Lecture 5: Virus Attachment and Entry | 2024/2025 | Sorbonne University

Atașarea si Intrarea virusului in celula SERBAN MOROSAN, DVM, PHD, DIP. VET. LAS LECTURE 5 2024/2025  Virusurile sunt paraziți obligat intracelulari Chiar daca sunt paraziți obligat intracelular, particu...

Atașarea si Intrarea virusului in celula SERBAN MOROSAN, DVM, PHD, DIP. VET. LAS LECTURE 5 2024/2025  Virusurile sunt paraziți obligat intracelulari Chiar daca sunt paraziți obligat intracelular, particulele virale sunt prea mari pentru a intra în celulă prin membrana plasmatică Mai mult decât atât, genomul viral este încapsulat într-o protecție stabila Aceste obstacole trebuie depășite în timpul procesului de intrare în celule SV_40 (replicare in nucleu) 2  Intrarea virusurilor in celula Intrarea virusului în celule NU este un proces pasiv, ci se bazează pe modificarea virală a proceselor celulare normale de intrare a moleculelor necesare celulei, cum ar fi: Ø Endocitoza Ø Fuziunea membranară Ø Traficul vezicular Ø Transport în nucleu 3  Atașarea : principii generale Matricea extracelulara : - menține împreună celulele și organele din organism - este formata in principal din clase de macromolecule : glicozaminoglicani (heparin-sulfat etc.), care sunt polizaharide, si proteine structurale (colagen sau elastină) sau adezive (fibronectina) 4  Receptorii celulari pentru virusuri Afinitatea unui receptor pentru o singură particula virala este scăzută Prezența mai multor „site-uri” de legare a receptorilor la un virus și natura fluidă a membranei plasmatice permite angajarea mai multor interacțiuni În consecință, aviditatea (puterea conferită de interacțiunile multiple) de legare a particulelor de virus la celule este de obicei foarte mare Receptorii pot fi, de asemenea, determinanți ai tropismului tisular, al predilecției unui virus de a invada și de a se reproduce într-un anumit tip de celulă 5  Găsirea receptorului celular „corect” Etapa 1 : Aderarea la suprafața celulei (coliziuni aleatorii și electrostatice) - Fără specificitate Etapa 2 : Atașarea la molecule de receptor specifice de pe suprafața celulei - Cu specificitate - Pot fi implicați mai mulți receptori Etapa 3: Transferarea genomul în interiorul celulei v Aceste etape aduc genomul in citoplasma, care este locul de replicare a majorităților virusurilor ARN v Genomurile virusurilor ADN sunt transportate in nucleu cu ajutorul căilor de transport celular (cu excepția Poxvirusurilor, Retrovirusurile ARN, Influenta virus si Borna virus). 6  „Dezasamblarea” capsidei Receptorul joacă un rol important în „dezasamblarea” capsidei Interacțiunile particulei virale cu receptorul acesteia, pot iniția modificări conformaționale care „amorsează” capsida pentru dezmembrare Alternativ, receptorul poate direcționa particula virala către căile endocitozei, unde „dezmembrarea” capsidei poate fi declanșată de un pH scăzut sau de acțiunea proteazelor. 7  Receptorii celulari si virusurile Esențiali pentru toate virusurile, cu excepția fungilor (nu au faze extracelulare) și ale plantelor (intră în celule prin deteriorări mecanice : mașini agricole, viermi, insecte) Receptorii pentru virusuri cuprind o varietate de proteine de suprafață celulară, carbohidrați, lipide...... Mulți receptori de viruși au fost identificați în ultimii 30 de ani și includ proteine de tip imunoglobuline, receptori de legare a liganzilor, glicoproteine, canale ionice, gangliozide, carbohidrați, proteoglicani și integrine. Uneori este necesar de un al doilea receptor numit co-receptor 1985: un receptor cunoscut, acidul sialic pentru virusul gripal 8  Diferite tehnologii pentru identificarea receptorilor AND recombinant Anticorpii monoclonali Citometria de flux (abilitatea de a purifica o celula specifica utilizând anticorpi specifici) Secvențierea nucleotidelor