MÉTODOS ANALÍTICOS - Guía 1er parcial.pdf

1. ANÁLISIS INSTRUMENTAL El análisis instrumental es una rama de la química analítica que utiliza instrumentos para medir propiedades físicas de las sustancias con el fin de identificar o cuantificar los componentes químicos de una muestra. Estos métodos permiten realizar análisis con mayor precisi...

1. ANÁLISIS INSTRUMENTAL El análisis instrumental es una rama de la química analítica que utiliza instrumentos para medir propiedades físicas de las sustancias con el fin de identificar o cuantificar los componentes químicos de una muestra. Estos métodos permiten realizar análisis con mayor precisión y sensibilidad que los métodos clásicos, como la titulación o la gravimetría. Los instrumentos utilizados pueden variar desde espectrómetros, cromatógrafos, hasta equipos de electroquímica. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS CUANTITATIVOS Métodos químicos clásicos (no dan datos numéricos) o Gravimetría o Volumetría (titulación) Métodos instrumentales (dan datos numéricos y permiten la identificación de componentes) o Espectroscopía: permite verificar calidad y cantidad de ADN previo a la secuenciación o Cromatografía o Electroquímica o Análisis térmico o Técnicas híbridas MÉTODOS CLÁSICOS Los métodos clásicos, también conocidos como métodos químicos tradicionales o métodos húmedos, se basan en reacciones químicas visibles y manipulaciones físicas directas para realizar análisis. Se caracterizan por no depender de instrumentos complejos o Técnicas manuales o Uso de reactivos químicos para la cuantificación y cualificación de los analitos o Simples o Mas laboriosos o Alta sensibilidad en condiciones ideales o Baja sensibilidad comparado con los instrumentales Gravimetría: Determinación de la cantidad de una sustancia a través del pesaje de un producto sólido formado por una reacción química. Volumetría (Titulación): Cuantificación de un analito mediante la adición controlada de un reactivo estándar hasta alcanzar un punto final observable, como un cambio de color. MÉTODOS INSTRUMENTALES Los métodos instrumentales utilizan instrumentos avanzados para medir propiedades físicas o químicas de una sustancia. Estos métodos se basan en la interacción de la materia con energía (luz, electricidad, radiación, etc.) Son capaces de ofrecer una mayor sensibilidad, precisión y rapidez que los métodos clásicos o Alta sensibilidad y precisión o Rapidez o Automatización o Complejos FUNDAMENTOS Espectroscopía: Se basa en la interacción de la radiación electromagnética con la materia. La absorbancia o emisión de luz a ciertas longitudes de onda proporciona información sobre la identidad y concentración de las sustancias presentes en una muestra. 1 Cromatografía: Se fundamenta en la separación de los componentes de una mezcla en función de sus diferentes interacciones con una fase móvil y una fase estacionaria. La separación se logra debido a las diferentes velocidades con las que los componentes se desplazan a través de la columna cromatográfica. Electroquímica: Estudia las reacciones químicas que implican transferencia de electrones. Los métodos electroquímicos miden la corriente, potencial o resistencia en función de la concentración de los analitos, permitiendo su cuantificación. ESPECTROSCOPÍA Espectrofotometría uv-vis: medición de la absorbancia en la región ultravioleta y visible del espectro, utilizada para cuantificar compuestos en solución. Espectroscopía infrarroja (ir): medición de la absorción de radiación infrarroja para identificar enlaces químicos en una molécula. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (rmn): utilización de campos magnéticos y radiofrecuencias para obtener información sobre la estructura molecular. Espectroscopía de emisión atómica (aes): medición de la luz emitida por átomos excitados para determinar la concentración de elementos, como en el análisis de metales. Espectroscopía de absorción atómica (aas): medición de la absorción de luz por átomos en fase gaseosa, utilizada para la detección de metales traza. CROMATOGRAFÍA Cromatografía de gases (GC): separación de compuestos volátiles utilizando un gas como fase móvil. Cromatografía líquida de alta resolución (hplc): separación de compuestos en una fase líquida bajo alta presión. Cromatografía en capa fina (tlc): separación de compuestos sobre una capa delgada de adsorbente. Cromatografía de intercambio iónico: separación de iones en una columna cargada con resinas de intercambio iónico. Cromatografía de exclusión por tamaño: separación de moléculas en solución basada en su tamaño molecular. ELECTROQUÍMICA Voltamperometría Cíclica: Técnica que mide la corriente en función del potencial aplicado a un electrodo. Potenciometría: Medición de la diferencia de potencial entre dos electrodos, como en la determinación de pH. Coulombimetría: Medición de la cantidad de carga eléctrica para completar una reacción redox, utilizada en la determinación cuantitativa de analitos. Conductimetría: Medición de la conductancia eléctrica de una solución para determinar la concentración de iones. 2. SELECCIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS Sensibilidad: o Capacidad del método para detectar pequeñas cantidades del analito. o Un método sensible es capaz de medir concentraciones muy bajas. Precisión: o Grado de concordancia entre resultados obtenidos en repetidas mediciones del mismo analito bajo condiciones similares. o La precisión se expresa en términos de desviación estándar o coeficiente de variación. Exactitud: o Proximidad de los resultados obtenidos a un valor verdadero o aceptado. o Un método exacto proporciona resultados que son correctos, no solo consistentes. Selectividad: 2  o Capacidad del método para distinguir el analito de otros componentes en la muestra. o Un método selectivo puede medir específicamente el analito en presencia de interferencias. Límite de Detección (LOD): o La concentración mínima del analito que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada, por el método. o Importante en análisis de trazas. Límite de Cuantificación (LOQ): o La concentración máxima del analito que puede ser cuantificada con precisión y exactitud aceptables. o El LOQ es superior al LOD. Rango Lineal: o Intervalo de concentraciones en el que la respuesta del método es lineal respecto a la concentración del analito. o Dentro de este rango, la relación entre la señal medida y la concentración es directa. Rapidez: o Tiempo requerido para completar un análisis. o Métodos más rápidos son preferidos en análisis de alto rendimiento. Robustez: o Capacidad del método para permanecer inalterado frente a pequeñas variaciones en las condiciones operativas. o Indica la estabilidad del método bajo condiciones normales de variabilidad. Costo: o Incluye el costo de los reactivos, materiales, tiempo de análisis, y la instrumentación necesaria. o Un método menos costoso es preferido si cumple con los requisitos de precisión, exactitud, y sensibilidad. CRITERIOS DE SELECCIÓN DE LOS MÉTODOS INSTRUMENTALES Naturaleza del analito: o Tipo de muestra: se considera si el analito es orgánico, inorgánico, volátil, etc. o Estado físico: la elección del método puede depender de si la muestra es sólida, líquida o gaseosa. o Concentración esperada: la sensibilidad del método debe ser adecuada para la concentración del analito. Selectividad: o Si se requiere analizar un componente específico en presencia de otros, se seleccionará un método con alta selectividad. o Ejemplo: la espectrometría de masas es altamente selectiva para la identificación de compuestos. Sensibilidad y límite de detección: o Métodos con bajos límites de detección son esenciales para análisis de trazas. o Ejemplo: la espectroscopía de absorción atómica (aas) es seleccionada para la detección de metales en concentraciones muy bajas. Precisión y