ Kretz et al, Angew Chemie Intern Ed 127: 1992-1996 (2015) https://doi.org/10.1002/ange.201409584 Nucleoid-associated proteins (NAPs) zur Kompak琀椀erung des bakteriellen Chromosoms  Histone und Nucleoid-associated proteins (NAPs) Histone bei Eukaryonten Nucleoid-associated proteins (NAPs) Kompaktierung des Genoms Kompaktierung des Genoms Eukaronten Prokaryonten Genom um Histone DNA looping, bridging, bending, coating, „herumgewickelt“, wrapping auch wrapping Positive und negative Genregulation Positive und negative Genregulation Verschiedene Modifikationen Nicht modifiziert NAPs Dillon & Dorman, Nature Reviews Microbiology 8(3):185-95 (2010)  Nucleoid-associated Proteins (NAPs) NAPs introduce DNA bending, bridging, coating of chromosomal loci SMC=structural maintainance of the chromosome Dillon & Dorman, Nature Reviews Microbiology 8(3):185-95 (2010)  Expression der Nucleoid-associated proteins (NAPs) Dps, Fis, IHF, H-NS verändert sich während des Wachstums Exponentielle Stationäre Phase Lag Phase Phase Dps Growth curve Fis DNA protec琀椀on from starva琀椀on protein (Dps) Major NAPs: Factor for inversion s琀椀mula琀椀on (Fis) Histone-like nucleoid-structuring protein (H-NS) Integra琀椀on host factor (IHF) Dillon & Dorman, Nature Reviews Microbiology 8(3):185-95 (2010)  Exponen琀椀elle Phase Sta琀椀onäre Phase Mehr loop-Domainen Weniger loop-Domainen Hohe transkrip琀椀onelle Ak琀椀vität Geringe transcrip琀椀onelle Ak琀椀vität der der RNA-Polymerase RNA-Polymerase Dillon & Dorman, Nature Reviews Microbiology 8(3):185-95 (2010)  DNA bending by the histone-like proteins HU and IHF IHF binds DNA with unusual ß-sheets IHF= Integration host factor Sergei Khrapunov et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 19; 103(51): 19217–19218. doi:10.1073/pnas.0609223103  DNA bending by the histone-like protein IHF Bending required for activation of transcription by s54 RNAP FEMS Microbiol Rev 34 (2010) 611–627 DNA bridging by H-NS (Histone-like Nucleoid Structuring Protein) H-NS has a N-terminal dimerisa琀椀on domain and C-terminal DNA-binding domain Repression of transcription by H-NS-mediated DNA looping Transkription wird verhindert in DNA loops nach Krümmung durch H-NS!  DNA protec琀椀on: Dps ist ein Miniferri琀椀n (Fe2+-Speicher) (DNA protein from starved cells) Ferritin (24-mer) Miniferritin Dps (12-mer) Fe2+ Speicher Hydroxylradikal Fenton Reak琀椀on: H2O2 + Fe2+ + H+  H2O + Fe3+ + OH. Hydroxylradikale sind Reak琀椀ve Sauersto昀昀spezies (ROS), können DNA, Proteine, Lipide schädigen ! Dps verhindert die Fenton-Reak琀椀on durch Fe-Speicherung ! Minsky A. et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 3: 50–60 (2002) doi:10.1038/nrm700  Higher order structures: Dps dodecamers Dps/DNA- Dodecamers Ceci et al., Nucleic Acids Research, Vol 32: 5935–5944 (2004), https://doi.org/10.1093/nar/gkh915  DNA-protection and packaging by Dps DNA-Dps layers DNA-Dps co-crystals in starved E.coli cells 1. Dps is a DNA-packaging protein: “biocrystallization“ of DNA in stationary phase cells 2. Dps sequesters Fe2+ to avoid the Fenton reaction and DNA-damage: Dps- dodecamers DNA Minsky A. et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 3: 50–60 (2002) doi:10.1038/nrm700 DNA Replication  Replication of DNA occurs before cell division Brock, Mikrobologie, 2006, Pearson  Semikonservative Replication of DNA Neue DNA besteht aus neuem Strang und Elternstrang Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  DNA replication from 5‘-phosphate to 3‘ OH Direction of chain growth dNTP Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  DNA-Helicasen entspiralisieren DNA Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Bidirectional replication in circular DNA: The Theta-structure Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Bi-directional replication in circular DNA DnaA protein binds at the origin, DNA strands are separated and