siRNA (small interfering RNA) CRISPR/Cas9 9  Criterii pentru identificarea receptorilor celulari pentru virusuri Atașarea receptorului la particula virală Anticorpul specific receptorului blochează infecția Gena receptorului conferă celulei susceptibilitate (adică prezenta unui receptor) - prin introducerea genei receptorului in celule care nu au acest receptor Întreruperea genei receptorului blochează infecția (la celulele care au receptorul necesar) 10  ACE2 este receptorul SARS-CoV2 Linia celulara HeLa nu prezinta receptorul ACE2 Plasmid ADN ce codifică ACE2 linia celulară HeLa ce prezintă receptorul ACE2 Schimbarea doar a 2 AA in structura Spike permite șoarecilor sa se infecteze. F important pentru a avea un model experimental 11  Toate aceste proteine au funcții celulare 12  Virusurile din aceeași familie se pot atașa la receptori diferiți Rhinoviruses (3), retroviruses (16) Un virus se poate atașa mai mulți receptori (exemplu Herpes virus) Receptori multipli pentru virusul Herpes simplex 1 (HSV-1). Sunt prezentate șase (din 15) glicoproteine virale de suprafață, dintre care patru sunt esențiale pentru intrare. Atașarea inițială la HSPG (heparan sulfat glicozaminoglicani) este mediată de gC și gB. 13  Diferite virusuri pot atașa același receptor Adenovirusul și Coxsackievirus B3 au receptor primar comun Herpesvirusul porcin (virusul pseudorabiei), se atașează la același receptor ca și poliovirusul uman 14  Cum se atașează virusurile icosaedrale fără anvelopă la receptori - caracteristicile de suprafață: canioane/suprafețe in platou Atașarea particulelor icosaedrice ;exemplul 1 : virusuri ARNss (+) Poliovirus Rhinovirus CryEM Imagine / Receptorii sunt in culoarea gri 15 Receptorii sunt in jurul axelor x 5 la ambele exemple  Cum se atașează virusurile icosaedrale la receptori (prin caracteristici de suprafață: fibre) Atașarea particulelor icosaedrice (exemplul 2 : virusuri ADN) Are nevoie de 2 receptori 16  Cum se atașează virusurile cu anvelopa la receptori (se atașează la receptori via glycoproteinele de suprafață de la nivelul membranei) Neuraminidaze (NA) Hemagglutinina (HA) proteina virală ce se va atașa la receptor) Virusul Influenta Glicoproteinele transmembranare ale virusurilor cu anvelopă 17 mediază atașarea si intrarea virusului  Cum se atașează virusurile cu anvelopa la receptori Acidul Sialic: receptorul pentru virusul gripal sau influenta Acidul sialic, el este ultimul zahăr din lanțul glicoproteinei transmembranare Acid sialic: N-acetylneuraminic α(2,3) Legături covalente 2C-0-3C acid (A,B); 9-O-acetyl-N- α(2,6) neuraminic acid (C) α(2,6) interacționează preferențial cu tulpinile virale umane α(2,3) interacționează preferențial tulpinile aviare 18 Legături covalente 2C-0-6C  Atasarea SARS-CoV-2 virus cu anvelopa Receptor (ACE2) Receptor Binding Domain (ACE2) HCoV-229E : Human amino peptidase N HCoV-NL63 :Angiotensin converting enzyme 2 HCoV-OC43 :N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid SARS-CoV :Angiotensin converting enzyme 2 MERS-CoV :Dipeptidyl peptidase 4 SARS-CoV-2 : Angiotensin converting enzyme 2 19 20  Cum intra virusurile in celula ? Celule au procese naturale pentru a internaliza moleculele de care au nevoie “Cellular drinking” Proces ce Un process specific Nu sunt mecanisme poate fi specific pentru nespecific virusuri Mecanisme ce pot fi pentru virusuri 21  Citoplasma este aglomerata! Mișcarea complexelor proteice mari nu va avea loc prin difuzie! Virusul avansează in citoplasma prin intermediul proteinelor motorii 22  Endocitoza este mecanismul de intrare al virusurilor 23  Intrarea virusurilor si mișcarea lor in citoplasma Prin endocitoză Clathrin dependentă Prin endocitoză Clathrin si caveolina independentă Prin endocitoză Caveolin dependentă Prin fuziune cu membranele plasmatice Prin sistemul de microtubuli 24  Endocitoza este mecanismul de intrare al virusurilor 1. Clathrin dependentă : - veziculele acoperite cu clathrin : 2% din suprafața celulară - Transportul succesiv si fuziunea cu endozomii expun conținutul la un pH din ce in ce mai scazut: pH de 6,5-6 (endozomii precoce); pH de 6-5 (endozomii târzii) ; 2. Caveolin dependentă : - Acest tip de endocitoză este implicata in transcitoză, transductia semnalelor, internalizarea componenetelor membranare si a liganzilor extracelulari. - Atașarea unui virus la receptorul celular activează calea de transducție necesara formarii veziculelor caveolare (care sunt transportate in citoplasma); aceste vezicule fuzionează cu caveozomii (organele membranare ce conțin caveolina); pH-ul acestor organele este neutru 25  Mișcarea particulelor virale si subvirale in celula Particulele virale si componentele sale sunt transportate prin intermediul citoscheleului Citoscheletul este o rețea dinamică de proteine filamentoase compus din microtubuli si filamente de actină Microtubulii sunt polarizați : „+” spre nucleu si „-” spre suprafața celulei ceea ce permite deplasarea componentelor celulare si virale pe distante lungi Filamentele de actină „asistă” mișcarea particulelor viral la nivelul membranei plasmatice Transportul de-a lungul fibrelor de actină este asigurat de proteina miozină iar in cazul microtubulilor este asigurat de kinezină si dineină 26  Mișcarea particulelor virale si subvirale in celula Exista doua căi clasice de transport al particulelor virale : 1. Prin intermediul veziculelor membranare (endozomii) ce interacționează cu mecanismul de transport al citoscheltului 2. Direct (virusul se atașează direct la mecanismul de transport) 27 28  Fuziunea membranară Eliberarea acidului nucleic in cazul virusurilor cu anvelopă este dependenta de fuziunea membranară Fuziunea membranară are loc in timpul diferitelor procese celulare cum ar fi: diviziunea celulara, excitoza etc Procesul de fuziune membranară trebuie sa fie controlat pentru a menține integritatea celulara si a organitelor sale Controlul acestui proces este realizat de proteine specializate : proteine de fuziune 29  Intrarea la nivelul membranei plasmatice mediate de proteine de fuziune Fuziunea se realizează prin acțiunea a doua proteine : Proteina de atașare Proteina de fuziune (F) Proteinele de fuziune au in partea terminala N aminoacizi hidrofobi care se pot insera in membrana celulara Proteinele F sunt ascunse Doar după atașarea HIV-1 virusului la receptorul corect acestea sunt expuse 30 31  Fuziunea membranei virusului gripal (Fuziune mediată de pH scăzut la nivelul endozomilor) - La suprafața celulara pH-ul este neutru - Ce catalizează reorientarea proteinei de fuziune? : pH –ul scăzut - Scaderea pH-ului la nivelul endozomilor este un proces normal - Proteina de fuziune (in roșu) este ascunsa iar reorientarea ei este datorita scăderii pH-ului 32  Cele trei stadii ale HA virusului influenza Proteaza este una celulara si se găsește doar la nivelul plămânilor Structura in forma de „agrafa de par” apropie cele doua membrane (virala si celulara) pentru a fuziona 33  Proteine de fuziune de clasa I Sunt perpendicular pe membrana– „spikes” Majoritatea sunt α-helical Formează trimeri 34  Atasarea SARS-CoV-2 TMPRSS Ce catalizează 2 reorientarea proteinei de fuziune? : clivajul proteinei spike Fusion Clivajul proteinei protein « spike » este realizat Hidroxiclorochină ? de către o proteaza celulara (TMPRSS2) si Furin cleavage site acest proces trebuie sa fie controlat Proteaza TMPRSS2 se găsește in plămâni In celulele fără TMPRSS2 virusul intra prin endocitoză 35  Proteinele de fuziune de clasa II (Zika virus, Dengue virus, West Nile virus) Marea majoritate sunt β-sheet Formeaza dimeri Paralele cu membrana 36  Intrarea virusului Ebola: un alt tip de fuziune (fuziune mediata de un receptor endozomal) intrare prin micropinocitoza; recpetorul nu a fost identificat Virusul Ebola nu fuzionează la suprafața celulei Acest virus fuzionează în endosomi pH-ul endosomului care permite catepsinelor să scindeze proteinele virale pentru a activa proteina de fuziune și apoi Virusul se leagă de un receptor din endosom care apoi catalizează fuziunea cu endosomul Boala Niemann-Pick, tip C1 37 NPC1) este o proteină membranară care mediază traficul intracelular de colesterol la mamifere  Fuziunea este controlata 1. Nu trebuie să aibă loc într-o locație greșită 2. pH neutru (membrana plasmatică): - A doua interacțiune a receptorilor proteici este necesară 3. Fuziune cu pH scăzut : - Scindarea proteolitică activează proteina de fuziune (clasa I) - Scindarea unei a doua proteine activează proteina de fuziune (clasa II) - Receptor de fuziune endozomică (Ebola virus) 38 39 Cum sunt eliberate genoamele virusurilor fără anvelopa (adenovirus)? 1. Atașarea la primul receptor 2. Atașarea la al doilea receptor (integrină), ceea de duce la internalizarea virusului prin endocitoza 3. Scaderea pH-ului la nivelul endozomilor duce la o reorientare a proteinelor virale 4. Întreruperea membranei endozomale (adenovirus) indusa de o proteina virala 5. Intreruperea membrane lizozomale sau formarea unui por in membrana endozomala (poliovirus) 40  Eliberarea genomului adenovirus (la nivelul complexului porului nuclear) 41  Eliberarea ARN-ului Poliovirusului formarea unui por (catalizat de receptor) „Umbilicus connector” 42  Calicivirus : formarea unui por (catalizat de catre receptor ) 43 Reovirus Intrarea unui virus ce prezinta doua structuri de protecție Intreruperea membranei lizozomale (reovirus) 44  Dezasamblarea pH independenta (Semliki Forest virus : ARN „+” si cu anvelopa) Nucleocapsida se dezasamblează printr-un mecanism pH independent Fuziunea membranelor virale si endozomale expun nucleocapsida la citoplasma Dezasamblarea nucelocapsidei este mediata de ribozomi Atașarea ribozomilor declanșează dezasamblarea Urmează traducerea 45  Traficul intracelular si „livrarea” genomului viral După intrare, particulele virale si subvirale „călătoresc” in diferitele compartimente celulare corespunzătoare replicării genomului viral Pentru virusurile cu anvelopa ce fuzionează cu membrana plasmatica celulară, „marfa” transportată sunt particulele subvirale Pentru virusurile cu anvelopă ce fuzionează la nivelul compartimentelor celulare interne, transportul este realizat (cel puțin in parte) de procesele ce deplasează veziculele Intr-un anumit punct al transportului, îndepărtarea protecției (capsida) are loc si genomul viral este eliberat pentru a fi replicat Genomul virusurilor fără anvelopa este transferat de-a lungul membranei celulare prin alte mecanisme decât fuziunea mebranară 46  Importul genoamelor virale in nucleu Complexul porului nuclear: - Doua straturi lipidice separate de un lumen - Ca si celelalte membrane celulare, acest complex este impermeabil pentru macromolecule ca si proteinele - Semnalele de localizare nucleară sunt importante pentru virusuri 47  Importul genomurilor virale in nucleu - Majoritatea virusurilor ADN se replica in nucleu - Virus ARN (virus influentza) este o exceptie - Importul genomului retrovrusurilor : ARN-ul este retrotranscris in ADN ; ADN-ul va fi internalizat in nucleu pentru a integra genomul celulei gazda 48  Patru moduri de a intra in nucleu Porul nuclear este sufficient pentru a Herpesvirus Adenovirus este Parvovirus (ssDNA) permite intrarea (dezasamblare minima dezasamblat Se leagă de porii genomului la nivelul porului nucleari, perturbă nuclear) membrana nucleară și porii devin permeabili 49  MERCI SYNTHESIS OF RNA FROM RNA TEMPLATES SORBONNE-UNIVERSITE.FR