exactitud: o Si el análisis requiere resultados altamente precisos y exactos, se opta por métodos que garantizan estos parámetros. o Ejemplo: la cromatografía líquida de alta resolución (hplc) es conocida por su alta precisión y exactitud en la cuantificación de compuestos. Tiempo de análisis: o En aplicaciones donde se requiere análisis rápido, se prefieren métodos instrumentales que ofrezcan resultados en menor tiempo. o Ejemplo: la cromatografía de gases (gc) es rápida y eficiente para el análisis de compuestos volátiles. Disponibilidad de instrumentación: o La elección también puede estar limitada por la disponibilidad de los equipos en el laboratorio. o Ejemplo: si no se dispone de un espectrómetro de masas, puede ser necesario recurrir a otro método como la hplc. Costo: o Los métodos más costosos se justifican solo si son imprescindibles para la precisión y sensibilidad requeridas. o Considera también el costo de mantenimiento y operación del equipo. Compatibilidad con la muestra: o Algunos métodos pueden requerir preparación específica de la muestra (e.G., Disolución, derivatización). o La facilidad y costo de la preparación de la muestra también influyen en la selección. PRINCIPIOS DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad (CQ) garantizan la fiabilidad y validez de los resultados obtenidos. Calibración Verificación y validación 3  Uso de estándares de referencia Muestras de control (blancos, duplicados, etc.) Documentación y trazabilidad Capacitación continua Revisión y auditoría Mantenimiento de equipos 3. MÉTODOS NO INSTRUMENTALES DE ANÁLISIS MÉTODOS CLÁSICOS NO INSTRUMENTALES Los métodos analíticos clásicos no instrumentales son enfoques tradicionales para el análisis químico que no requieren el uso de instrumentos científicos sofisticados. Se basan en técnicas manuales y observación directa para determinar propiedades químicas de sustancias y muestras. Son sensibles, baratos, dan información suficiente, mas no específica. Ej: tinción de Gram, titulación MÉTODO DE GRAVIMETRÍA - determinar cantidad de ciertos solutos presentes en una muestra (usa densidad y peso) Este método se basa en la determinación de la masa (cantidad) de un componente químico en una muestra. No se busca tanto el tipo de componentes, sólo cantidad. Diferencias de densidad. Se utilizan técnicas: o precipitación o filtración o secado Para obtener el componente deseado en forma de un compuesto sólido cuya masa se puede medir con precisión. TIPOS Gravimetría por Precipitación: Se forma un compuesto insoluble a partir de la reacción entre el analito y un reactivo. El precipitado se separa, lava y seca antes de pesarlo. La masa del precipitado se relaciona con la cantidad de analito original presente. Gravimetría por Volatilización: Se basa en la eliminación controlada de un componente volátil de una muestra, como agua o un gas. La pérdida de masa se correlaciona con la cantidad de analito original. Ej: preparación de café soluble APLICACIONES Determinación de Peso Molecular: se utiliza para determinar el peso molecular de un compuesto desconocido al precipitarlo en una forma más simple y medir su masa. Farmacología: para la determinación de la pureza de los fármacos y la cuantificación de los ingredientes activos. Análisis de Aire: Se utiliza en la determinación de la concentración de partículas suspendidas en el aire y de gases contaminantes. Análisis de Minerales y Metales: En geología y metalurgia, se utiliza para determinar la concentración de minerales y metales en muestras de rocas y minerales. Análisis de Alimentos: En el control de calidad de alimentos, la gravimetría puede utilizarse para determinar la concentración de nutrientes o contaminantes. Análisis de Agua: La gravimetría puede utilizarse para cuantificar la cantidad de impurezas en el agua, como sales disueltas, mediante la precipitación de los componentes indeseados. Análisis de Suelos: La gravimetría se utiliza para medir la cantidad de humedad presente en los suelos, lo que es esencial para la agricultura y la investigación ambiental. MÉTODO DE PRECIPITACIÓN Se basa en la formación de un precipitado insoluble a partir de la reacción de dos o más soluciones. El precipitado se separa y se pesa para determinar la concentración del analito. Cuando las concentraciones de iones o moléculas de una sustancia superan su solubilidad en la solución, se forman partículas sólidas insolubles que precipitan. La reacción química involucrada en la precipitación conduce a la formación de compuestos con una solubilidad limitada. 4 Separación por densidad, pero se necesita agregar un soluto para lograr la separación; saturación de la solución. Por otro lado, en la sedimentación, se logra la separación sólo con la densidad sin tener que agregar un soluto. Disolución Inicial Adición del Agente Precipitador Reacción Química o El agente precipitador interactúa con el soluto, formando un nuevo compuesto que es insoluble en la solución. Esta reacción puede ser una reacción de intercambio iónico, neutralización, o cualquier otra reacción química que produzca un compuesto insoluble. Formación del Precipitado o A medida que se forma el compuesto insoluble, éste se separa de la fase líquida en forma de partículas sólidas. Estas partículas comienzan a agregarse, formando lo que se llama un precipitado. Crecimiento del Precipitado o Las partículas del precipitado pueden continuar creciendo en tamaño a medida que más soluto se convierte en sólido, formando cristales o agregados de cristales. Sedimentación Filtración o Decantación Tipos de precipitación Precipitación Simple: Se lleva a cabo añadiendo un reactivo precipitante a la solución que contiene el ion que deseamos precipitar; esto hace que se sature. El precipitado formado se separa por filtración y se lava antes de ser pesado. Precipitación Fraccionada: Se realiza mediante la adición controlada de un reactivo precipitante en múltiples etapas para evitar la sobresaturación y permitir la formación gradual de un precipitado más puro. Coelectores o Coprecipitantes: Se introducen compuestos adicionales que tienen una solubilidad similar a la del precipitado deseado. Esto ayuda a arrastrar impurezas y aumentar la concentración del precipitado. Coprecipitante interacciona con solvente, creando un efecto de saturación al sustituir al otro soluto, mientras que el soluto original se precipita. Aplicaciones en Biotecnología Purificación de Proteínas: La precipitación se aplica para separar y concentrar proteínas de una solución, eliminando impurezas y otros componentes. Determinación de Metales en Muestras Ambientales: Se utiliza para cuantificar la concentración de metales en muestras de suelo, agua y sedimentos. Síntesis de Compuestos Químicos: La precipitación se emplea para sintetizar compuestos químicos y generar productos sólidos a partir de soluciones reactivas. Producción de Materiales Nanoparticulados: En la nanotecnología, se utiliza para obtener nanopartículas con propiedades específicas. MÉTODO DE TITULACIÓN Las titulaciones son reacciones químicas en las que se mide el volumen de una solución de titulante (reactivo de concentración conocida) necesario para reaccionar completamente con el analito presente en una muestra. Ejemplos populares son las titulaciones ácido-base y las titulaciones de oxidación-reducción. Tipos de titulación: Titulación Ácido-Base: Se basa en la reacción entre un ácido y una base. El punto final se alcanza cuando el pH de la solución cambia, lo que generalmente se detecta con un indicador de pH o un electrodo de pH. Titulación Redox: Se basa en reacciones de oxidación-reducción entre especies químicas. El punto final se detecta mediante indicadores redox o mediante métodos instrumentales como la potenciometría. Titulación de Precipitación (fraccionada): Se basa en la formación de un precipitado insoluble en una reacción entre analito y titulante. El punto final se detecta cuando la formación del precipitado es completa. Aplicaciones en Ciencia y Biotecnología 5  Análisis de Ácido Ascórbico (Vitamina C): La titulación redox se utiliza para cuantificar la concentración de vitamina C en alimentos y productos farmacéuticos. Control de Calidad en la Industria Farmacéutica: La titulación se utiliza para verificar la concentración de sustancias activas en productos farmacéuticos. Determinación de Calcio en Alimentos: Se utiliza la titulación complejométrica para cuantificar la concentración de calcio en alimentos y bebidas. Análisis de Hierro en Agua: La titulación redox puede aplicarse para determinar la concentración de hierro en muestras de agua. Análisis de Ácido Nítrico en Fertilizantes: Se puede utilizar la titulación ácido-base para cuantificar el contenido de ácido nítrico en muestras de fertilizantes. Determinación de Cloruros en Alimentos: La titulación de precipitación se emplea para cuantificar la concentración de cloruros en alimentos. EJEMPLO: En una reacción de titulación acido-base, se utiliza NaOH a una concentración de 0.1M y HCl a una concentración desconocida, utilizamos fenolftaleína para determinar el cambio de pH de ácido a base como lo muestra el sig. diagrama. ¿Cuál es la concentración del HCl que fue neutralizada? Cuál será la Molaridad del Mg(OH)2 si 20.9 ml de ésta se titularon con 17 ml de HNO3 1.6 M Mg(OH)2 + HNO3 à Mg(NO3)2 + H2O 8 ml de una solución de KOH requieren 20 ml de una solución de ácido oxálico 0.2566 M para su titulación, ¿cuál será la molaridad del KOH? KOH + H2C2O4 à K2C2O4 + H2O Cuál será la normalidad de una solución de H2SO4 si 25 ml de NaOH 0.1097N requieren 23.18 ml de dicho ácido? H2SO4 + NaOH à Na2SO4 + H2O MÉTODO DE EXTRACCIÓN Este método implica la separación de un componente de una mezcla utilizando solventes. Se utiliza para aislar compuestos específicos de una muestra compleja. Para obtener de manera pura un soluto. Se basa en las diferencias de solubilidad y afinidad del componente entre las fases. El fundamento de la extracción se basa en la distribución de un componente entre dos fases inmiscibles, a menudo una fase acuosa y una fase orgánica. Si un componente es más soluble en una de las fases que en la otra, es posible transferir selectivamente el componente de una fase a la otra. Tipos de extracción Líquido-Líquido Extracción Sólido-Líquido Extracción en Fase Sólida Extracción Soxhlet tipo sólido-liquido Extracción Supercrítica Extracción por Arrastre de Vapor Extracción por Ultrasonidos Extracción Selectiva 6 Extracción Líquido-Líquido (ELL) Este tipo de extracción implica la separación de un compuesto entre dos fases líquidas inmiscibles, generalmente una acuosa y otra orgánica. El soluto se distribuye entre las dos fases en función de su solubilidad relativa en cada una. Proceso: o Se añade el disolvente orgánico a la solución acuosa que contiene el compuesto de interés. o El sistema se agita para permitir la transferencia del soluto de la fase acuosa a la fase orgánica. o Las fases se separan y el soluto es recuperado de la fase orgánica mediante evaporación del disolvente. Aplicaciones: o Purificación de productos químicos, extracción de compuestos bioactivos de plantas, separación de metales en análisis químico. Embudo de separación. Extracción de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) de muestras biológicas o Preparación de la muestra: Homogeneiza la muestra biológica (tejido o células) en un tampón lisis. o Añadir disolvente orgánico: Añade un volumen igual de fenol-cloroformo (1:1) a la muestra homogeneizada. o Mezcla y centrifugación: Agita la mezcla vigorosamente y centrifuga a 12,000 rpm por 10 minutos a 4°C. o Recuperación de la fase acuosa: Tras la centrifugación, recoge cuidadosamente la fase acuosa (superior), que contiene los ácidos nucleicos. o Precipitación del ADN: Añade 2 volúmenes de etanol frío a la fase acuosa, mezcla suavemente y deja reposar a -20°C durante 30 minutos. o Centrifugación y lavado: Centrifuga a 12,000 rpm por 10 minutos, decanta el supernatante y lava el pellet de ADN con 70% de etanol. o Resuspensión: Deja secar el pellet al aire y resuspéndelo en agua o tampón TE. Extracción Sólido-Líquido En la extracción sólido-líquido, un soluto es extraído de un sólido usando un disolvente líquido. Este tipo de extracción es común en la preparación de extractos de plantas y en la industria alimentaria. Proceso: o El sólido que contiene el soluto de interés se pone en contacto con el disolvente. o El soluto se disuelve en el disolvente, mientras que el sólido insoluble queda como residuo. o El extracto líquido se separa del sólido y puede ser concentrado si es necesario. Aplicaciones: o Extracción de aceites esenciales, extracción de café, obtención de compuestos activos de plantas medicinales. 7 Extracción Líquido-Sólido Es una técnica en la que los analitos de interés se adsorben en una fase sólida (generalmente una columna de adsorción) y luego se eluyen con un disolvente adecuado. Proceso: o La muestra líquida se pasa a través de una columna que contiene el material adsorbente. o Los compuestos de interés se retienen en la fase sólida mientras que las impurezas pasan a través. o Los analitos se recuperan lavando la fase sólida con un disolvente apropiado. Aplicaciones: o Purificación y concentración de muestras antes del análisis por cromatografía, extracción de contaminantes de muestras ambientales, limpieza de extractos biológicos. Purificación de ARN total utilizando columnas de extracción en fase sólida. Protocolo: 1. Lisis celular: Lisis de las células con un tampón que contenga guanidina tiocianato para desnaturalizar proteínas y liberar ARN. 2. Carga en la columna SPE: Pasa la solución a través de una columna SPE (silica-based) preacondicionada. 3. Lavado: Lava la columna con un tampón que contenga etanol para eliminar proteínas y otros contaminantes. 4. Elución del ARN: Eluye el ARN purificado con agua o tampón TE libre de nucleasas. Extracción Soxhlet Es un tipo especializado de extracción sólido-líquido que se utiliza para extraer compuestos de sólidos con un disolvente que es reciclado continuamente a través de la muestra. Proceso: o El disolvente se calienta hasta la ebullición y se condensa en un extractor Soxhlet. o El disolvente caliente gotea sobre la muestra sólida, disolviendo el soluto. o Cuando el nivel de disolvente alcanza el sifón, se vacía de nuevo al matraz de ebullición, y el ciclo se repite hasta que se completa la extracción. Aplicaciones: o Extracción de lípidos de alimentos, extracción de compuestos orgánicos de matrices sólidas, investigación en química de productos naturales. Extracción de lípidos de semillas oleaginosas Protocolo: 1. Preparación de la muestra: Seca y muele las semillas oleaginosas hasta obtener un polvo fino. 2. Montaje del sistema Soxhlet: Coloca el polvo en un cartucho de extracción y ponlo en el extractor Soxhlet. 3. Añadir disolvente: Llena el matraz de fondo redondo con hexano o éter de petróleo como disolvente. 4. Extracción: Conecta el Soxhlet al matraz y a un condensador. Calienta el sistema para que el disolvente hierva y condense, disolviendo los lípidos en cada ciclo de extracción. 5. Repetición ldel ciclo: Deja que el sistema funcione durante 6-8 horas para permitir una extracción completa de los lípidos. 6. Recuperación del disolvente: Después de la extracción, recupera el disolvente mediante evaporación. 7. Almacenamiento: Pesa el extracto de lípidos y almacénalo en un recipiente hermético a -20°C. Extracción Supercrítica Este tipo de extracción utiliza un fluido supercrítico, generalmente dióxido de carbono (CO₂), como disolvente. Un fluido supercrítico tiene propiedades intermedias entre un líquido y un gas, lo que lo hace un disolvente muy eficaz. Proceso: o El CO₂ se calienta y presuriza hasta alcanzar su estado supercrítico. o En este estado, el CO₂ se introduce en la cámara que contiene la muestra sólida. o El CO₂ supercrítico disuelve los compuestos de interés, que son luego recuperados por despresurización del solvente. Aplicaciones: o Extracción de aceites esenciales, descafeinación del café, extracción de contaminantes de suelos. Extracción de carotenoides de zanahorias usando CO₂ supercrítico. Protocolo: 1. Preparación de la muestra: Liofiliza y muele las zanahorias para obtener un polvo fino. 8  2. Carga de la muestra: Introduce la muestra pulverizada en la cámara de extracción del equipo de extracción supercrítica. 3. Condiciones supercríticas: Ajusta el equipo a las condiciones supercríticas para el CO₂ (temperatura entre 31-35°C y presión de 73-300 atm). 4. Extracción: Inicia la extracción, permitiendo que el CO₂ supercrítico fluya a través de la muestra, disolviendo los carotenoides. 5. Recuperación del extracto: El extracto se recoge a medida que el CO₂ se despresuriza y se convierte nuevamente en gas, dejando atrás los carotenoides. 6. Almacenamiento: Almacena el extracto a -20°C para análisis posterior. Extracción por Arrastre de Vapor Esta técnica se utiliza principalmente para extraer compuestos volátiles, como aceites esenciales, de materiales sólidos mediante el arrastre con vapor de agua. Proceso: o El vapor de agua caliente se pasa a través del material sólido que contiene el compuesto volátil. o Los compuestos volátiles se evaporan y se arrastran con el vapor. o La mezcla de vapor se condensa y se separa en una fase acuosa y otra de aceite esencial. Aplicaciones: o Producción de aceites esenciales, purificación de productos químicos volátiles, extracción de aromas en la industria alimentaria. Extracción de aceites esenciales de flores de lavanda. Protocolo: 1. Preparación de la muestra: Corta y seca las flores de lavanda. 2. Montaje del aparato de arrastre de vapor: Coloca las flores en el recipiente de la muestra y conecta al sistema de arrastre de vapor. 3. Generación de vapor: Hierve agua para generar vapor, que pasará a través de las flores, arrastrando los aceites esenciales. 4. Condensación: El vapor con los aceites esenciales se condensa y se recoge en un recipiente. 5. Separación: El aceite esencial se separa del agua en el recipiente de recolección mediante decantación o el uso de un embudo de separación. 6. Almacenamiento: Almacena el aceite esencial en frascos oscuros y herméticos a temperatura ambiente. Extracción por Ultrasonidos La extracción asistida por ultrasonidos utiliza ondas sonoras de alta frecuencia para facilitar la disolución de solutos en un disolvente. La cavitación generada por los ultrasonidos mejora la penetración del disolvente en el sólido, aumentando la eficiencia de la extracción. Proceso: o La muestra se sumerge en un disolvente y se expone a ondas ultrasónicas. o Las ondas ultrasónicas generan burbujas de cavitación que implosionan, creando microcorrientes y choques que facilitan la extracción del soluto. Aplicaciones: o Extracción rápida de compuestos bioactivos de plantas, mejora de procesos de extracción en la industria alimentaria y farmacéutica. No para tejido humano, pero sí para vegetal. Extracción de polifenoles de cáscaras de uva Protocolo: 1. Preparación de la muestra: Seca y pulveriza las cáscaras de uva. 2. Extracción: Coloca la muestra en un vaso con etanol o agua como disolvente en una proporción 1:10 (peso/volumen). 3. Aplicación de ultrasonidos: Sumerge el vaso en un baño de ultrasonidos a 40 kHz durante 30 minutos. 4. Filtración: Filtra la mezcla para separar el extracto de los residuos sólidos. 5. Concentración: Evapora el disolvente bajo presión reducida para concentrar los polifenoles. 6. Almacenamiento: Almacena el extracto a -20°C para su posterior análisis Extracción Selectiva Se utilizan disolventes o condiciones específicas que permiten la separación de uno o más componentes específicos de una mezcla compleja. Proceso: o Se selecciona un disolvente que tenga afinidad particular por el componente de interés. o La mezcla se trata con el disolvente, extrayendo sólo los compuestos que son solubles en él, dejando atrás los otros componentes. Aplicaciones: 9  o Purificación de productos farmacéuticos, separación de metales preciosos de minerales, extracción de alcaloides de plantas. Aplicaciones en Biotecnología Purificación de ADN y ARN: La extracción es crucial en biotecnología para aislar y purificar ácidos nucleicos de muestras biológicas. Extracción de Compuestos Naturales: En química orgánica, se utiliza para extraer y purificar compuestos naturales de plantas u otras fuentes. Análisis de Residuos en Alimentos: Se utiliza para concentrar y extraer compuestos químicos presentes en alimentos para su posterior análisis. Determinación de Contaminantes en Agua: Se utiliza para concentrar y extraer contaminantes químicos presentes en muestras de agua para su análisis. Extracción de Productos Biotecnológicos: En la producción de productos biotecnológicos, la extracción se utiliza para aislar y concentrar productos de fermentación, enzimas u otros productos biológicos. Análisis de Medicamentos en Sangre: La extracción se emplea para concentrar y extraer medicamentos y sus metabolitos de muestras de sangre para su análisis. MÉTODO DE COLORIMETRÍA Aunque a menudo se asocia con métodos instrumentales, la colorimetría clásica se basa en la medición de la intensidad de color de una muestra y su comparación con estándares de color. Esto se utiliza para estimar concentraciones de analitos que producen color en solución. El fundamento de la colorimetría se basa en la Ley de Lambert-Beer, que establece que la absorbancia de una sustancia es directamente proporcional a su concentración y al coeficiente de absorción molar. Tipos de colorimetría Comparación Visual: Se compara el color de la muestra con estándares de colores conocidos en una escala de colores, como la escala de colores de Hazen o el sistema Lovibond. Colorimetría con Espectrofotómetro: Se utiliza un espectrofotómetro para medir la absorbancia de la muestra a través de una serie de longitudes de onda específicas. Esto permite obtener una curva de absorbancia en función de la longitud de onda. Aplicaciones: Análisis de Concentraciones en Soluciones: La colorimetría se utiliza para determinar la concentración de diversas sustancias en soluciones, como iones metálicos, compuestos orgánicos y biomoléculas. Análisis de Agua: Se aplica en la detección de contaminantes y sustancias en el agua, como nitratos, nitritos y metales pesados. Análisis de Alimentos: La colorimetría se utiliza para determinar la concentración de nutrientes y compuestos en alimentos, como vitaminas, minerales y antioxidantes. Determinación de pH: Algunos indicadores de pH cambian de color en función del pH de una solución, permitiendo estimaciones cualitativas o cuantitativas del pH. Determinación de Azúcares y Carbohidratos: Se utiliza para cuantificar azúcares y carbohidratos en muestras biológicas y alimentos. Determinación de Proteínas: Algunos métodos colorimétricos se utilizan para cuantificar proteínas en muestras biológicas, basándose en la reacción con compuestos que generan color. 4. MÉTODOS INSTRUMENTALES DE ANÁLISIS Tipos de instrumentos de análisis De separación Electroforesis Espectrofotometría Emisión de luz Desviación de luz Térmicos Radioactividad Electroquímicas Técnicas de separación Fraccionamiento en flujo o cromatografía de flujo Es un proceso de separación de componentes en fracciones de la muestra. El fraccionamiento de flujo se utiliza comúnmente en la purificación de biomoléculas, como proteínas y ácidos nucleicos, en la industria biotecnológica y farmacéutica. También se utiliza en la purificación de productos químicos y en la separación de mezclas complejas en aplicaciones analíticas La cromatografía describe un procedimiento químico en el que se separa una mezcla en sus componentes individuales mediante una fase móvil y una fase estacionaria 10  Est – Solido o liquido Mov - Liquido o Gas Fraccionamiento en flujo Fase Estacionaria: En esta técnica, se utiliza una fase estacionaria, que puede ser una columna empaquetada con un material específico, como una resina de intercambio iónico, gel de agarosa, sílice gel, o algún otro material adecuado. Fase Móvil: La fase móvil es un líquido que se mueve continuamente a través de la columna, arrastrando consigo los componentes de la muestra. Interacción Selectiva: Los componentes de la muestra se separan en función de sus interacciones con la fase estacionaria. Los componentes que tienen una mayor afinidad por la fase estacionaria se retendrán más tiempo en la columna. Detección y Recolección: A medida que los componentes de la muestra pasan a través de la columna, se pueden detectar y cuantificar utilizando métodos analíticos adecuados, como la espectroscopía UV o la detección de conductividad. Generando un cromatograma. Elución: Finalmente, los componentes separados se eluyen de la columna en función de su tiempo de retención y se recogen para su posterior análisis o purificación. Cromatografía en Columna La cromatografía se emplea para separar los componentes de una mezcla en función de las diferencias en su tamaño, carga u otras características. la fase móvil (tampón u otro disolvente) se mueve a través de la fase estacionaria (generalmente una matriz sólida) que lleva los componentes de la mezcla Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de exclusión gel Cromatografía de afinidad.... HPLC Cromatografía de Gases Tipos de cromatografía en columna Cromatografía de Adsorción Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de Exclusión por Tamaño Cromatografía de Afinidad Cromatografía de fase normal Cromatografía de fase inversa Cromatografía de Columna rápida Cromatografía de Desorción a temperatura programada (TPC) Cromatografía de Interacción Hidrofóbica Cromatografía de Afinidad Metálica Inmovilizada Características de separación Separación Diferencial: Los componentes de la mezcla se separan en función de sus afinidades relativas por la fase estacionaria y la fase móvil. Interacción Selectiva: La eficacia de la separación depende de la naturaleza de las interacciones físicas y químicas entre los componentes de la muestra, la fase estacionaria, y la fase móvil. Purificar, identificar, y cuantificar compuestos en una amplia variedad de muestras químicas, biológicas, y ambientales. Cromatografía de gases Es una técnica de separación y análisis que se basa en la distribución diferencial de los componentes de una muestra entre una fase gaseosa móvil y una fase estacionaria. Su fundamento se basa en principios de interacción molecular y difusión, y es ampliamente utilizada en química analítica y otras disciplinas científicas. Cromatografía de gases: para identificar componentes de la muestra y su cantidad presente. No se pueden utilizar moléculas de carbohidratos, péptidos, porque, por la temperatura, los va a desnaturalizar. Los de cadena larga se desnaturalizarán fácilmente y los de cadena corta son más resistentes. Naturaleza y tipo de columna se debe conocer. 11 Fundamentos Fase Estacionaria: En una columna de cromatografía de gases, la fase estacionaria es un recubrimiento o una película adherida a una superficie sólida. Esta fase puede ser polar o no polar, y la elección depende de la naturaleza de los compuestos que se van a analizar. Fase Móvil: La fase móvil es un gas inerte, como helio, nitrógeno o argón, que fluye continuamente a través de la columna. Interacciones Moleculares: Los componentes de la muestra se separan en función de sus interacciones con la fase estacionaria. Los componentes que tienen una mayor afinidad por la fase estacionaria se mueven más lentamente a través de la columna, mientras que los que tienen una menor afinidad se mueven más rápidamente. Tiempo de Retención: El tiempo que tarda cada componente en pasar a través de la columna se llama "tiempo de retención". Este tiempo es característico de cada compuesto y se utiliza para su identificación Variables en el CG Tipo de Detector Detector de Ionización de Llama (FID): Es el detector más común en GC y se utiliza para la detección de compuestos orgánicos. Detector de Captura de Electrones (ECD): Altamente selectivo y sensible para compuestos electronegativos, como halógenos y nitrocompuestos. Detector de Conductividad Térmica (TCD): Es un detector universal, menos sensible que FID, pero puede detectar cualquier compuesto que tenga una conductividad térmica diferente a la del gas portador. Detector de Espectrometría de Masas (MS): Proporciona identificación de compuestos mediante la fragmentación y detección de iones, combinando la separación de GC con la identificación precisa de MS. Columnas de CG Columnas Capilares: Son las más comunes, ofrecen alta eficiencia y resolución. Tienen un diámetro interno pequeño (0.1 a 0.53 mm) y están revestidas con una fase estacionaria. Columnas Empacadas: Contienen un sólido adsorbente o líquido inmovilizado en un soporte sólido. Son menos eficientes que las columnas capilares, pero útiles para ciertas aplicaciones. Tipo de Gas Portador Helio: Es el gas portador más común debido a su alta eficiencia y compatibilidad con la mayoría de los detectores. Nitrógeno: Se utiliza cuando se requiere un bajo flujo de gas, pero es menos eficiente que el helio. Hidrógeno: Ofrece una alta velocidad de separación y es más económico, pero es inflamable y requiere precauciones adicionales. Aplicaciones 1. Análisis de Compuestos Orgánicos: GC se utiliza para analizar y cuantificar compuestos orgánicos volátiles, como hidrocarburos, alcoholes, ésteres y otros compuestos químicos. 2. Control de Calidad en la Industria Alimentaria: GC se utiliza para analizar la composición de aceites, grasas, sabores y fragancias en alimentos y bebidas. 3. Análisis Ambiental: Se utiliza para analizar contaminantes orgánicos en el aire, el agua y el suelo, como compuestos orgánicos volátiles (COVs) y contaminantes persistentes orgánicos (CPOs). 4. Farmacéutica: En la industria farmacéutica, se utiliza para el análisis de productos farmacéuticos, identificación de impurezas y control de calidad. 5. Análisis de Compuestos Biológicos: GC también se utiliza en la identificación y cuantificación de compuestos biológicos, como aminoácidos, ácidos grasos y otros metabolitos. 6. Toxicología Forense y Drogas: Es común en la identificación de drogas y compuestos tóxicos en muestras forenses y de toxicología. 7. Análisis de Gases en la Industria Química: Se utiliza para el análisis de gases en la industria química, como la determinación de gases residuales en productos químicos. Cromatografía liquida (HPLC) La Cromatografía Líquida de Alta Presión, o HPLC (por sus siglas en inglés, High-Performance Liquid Chromatography), es una técnica de separación y análisis que utiliza una fase líquida como medio móvil en lugar de una fase gaseosa. La HPLC se basa en el principio de separación de componentes de una muestra en función de su afinidad por una fase estacionaria y su interacción con una fase líquida móvil. Los componentes de la muestra se inyectan en una columna cromatográfica que contiene partículas estacionarias (generalmente sílice o polímeros) y se arrastran por una fase líquida móvil a alta presión. La separación se produce debido a las diferencias en la velocidad a la que los componentes se mueven a través de la columna y su interacción con la fase estacionaria. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna. 12 HPLC Detectores Detector UV-Visible (UV-Vis) Detector de Fluorescencia Detector de Índice de Refracción (RI) Detector de Conductividad Detector de Detracción de Luz (LS) Detector de Masas (MS) Detector Electroquímico Detector de Fluorescencia de Fase Líquida (LFD) Fase móvil 1. Agua: especialmente para compuestos polares y análisis de biomoléculas como compuestos polares y biomoléculas, como proteínas, péptidos y ácidos nucleicos. 2. Metanol: Es útil para una variedad de compuestos orgánicos y es eficaz para el análisis de una amplia gama de muestras, incluidos fármacos, metabolitos, y compuestos ambientales. 3. Acetonitrilo: Útil para compuestos orgánicos. Tiene un punto de ebullición más bajo que el metanol, lo que lo hace útil en aplicaciones que requieren temperaturas de separación más altas. Es particularmente útil para compuestos orgánicos de baja polaridad 4. Tetrahidrofurano (THF): Para aplicaciones específicas, como la separación de compuestos polares y análisis de polímeros. Su capacidad para disolver una amplia gama de compuestos y su compatibilidad con muchas fases estacionarias lo hace adecuado para análisis de polímeros que no son tan fáciles de disolver. 5. Cloroformo: Para aplicaciones específicas, muestras biológicas y orgánicas donde los lípidos son el principal componente. 6. Mezclas de Solventes: Las mezclas de agua con metanol o acetonitrilo son ejemplos comunes. Diferencia entre HPLC y cromatografía de gases 1. Medio Móvil: En HPLC, se utiliza una fase líquida móvil, mientras que en GC se utiliza una fase gaseosa móvil. 2. Interacción Molecular: En HPLC, las interacciones son predominantemente interacciones líquido-sólido y pueden ser influenciadas por propiedades como la polaridad y la carga. En GC, las interacciones son principalmente interacciones gaseosas y dependen de la volatilidad y la polaridad de los compuestos. 3. Sensibilidad y Rango de Detención: GC generalmente tiene una mayor sensibilidad para compuestos volátiles y una amplia gama de detección para compuestos orgánicos. HPLC puede manejar una variedad más amplia de compuestos, incluyendo aquellos que no son fácilmente volátiles. 4. Temperatura: En GC, se pueden utilizar temperaturas elevadas para la separación de compuestos, lo que puede dañar compuestos termosensibles. En HPLC, las temperaturas no son tan extremas, lo que la hace más adecuada para compuestos termosensibles. 5. Identificación: La HPLC generalmente proporciona una mejor identificación de compuestos debido a la detección mediante espectroscopía UV-Visible y detectores específicos, mientras que la GC se basa principalmente en la detección de masas. ¿Cuándo cuando cuando? HPLC Cromatografía de gases Compuestos No Volátiles: compuestos polares y Compuestos Volátiles: orgánicos e inorgánicos que pueden convertirse sustancias químicas orgánicas e inorgánicas que en fase gaseosa a temperaturas elevadas sin degradarse. pueden degradarse o descomponerse a altas Mayor Sensibilidad: Si necesitas una alta sensibilidad y límites de temperaturas. detección bajos para compuestos orgánicos volátiles, capacidad para Muestras en Fase Líquida: Si tu muestra o analito separar y detectar trazas de sustancias. está en fase líquida o si necesitas disolver la muestra Análisis de Gases: contaminantes atmosféricos, componentes de en un solvente líquido petróleo y gases en aplicaciones ambientales e industriales. Compuestos Termosensibles: Si los compuestos de Identificación por Espectrometría de Masas: Si necesitas identificar interés son termosensibles y pueden compuestos específicos en una mezcla, la GC en combinación con descomponerse a altas temperaturas. espectrometría de masas (GC-MS) para la identificación y Mayor Rango de Peso Molecular: con un mayor peso cuantificación precisa. molecular, como proteínas, péptidos, ácidos Temperaturas Elevadas: La GC opera a temperaturas elevadas y nucleicos y carbohidratos. puede separar compuestos que no son fácilmente separables por Detección Específica: Si necesitas una detección HPLC debido a sus propiedades de volatilidad y polaridad. específica mediante detectores como UV-Visible, Análisis de Isómeros: La GC es especialmente útil para separar y fluorescencia, detector de conductividad, entre otros, analizar isómeros, como isómeros de cadena, de posición y la HPLC es útil. geométricos. Aplicaciones del HPLC 1. Farmacéutica: Para el análisis de productos farmacéuticos, control de calidad de medicamentos y detección de impurezas. 2. Alimentos y Bebidas: Para analizar la composición de alimentos, la detección de aditivos y la cuantificación de nutrientes y contaminantes. 13  3. Química Ambiental: Para la detección y cuantificación de contaminantes en agua, suelo y aire. 4. Bioquímica y Biotecnología: En la purificación y análisis de proteínas, ácidos nucleicos y metabolitos. 5. Industria Química: Para el análisis y purificación de productos químicos y productos intermedios. 6. Toxicología Forense: En la detección de drogas y compuestos tóxicos en muestras forenses y de toxicología. 7. Ciencias de la Vida: En la investigación biomédica, como el análisis de biomarcadores y la caracterización de compuestos en muestras biológicas. Espectrometría de masas La espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés, Mass Spectrometry) es una técnica analítica que se utiliza para medir la relación masa/carga (m/z) de iones, es decir, la relación entre la masa de partículas cargadas y la magnitud de su carga. Esta técnica se basa en la separación de iones en función de su relación m/z, lo que permite la identificación de compuestos, la cuantificación de analitos y la obtención de información estructural. Utiliza la ionización de las moléculas para poderlas identificar. Es una manera de cargar las muestras para acelerar las partículas a altas velocidades. Si la masa es pequeña y pasa a través de un campo magnético, ésta será interferida por el campo. Si tenemos menor masa, hay mayor efecto de desviación. Si hay mayor masa, la trayectoria no será tan desviada. Como resultado, se obtiene la masa del elemento químico. Etapas durante Espectrometría de masas 1. Ionización: La muestra se ioniza, es decir, se convierte en iones cargados. Esto se logra utilizando técnicas de ionización que pueden variar según la aplicación. Algunas técnicas comunes de ionización incluyen la ionización por electrospray (ESI), la ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI), la ionización por impacto electrónico (EI) y la ionización química (CI). 2. Análisis de masas: Los iones generados se separan en función de su relación m/z mediante un analizador de masas. Los analizadores de masas pueden ser de diferentes tipos, como analizadores de tiempo de vuelo (TOF), cuadrupolos, trampas iónicas y más. Cada analizador tiene sus propias ventajas y aplicaciones específicas. 3. Detección: Los iones separados se detectan y registran en función de su relación m/z. La detección puede ser realizada por varios tipos de detectores, como detectores de electrones secundarios (SECD), detectores de ionización por llama (FID), detectores de fluorescencia y detectores de masas, entre otros. La fase móvil en la espectrometría de masas es una fase gaseosa que consiste en iones cargados generados a partir de la muestra analizada. Estos iones son manipulados y separados en función de su relación m/z en el analizador de masas Ausencia de una fase estacionaria es una de las características distintivas de la espectrometría de masas y permite una separación y análisis altamente selectivos de iones en función de sus masas y cargas. Esta capacidad de separación precisa es lo que hace que la MS sea una técnica poderosa para la identificación y cuantificación de compuestos, así como para la obtención de información estructural. Detector – es una analizador de masa magnética Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF): Cuadrupolo Trampa Iónica (Ion Trap) Fuente de Ionización Ionización Electrónica (IE): Utiliza electrones de alta energía para arrancar electrones de las moléculas, formando iones positivos. Adecuado para moléculas pequeñas y volátiles. Ionización Química (IC): Similar a la IE, pero se usan gases reactivos (como metano o amoníaco) para ionizar las moléculas. Electrospray (ESI): Produce iones cargados rociando una solución con alto voltaje, ideal para biomoléculas grandes y sensibles como proteínas. Maldi (Matriz-Asistida por Desorción/Ionización Láser): Utiliza un láser para ionizar moléculas mezcladas en una matriz, adecuado para análisis de biomoléculas como péptidos y azúcares. Analizador de Masas Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF): Los iones se aceleran hacia un detector, donde el tiempo que tardan en llegar depende de su relación masa/carga (m/z). Iones más ligeros llegan primero. Analizador Cuadrupolar: Utiliza un campo eléctrico oscilante para seleccionar iones de una relación m/z específica mientras deja pasar otros. 14  Analizador de Trampa Iónica: Los iones se retienen en un campo electromagnético y se liberan de manera controlada para ser detectados por su m/z. FT-ICR (Resonancia Ciclotrónica de Iones con Transformada de Fourier): Los iones se aceleran en un campo magnético fuerte, y su frecuencia de movimiento se relaciona con su m/z. Analizador de Sector Magnético: Los iones se curvan en un campo magnético; la cantidad de curvatura depende de su m/z. Detector Multiplicador de Electrones: Los iones impactan en una superficie, generando electrones secundarios, que luego se multiplican para producir una señal medible. Placa de Microcanales: Similar al multiplicador de electrones pero más compacto, detecta los iones con una alta sensibilidad. Detector de Fotoplaqueo: Los iones generan una chispa lumínica al impactar en un detector y esta luz se detecta con un fotomultiplicador. Detectores de Tiempo de Vuelo (TOF): Registran el tiempo exacto de llegada de los iones desde el analizador TOF. Aplicaciones de la espectrometría de masas 1. Identificación de Compuestos: La MS se utiliza para identificar la composición y estructura de compuestos desconocidos o complejos, como metabolitos, productos naturales, drogas y polímeros. 2. Cuantificación: Permite la cuantificación precisa de compuestos en muestras, desde análisis farmacéuticos hasta determinación de niveles de contaminantes en alimentos y medio ambiente. 3. Proteómica: En biología, se utiliza para el análisis de proteínas, incluyendo la identificación de proteínas en estudios de proteómica y la caracterización de modificaciones post-traduccionales. 4. Secuenciación de Péptidos y Proteínas: En proteómica, la MS se utiliza para la secuenciación de péptidos y proteínas, lo que proporciona información sobre la secuencia de aminoácidos. 5. Farmacocinética: En la industria farmacéutica, se utiliza para el estudio de la absorción, distribución, metabolismo y excreción de fármacos en el organismo. 6. Análisis de Elementos y Compuestos Isotópicos: La MS también se utiliza para el análisis de isótopos, lo que es útil en geología, arqueología y estudios medioambientales. 7. Criminalística y Toxicología Forense: En la detección de drogas, venenos y compuestos tóxicos en muestras forenses. 8. Ciencias Ambientales: Para el análisis de contaminantes en el aire, agua y suelo, así como en la monitorización de compuestos en la atmósfera. 5. ELECTROFORESIS La electroforesis es una técnica utilizada para hacer separaciones de mezclas complejas y facilitar los análisis, permite hacer separaciones a niveles de microgramo de sustancias ionizables. Se ha aplicado para resolver problemas en la separación de macromoléculas de interés en la industria biotecnológica y en las investigaciones de biólogos y bioquímicos por su gran poder resolutivo y su utilidad para lograr separaciones de componentes de mezclas complejas entre las que destaca: aniones y cationes inorgánicos, aminoácidos, catecolaminas, fármacos, vitaminas, carbohidratos, péptidos, proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos, nucleótidos. PRINCIPIO DE ELECTROFORESIS Al aplicar un campo eléctrico a una disolución, las moléculas de soluto con carga eléctrica neta positiva se desplazan hacia el cátodo y las moléculas con carga negativa se desplazan hacia el ánodo. Este desplazamiento se denomina electroforesis. La electroforesis es una técnica analítica que puede definirse como un proceso en el cual las especies químicas cargadas eléctricamente (iones, partículas y coloides) se separan en función de sus distintas velocidades de migración en un campo eléctrico. 15 TIPOS DE ELECTROFORESIS La electroforesis, de acuerdo con el medio donde es posible la migración de las partículas para su separación, se puede clasificar en: electroforesis sobre papel; electroforesis sobre gel y electroforesis capilar. Electroforesis sobre gel Electroforesis capilar Se basa en una metodología clásica donde las separaciones Las separaciones ocurren dentro de un capilar de sílice, en se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o una placa esta última modalidad parece ser el sustituto de la de un gel semisólido y poroso. electroforesis convencional, porque permite obtener El ADN tiene carga neta negativa debido a que los fosfatos, resultados más satisfactorios. que forman parte de los nucleótidos que lo componen, quedan dispuestos hacia el exterior de la doble hélice Las proteínas tienen una carga eléctrica positiva o negativa, y se mueven en un líquido cuando se colocan en un campo eléctrico. En el caso de las proteínas se realiza pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se homogenizan las proteínas ELEMENTOS NECESARIOS PARA UNA ELECTROFORESIS 16 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente, que se disuelve fácilmente en temperatura de 50 a 60ºC, se torna líquida y se solidifica cuando se enfría formando un gel altamente poroso. La agarosa posee ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un compuesto tóxico y permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares variados, según la concentración de agarosa que se emplee. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentración de agarosa se escoge según el tamaño del ácido nucleico que se vaya a analizar En el caso de ácidos nucleicos no linearizados, como plásmidos circulares (conformación nativa), ARN con estructuras secundarias o ADN de gran longitud, la migración no sólo depende del peso molecular sino también del grado de empaquetamiento que presenten. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA La acrilamida es un polímero sintético, termoestable, incoloro y químicamente inerte, con el que se pueden generar geles con un amplio intervalo de tamaños de poro. El gel de poliacrilamida es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. El tamaño de poro de un gel de acrilamida está determinado por la concentración total de acrilamida presente (acrilamida + bisacrilamida), que generalmente se maneja en proporción de 19:1. Cuando la acrilamida se encuentra en disolución acuosa experimenta autopolimerización de forma espontánea y lenta. La acrilamida es una neurotoxina, por lo que debe manejarse con precaución. También es esencial almacenarla en un lugar refrigerado, seco y oscuro para reducir la autopolimerización y la hidrólisis. El gel de acrilamida es capaz de soportar mayores voltajes que la agarosa y es susceptible de teñirse por varios procedimientos, y también puede desteñirse en caso necesario. Los geles de acrilamida pueden digerirse para extraer fracciones separadas (bandas) o desecados para su exposición radiográfica y registro permanente. GELES DE POLIACRILAMIDA La electroforesis de proteínas emplea geles de acrilamida de dos capas de gel a diferente concentración de acrilamida, un gel superior o concentrador y un gel inferior de separación o de resolución. El gel de concentración tiene un tamaño de poro grande y se prepara con un amortiguador de Tris/HCl con pH de 6.8, dos unidades de pH menor que el buffer de corrimiento hecho de Tris/SDS/glicina. Buffer de corrimiento El buffer de corrimiento es de la misma composición y pH que el buffer con el que se prepara el gel de resolución, ya sea de agarosa o de acrilamida. Éste proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. El buffer TAE contiene Tris base, ácido acético y EDTA, ajustado a pH 8.5. El buffer de corrimiento de electroforesis de proteínas lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM, a un pH 8.3. Marcador de peso molecular Son moléculas de ADN o de proteínas que permiten determinar por comparación el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos o proteínas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis. 17 Buffer de carga Este amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel; permite, además, monitorear el corrimiento de la muestra en el gel. Se emplea en relación 1:3 para ácidos nucleicos o 1:6 para proteínas, respecto a la cantidad de muestra. Transiluminador ultravioleta El transiluminador transmite luz del espectro ultravioleta a través de la muestra, excitando la molécula cromogénica que emite energía fluorescente que permite visualizarla. El transiluminador es el sistema empleado con más frecuencia por ser simple y efectivo. En general emiten energía a una longitud de onda a 302 nm, aunque también existen para 254 y 365 nm. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL La electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D PAGE) es la herramienta más empleada para el análisis global y la separación de los componentes del proteoma. Dicha técnica permite la separación de cientos o miles de proteínas (“spots”) en un único gel, mostrando un patrón característico. Preparación de la muestra o Se emplean agentes caotrópicos, surfactantes y agentes reductores. Los agentes caotrópicos como la urea y tiourea, provocan la desnaturalización de las proteínas por ruptura de puentes de hidrógeno, dejando expuestos los residuos hidrofóbicos que son solubilizados por los agentes surfactantes. Los agentes reductores como el DTT (aunque también se emplean otros reductores alternativos no cargados), completan la desnaturalización proteica por ruptura de puentes disulfuro. Separación en la 1ª Dimensión (Isoelectroenfoque) o En primer lugar las proteínas se separan en base a su punto isoeléctrico en gradientes de pH inmovilizados (IPGs). Separación en la 2ª Dimensión (SDS-PAGE) o Una vez que las proteínas han sido separadas en función de sus propiedades eléctricas, pasamos a separarlas en función de su tamaño o peso molecular mediante la electroforesis en geles de acrilamida en presencia de dodecil-sulfato sódico (SDS). o Estas dos separaciones sucesivas permiten aislar prácticamente todas las proteínas de un proteoma en una matriz bidimensional (“electroforesis bidimensional”). CARGAS PRESENTES EN LAS BIOMOLÉCULAS Y SU INFLUENCIA CON EL PH Extremo N-terminal: El extremo N-terminal de una proteína generalmente contiene un grupo amino (NH2), que puede actuar como una base débil y llevar una carga positiva cuando está en un ambiente adecuadamente alcalino. Extremo C-terminal: El extremo C-terminal de una proteína generalmente contiene un grupo carboxilo (COOH), que puede actuar como un ácido débil y llevar una carga negativa cuando está en un ambiente adecuadamente ácido. A carga neta de una proteína en su conjunto depende de la suma de las cargas en todos sus grupos amino y grupos carboxilo, así como de las interacciones entre las cadenas laterales de los aminoácidos presentes en la secuencia de la proteína. La carga neta de una proteína puede ser positiva, negativa o neutra, y esto afecta a su comportamiento en campos eléctricos, como en la electroforesis. ISOELECTROENFOQUE Se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La región del ánodo es ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tengan su punto isoeléctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras aquéllas que se encuentran en medios con pH más altos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo. 18  Técnica analítica en la que se separan biomoléculas, específicamente proteínas por sus puntos isoeléctricos (pI)(Mathy y Sluse, 2008). El punto isoeléctrico es el pH en el cual una molécula tiene carga neta cero. La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica, y la magnitud de esta depende del pH del medio en el que se encuentran. Gracias a esto, es posible desplazarlas cuando se someten a un campo eléctrico. Esta técnica trabaja con los cambios en el pH. Las proteínas son sometidas a un campo eléctrico en un gradiente de pH, hasta alcanzar el pI, entonces se detienen. FUNCIONAMIENTO 1. Llenado de un capilar neutro con una mezcla de la muestra y una mezcla de anfolitos 2. Aplicación de viales ácidos/bases en cada extremo 3. Los anfolitos forman un gradiente de pH dentro del capilar. 4. Los analitos anfóteros se desplazan a la posición a lo largo del capilar, en la que su carga neta es 0 ISOELECTROENFOQUE Y SU APLICACIÓN EN ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL DIFERENCIA DE RESULTADOS OBTENIDOS EN CADA TIPO DE ELECTROFORESIS 19 APLICACIONES 1. Caracterización de proteínas 2. Separación de proteínas 3. Verificación fármacos 4. Diagnóstico clínico Ejemplo Separación de DNA, estas moléculas son muy grandes, por lo que es necesario fragmentarlas mediante endonucleasas de restricción, que cortan secuencias específicas. Los fragmentos se separan por electroforesis en gel de agarosa, gracias a su carga negativa por los grupos fosfato de los ácidos nucleicos. Posteriormente, con colorantes como azul de bromofeno y xileno cianol se pueden ver los avances, y cuando estos son de tamaño muy pequeño se utilizan geles de poliacrilamida. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ELECTROFORESIS ¿Cómo funciona? Se basa en el diferente movimiento de las moléculas cargadas eléctricamente a través de la superficie hidratada de un medio sólido. Al hacer pasar una corriente sobre el medio, las moléculas con una carga negativa, se mueven hacia el ánodo (+), mientras que las moléculas con carga positiva, se ven atraídas hacia el cátodo (-). Es una técnica que sirve para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. A diferencia de las proteínas, las cuales pueden tener una carga neta positiva o negativa, los ácidos nucleicos (ADN, ARN) están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucléicos migrarán hacia el polo positivo Desplazamiento Al desplazarse a través de una matriz porosa, por ejemplo un gel de agarosa, las moléculas de ADN son sometidas a dos fuerzas de acción opuestas que determinan la velocidad de la partícula 1. Fuerza eléctrica: impone una aceleración proporcional al cociente carga/masa 2. Fuerza de rozamiento: Se opone a la migración con una intensidad que depende del tamaño y la forma de la partícula y de las características del medio TIPOS Electroforesis en acetato de celulosa Electroforesis en gel de agarosa Electroforesis en gel de poliacrilamida Electroforesis capilar Electroforesis bidimensional Isoelectroenfoque Electroforesis de hemoglobina Electroforesis de proteínas en suero PRINCIPALES USOS Análisis de ADN: Se utiliza para separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños, comúnmente en estudios genéticos y en pruebas de paternidad, así como en secuenciación de ADN. Análisis de proteínas: Sirve para identificar y caracterizar proteínas, separando las diferentes formas de una misma proteína o analizando su pureza. Detección de mutaciones: Ayuda a identificar variaciones genéticas, mutaciones y polimorfismos. Diagnóstico médico: Se usa para detectar trastornos genéticos o enfermedades relacionadas con proteínas 20