helicase unwinds the DNA primase synthesizes small RNA primer, whose 3‘-end is starting point for DNA polymerase At the 5‘-end of the primer, DNA polymerase cannot start - small fragments are synthesized with new small primers: lagging strand synthesis Replication is bidirectional with leading and lagging strand synthesis in both directions Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Replication of the leading and lagging strand Replication folk RNA primer Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Ligation of the fragments of the lagging strand Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Das Replisom: DNA-Polymerase-III, Helikase und Primase Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson https://www.youtube.com/watch?v=TNKWgcFPHqw https://www.youtube.com/watch?v=5VefaI0LrgE https://www.youtube.com/watch?v=4bjerYxOTbU  Plasmids and their origin of replication Plasmidreplika琀椀on unabhängig von chromosomaler Replika琀椀on 3 - 500 Plasmid-Kopienzahl/Zelle (verschieden für Plasmide) Plasmid-kodierte Gene: Colicine, Microcine (= Toxine für andere Bakterien) Antibiotika-Resistenzen Abbau-Enzyme (Lactose, Harnstoff etc.) Virulenzfaktoren (pathogene Bakterien) Faktoren für die Konjugation Origin of replica琀椀on  Plasmide in Staphylococcus aureus: o昀琀 mobile gene琀椀sche Elemente, die ins Genom integriert werden und Virulenz und An琀椀bio琀椀ka-Resistenz übertragen Michael Z. David, and Robert S. Daum Clin. Microbiol. Rev. 2010;23:616-687  Different mechanisms of plasmid replication Mono-directional theta replication Bi-directional theta replication Rolling-circle mechanism Gentransfer in Bakterien: Transforma琀椀on Transduk琀椀on Konjuga琀椀on  Gentransfer in Bakterien Bakterien können DNA direkt aufnehmen (Transformation) oder mit Hilfe von Bakteriophagen (Transduction) oder direkt von anderer Bakterienzelle (Konjugation) Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Integration von Fremd- DNA ins Chromosom durch homologe Rekombination Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Nachweis von seltenen Rekombinanten auf Selektivmedium Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  DNA-Transfer durch Transforma琀椀on: Gri昀케ths Experiment Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Transforma琀椀on DNA-transfer durch Gentransfer in Bakterien: Phagen-Transduk琀椀on  Struktur von Bacteriophagen https://en.wikipedia.org/wiki/Bacteriophage Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Haupttypen von Viren, die Bakterien infizieren Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Injection der Phagen DNA in eine E. coli Zelle Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Bacteriophage infec琀椀ons – the ly琀椀c cycle E. coli lysis by stx-phage Φ24B Foto: C.E. James from: FEMS Microbiol Lett. 2016;363(5). doi:10.1093/femsle/fnw015 Bacteriophage infec琀椀ons – the ly琀椀c and lysogenic cycle  Quantifizierung von Bacteriophagen – Plaque test Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  DNA-Transfer durch allgemeine Transduk琀椀on Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  DNA-Transfer durch spezielle Transduktion Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  DNA-Transfer durch Konjugation Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  DNA-Transfer durch Konjugation Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  DNA-Transfer durch Konjugation Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Bildung eines Hfr-Stammes Hfr = High frequency of recombination Integration des F-Plasmids in das Wirtschromosom Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Transfer chromosomaler Gene durch Hfr-Stamm Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Übertragung chromosomaler DNA durch Konjugation Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Bildung verschiedener Hfr-Stämme Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson