LECTURE 4 bis - Virus Structure - PDF

Structura Virusurilor SERBAN MOROSAN, DVM, PHD, DIP. VET. LAS LECTURE 4 2024/2025  Astăzi vom construii virusuri Care sunt funcțiile proteinelor structurale ale particulelor virale? 2  Care sunt funcțiile proteinelor structurale ale part...

Structura Virusurilor SERBAN MOROSAN, DVM, PHD, DIP. VET. LAS LECTURE 4 2024/2025  Astăzi vom construii virusuri Care sunt funcțiile proteinelor structurale ale particulelor virale? 2  Care sunt funcțiile proteinelor structurale ale particulelor virale? 1. Protecția genomului (funcția principală; partea stabilă): - Asamblarea unui înveliș proteic stabil - Recunoașterea și „ambalarea” specifică a genomului acidului nucleic viral (aproape niciodată genomul celulei pe care a infectat-o) - Interacțiunea cu membranele celulei gazdă pentru a forma învelișul extern (anvelopă) : in cazul virusurilor cu anvelopă Virusul gripal (cu anvelopa) Adenovirus Bacteriofag 3  Funcțiile proteinelor structurale 2. Livrarea genomului (partea nestabila): - Atașarea receptorilor celulelor gazdă - Transmiterea de semnale ce induc „dezvelirea” sau expunerea genomului - Facilitează inducția fuziunii cu membranele celulare - Interacțiunea cu componentele interne ale celulei infectate pentru transportul genomului la locul adecvat (citoplasmă, nucleu) 4  Funcțiile proteinelor structurale 3. Alte funcții: Interacțiuni cu componente celulare pentru transportul intracelular către locurile specifice pentru asamblare Interacțiuni cu componente celulare pentru a asigura un ciclu infecțios eficient 5  Câteva definiții importante Subunitate : Un singur lanț polipeptidic pliat simplu Unitate structurală (protomer, unitate asimetrică) - Unitate din care sunt construite capsidele sau nucleocapsidele; formata din una sau mai multe subunități ; (chenarul albastru din imagine) Capsidă (capsa = latină, cutie) : Învelișul proteic din jurul genomului Anvelopa (membrana virala) – derivata întotdeauna din stratul celular bilipidic (ce conține glicoproteine virale) Nucleocapsida (nucleul viral) – acidul nucleic + proteine ; termen folosit atunci când vorbim despre o substructură a particulei virale (este o nucleocapsidă pentru sa se află in interiorul unei membrane) Virion : particula virala infecțioasă 6  Particulele virale în perspectivă Nanometru: 10-9 m = 10 Å = 0.001 microni Alpha helix (proteina) : 1 nm diametru ADN: 2 nm diametru Ribozomii: 20 nm diametru Poliovirus: 30 nm Pandoravirus: 1000 nm 7  Particulele virale sunt metastabile 1. Trebuie să protejeze genomul (stabil) 2. Trebuie sa „livreze” genomul in celula gazda pentru a declanșa infecția (instabil) Semnalul care declanșează trecerea dintr-o stare stabila la una instabila este diferit de la un virus la altul (atașarea la un receptor de exemplu poate fi un semnal) 8  Virionii sunt metastabili Particulele virale nu au atins conformația minimă a energiei libere (stadiul 3): în starea lor stabilă pentru a ajunge la o stare instabilă Trebuie depășită bariera energetică nefavorabilă (pentru a ajunge la acea conformație minimă a energiei libere) G = energia liberă Stadiul 1: energie maxima Bariera energetică nefavorabilă: stadiul 2 Conformația minimă a energiei libere= stadiul 3 Energia introdusă în particula virala în timpul asamblării („spring loaded », sau resort) este energia potențială utilizată pentru dezasamblare (dacă celula furnizează un semnal adecvat) Semnalul adecvat pentru dezasamblare poate fi : atașarea la un receptor, un pH scăzut, o enzima (o proteaza) care secționează proteine structurale.......) 9  Cum este atinsa metastabilitatea? Structură stabilă - Creată prin dispunerea simetrică a multor proteine identice pentru a asigura un contact maxim Structură instabilă - Structura nu este de obicei legată permanent (legături non-covalente) - Poate fi demontată sau slăbită pentru a elibera sau expune genomul 10 11  Metodele de studiu ale biologiei structurale virale - Microscopie electronică - Cristalografie cu raze X - Microscopie crio-electronică (cryoEM) și tomografie crio-electronică - Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară (RMN) 12  Începutul erei virusologiei structurale moderne 1940: Helmuth Ruska a folosit un microscop electronic pentru a face primele fotografii ale particulelor de virus Ruska, H. 1940. Die Sichtbarmachung der BakteriophagenLyse im Ubermikroskop. Naturwissenschaaften. 28: 45-46). E. Coli + bacteriofagi 13  Microscopia electronica (limitele) Materialele biologice au un contrast inerent redus: trebuie colorate Colorare negativă cu „electron-dense material”, (uranyl acetate, phosphtungstate) : virus + uranyl acetate + electroni (1959); (ce bombardează imaginea) Rezoluție 50-70 A ° (alpha helix = 10 A ° diametru; 1A ° = 0,1 nm) Interpretarea structurală detaliată este imposibilă Poliovirus Adenovirus Virusul hepatitei B Virusul gripal 14  X-ray crystallography ( 2- 3 A° pentru virusuri) Virusul cristalizat se pune intr-un fascicol de raze X Purificarea virusului si multiplicarea lui in cantități suficiente pentru a putea fi cristalizat (sarea) Cristalografia cu raze X este o tehnică pentru determinarea structurii tridimensionale a moleculelor, inclusiv a macromoleculelor biologice complexe, cum ar fi proteinele și acizii nucleici. Este un instrument puternic în elucidarea structurii tridimensionale a unei molecule la rezoluție atomică. Datele sunt colectate prin difracția razelor X dintr-un singur cristal, care are un aranjament ordonat ( atomii din cristal se repetă în mod regulat). Pe baza modelului de difracție obținut din împrăștierea razelor X de pe ansamblul periodic al moleculelor sau atomilor 15 din cristal, densitatea cristalului poate fi reconstituită si deci al virusului  Cryo-electron microscopy ( cryoEM) Premiul Nobel pentru chimie 2017 a fost acordat în comun lui Jacques Dubochet, Joachim Frank și Richard Henderson „pentru dezvoltarea microscopiei crio-electronice pentru determinarea structurii de înaltă rezoluție a biomoleculelor în soluție”. 16  Cryo-electron microscopy ( cryoEM) 1. Particulele virale + solutie apoasa = congelare 2. Particulele virale sunt fotografiate (micrografii electronice): sute si sute de fotografii (particule care sunt orientate diferit in spațiu 3R) 3. Analiza (sofware) : pentru asamblarea acestor imagini într-o imagine 3R 4. Excelenta metoda pentru virusurile mari 17  Raze -X crystalografie CryoEM 18 Poliovirus, 1985 (2,9 A°) Rezolutie de 20A°  CryoEM: a câștigat in rezoluție in ultimii ani ZIKA Virus – 3,8 A° ZIKA VIRUS 3,8 A° (2015) 19  Structura SARS-CoV-2 spike: Februarie 2020 Structura unui monomer: CryoEM „Receptor binding domain” sau domeniul de atașare a receptorului pentru atașarea la receptorul ACE2 Trimer format din trei monomere 20  : SARS-CoV-2 21 22  Genoamele virale Particulele virale 23  Helicoidale Icosaedrale Complexe asimetrice 24  Construcția unei particule virale: simetria este cheia Watson și Crick și contribuția majoră în virologie: structura ADN: enorma descoperire si pentru domeniul virusologiei Contribuția lor fundamentala in virusologie: 1. Majoritatea particulelor virale sunt sferice sau în formă de tijă 2. Deoarece genoamele virusurilor sunt mici (!) ele ar trebui construite cu multe copii al doar câtorva proteine (economie genetică dar si pentru stabilitate) 3. Subunitatea proteică identică este distribuită cu o simetrie helicoidală pentru virusurile în formă de tijă 4. Simetrie icosaedrică pentru virusurile rotunde 25  Regulile de simetrie sunt elegante prin simplicitatea lor (acestea oferă reguli pentru „auto- asamblare”) Regula 1: Fiecare subunitate are contacte de legătură „identice” cu vecinii săi: - Interacțiunea repetată a suprafețelor (chimic complementare) la interfețele subunităților duce în mod natural la un aranjament simetric Regula 2: Aceste legături sunt de obicei ne-covalente - Procesul este reversibil; asamblare fără erori (daca există o eroare atunci acestea pot fi corectate pentru că procesul este reversibil) 26  Simetria și auto-asamblarea (aplicații practice) Multe proteine (sub-unitati) ce formează capsidele se pot auto-asambla în particule asemănătoare virusului (VLPs sau „virus like particles”, nu au acid nucleic) Vaccinurile VHB (hepatita B) , HPV (Papiloma virus) sunt VLPs produse în drojdie (Saccharomyces cerevisiae) Circovirus porcin : VLP circovirus porcin de tip 2 este capsida exprimata de baculovirus (virus ce infectează insectele) Necroza pancreatică infecțioasă (somon) : VP2 exprimată de Escherichia coli Sinteza in cultura celulara a unei singure Pentamer polipeptide Particula goala Vaccin HBV 27 28  Simetria helicoidala Proteinele ce realizează învelișul, prezinta interacțiuni identice (echivalente între ele) dar și cu genomul viral. Acest lucru permite construirea unei structuri mari și stabile (dintr-o singură subunitate proteică ce se repeta) Interacțiuni de tip: proteina-proteina si proteine - acid nucleic (capsida) Specifica virusurilor plantelor (nu au anvelopa): transmise prin acțiuni mecanice: utilaje si insecte 29  Virusuri ARNss(-) cu anvelopa si cu o simetrie helicoidala Particulele virale ale unor virusuri animale cu un genom ARN ss (-) Filovirusurile ( Marburg si Ebola) , Paramyxovirusurile ( Newcastle, pesta rumegatoarelor mici, para influența bovina, Sendai, para influența canina, Hendra, Nipah), Rhabdovirusurile (Rabie, Stomatita veziculara), Orthomyxovirusurile (Influența ecvină, suina, aviara bovina ) prezintă o structură helicoidală ce este încapsulată într-o anvelopă. Toate aceste structuri conțin următoarele elemente: a) Multiple copii ale proteinelor ce interacționează cu genomul (proteinele NP) b) ARN polimeraza virală c) Enzime asociate necesare pentru replicarea genomului. In ciuda faptului că toate aceste virusuri ARNss (-) prezintă o simetrie comună și o compoziție similară, există o mare diversitate din punct de vedere structural și morfologic (mai ales când posedă o anvelopă). 30  Simetrie helicoidala Sendai virus nucleocapsid (paramyxovirus) Animal paramyxovirus Virusurile animale cu simetrie helicoidală sunt întotdeauna înconjurate de o membrana (nucleocapsida: sub structura) Virusurile vegetale sunt fără anvelopa (capsida) 31  Simetrie helicoidala Virusul stomatitei veziculare (bovine): - Utilizat ca vector pentru productia de vaccinuri (Ebola vaccin) - SARS-CoV-2 : nu a trecut de Faza I Stomatita veziculară afectează în principal ecvideele, bovinele și porcii. Oile și caprele pot dezvolta semne clinice, deși acest lucru este mai puțin frecvent, iar camelidele sud- americane sunt, de asemenea, afectate. 32  Virusuri ARNss(-) cu anvelopa si cu o simetrie helicoidala Paramyxoviridae (Newcastle, pesta rumegatoarelor mici, para influența bovina, Sendai, para influența canina, Hendra, Nipah) Rhabdoviridae (rabia) Orthomyxoviridae (influenza virus) Filoviridae (Ebola virus) Nucleocapsida este ansamblul acid nucleic-proteină (sub-structura) care este înconjurat de o membrană De ce această structură la virusurile ARN cu (-)? Deoarece acestea trebuie copiate de o ARN polimerază (care este transportată în nucleocapside) 33  Genom + capsidă = nu este o nucleocapsidă 34  Virusuri ssRNA (+) cu anvelopa si capsidele helicoidale Coronaviridae (SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2) = NUCLEOCAPSID 35 36 37 38  Cum este posibil să construiască o capsidă rotundă utilizând proteine cu forme neregulate? Indiciul nr. 1: Toate capsidele rotunde au un număr precis de proteine; multiplii de 60 cel mai adesea (60, 180, 240, 960) Poliovirus Indiciul nr. 2: Virusurile sferice sunt de mai multe dimensiuni, dar proteinele capsidei au o medie de 20-60 kDa 39  Un solid platonic (după filozoful grec Platon) (un poliedru regulat, convex) are o formă simetrică fiind construit din fețe poligonale congruente (identice ca formă și dimensiune), regulate (toate unghiurile egale și toate laturile egale), cu același număr de fețe care se întâlnesc la fiecare vârf. 40  Simetria icosaedrului Icosaedru: solid cu 20 de fețe (fiecare un triunghi echilateral) : (proteinele virale nu sunt triunghiulare si deci fiecare fata este formata din cel puțin 3 proteine virale; pot fi aceeași sau 3 proteine diferite = unitatea structurala care se va repeta pentru a forma capsida) 12 vârfuri legate de axe de simetrie: 5x, 3x și 2x Permite formarea unei structuri închise cu cel mai mic număr (60) de subunități identice (deci cele mai mici particule de virus sunt produse de 60 de proteine identice) 41  Capside icosaedrale simple Compus din 60 de subunități proteice identice Unitatea structurală este identică cu subunitatea proteică Interacțiunile tuturor moleculelor (proteinelor) cu vecinii lor sunt identice (cap la cap, coadă la coadă) Toate subunitatile se asociaza sub formă de pentamere Particulele sunt sferice, nu icosaedrice! 42  Capside cu T= 1 Adeno-associated virus 2 (parvovirus) 25 nm 60 copii ale unei singure proteine pentru a forma capsida in forma de un icosaedru Utilizat in terapia virală 43  Cum sunt construite virusurile mai mari? Prin adiția mai multor subunități si nu prin adăugarea de proteine mai mari! Hexameri Pentameri Pentameri & hexameri Proteinele sunt reprezentate prin aceste “virgule” Trei moduri de asamblare a subunităților (portocaliu, galben, violet) Interacțiunile de legătură nu mai sunt identice ci sunt cvasi-echivalente (Interacțiuni aproape identice): „coadă la coadă și cap la cap” 180 de subunitati identice 44  Cvasi-echivalența Atunci când o capsidă conține mai mult de 60 de subunități, fiecare subunitate ocupa o poziție cvasi-echivalentă Legăturile necovalente dintre subunități in medii diferite (pentamere si hexamere) sunt similare dar nu identice 45 180 de subunități identice T = număr de triangulație T = Numărul de subunități cuprinse într-o unitate structurală Când T =1 unitatea si subunitatea sunt aceleași Capsidele cu T mai mare de 1 : au o simetrie de tip hexamere 46  T=1 60 units T=3 180 units 47 48  Capside cu T = 3 Picornavirusurile (virusul febrei aftoase si poliovirusul) sunt printre cele mai mici virusuri ce se întâlnesc la om si la animale. Particulele virale au un diametru de aproximativ 30 nm încastrând un genom ARN ss (+), de aproximativ 7,5 kb. La capătul 5’,genomul are atașată (covalent) o proteină (VPg) 60 de protomeri de VP1, VP2, VP3 = 180 subunități T= 3 x 60 = 180 Cele trei proteine sunt diferite dar suficient de similare (Pseudo T3) 5X 6X 49  SV40 (Polyomavirus) T = 6 Capsida acestor mici polyomavirusuri (genom ADN) are un diametru de aproximativ 50 nm este organizata într-un design diferit fără a respecta principiul de cvasiechivalență. Unitatea structurală este un pentamer al proteinei structurale majore. Capsida este astfel construita din 72 de astfel pentamere care se angajează în una dintre cele două tipuri de interacțiuni: 12 pentamere se găsesc în jurul celor 5 axe de simetrie, fiecare fiind înconjurat de 5 vecini restul de 60 de pentamere sunt înconjurate de 6 vecini în jurul celor 6 axe de simetrie. 72 de pentameri de VP1 = 360 subunități Extinderea capătului N-terminal al proteinei VP1 „angajează” proteina VP1 al pentamerului vecin 50  Extinderea capătului N-terminal al proteinei VP1 „angajează” proteina VP1 al pentamerului vecin Acest tip de interacțiune ii conferă capsidei stabilitate 51  Capside mari complexe (T= 25) Adenovirus (hepatita infecțioasă canină) 150 nm 720 copii al proteinei virale II Fibrele la cele 12 vârfuri Proteine cu roluri specializate Proteina IX = ciment (pentru ca legăturile pentagon-hexagon sunt slabe) Capsida particulelor virale ( diametru maxim de 150 nm) are o aparenta icosaedrală și prezintă la suprafața celor 12 vârfuri niște formațiuni numite fibre. Fiecare astfel de fibră prezintă un buton distal ce se atașează la receptorul virusului. Aceste fibre sunt atașate la fiecare vârf la nivelul celor 5 axe de simetrie (12 „penton base”). Capsida este construită din 240 de subunități: formarea acestui tip de capsida depinde de interacțiunile neechivalente dintre subunitățile proteice (structurile hexamerice înconjură 52structurile pentamerice dar și celelalte structuri hexamerice).  Capside complexe cu doua straturi de proteine cu o simetrie icosaedrala VP7 trimers, T=13 VP3 monomers, T=2 Invelisul extern Invelisul intern Reovirusuri T = 13 70 - 90 nm 53 două învelișuri icosaedrale concentrice (fără anvelopa)  Bacteriofagi (cu coada) Coada este atașată la unul din cele 12 vârfuri ale capsidei (capsida are simetrie icosaedrică). Coada este o tijă complexă - folosește simetria helicoidală în multe locuri - unele cozi sunt contractile pentru a injecta ADN-ul in 54 bacterii  Herpes virusurile Membrii familiei Herpesviridae prezinta o serie de arhitecturi neobișnuite. Astfel, mai mult de jumătate din cele 80 de gene ale virusului Herpes Simplex de tip 1 codifica pentru proteine virale. Aceste proteine sunt componente ale anvelopei Particulele virale pot ajunge pana la 200 nm in diametru. Structurile cele mai interne sunt nucleocapsida ce înconjură genomul și învelișul proteic numit tegument. Tegumentul conține mai mult de 20 de proteine. Puține dintre aceste proteine ce formează tegumentul au o organizare icosaedrică 55  Capsida la Herpes Simplex Virus O singură proteină (VP5) formează hexonii si pentonii unei structuri icosaedrice cu T = 16. Acest înveliș aparent icosaedric este de fapt o structură asimetrică:1 dintre cele 12 vârfuri este ocupat nu de un penton VP5, ci de o structură unică numită portal. Portalul este un cilindru gol, care este mai larg la unul din capete si înconjurat de un inel cu două niveluri la capătul mai larg. Incorporarea portalui, care este conectat la membrana virală este importantă fiind implicat în mecanismele de asamblare 56 și de eliberare a genomului în timpul intrării în celula gazdă.  Capsidele pot fi înconjurate de membrane celulare (virusurile cu anvelopă) Unele virusuri posedă, în plus de capsidă, o anvelopă. Acest înveliș este derivat din membranele celulare. Anvelopele virale variază considerabil în funcție de : Mărime Morfologie Complexitate Compoziția lipidelor Numărul proteinelor și localizarea lor 57  Capsidele pot fi înconjurate de membrane celulare (virusurile cu anvelopă) Anvelopa este un strat strat lipidic derivat din celula gazdă - Genomul viral nu codifică sistemul de sinteza lipidică (exceptie fac unelel virusi gigante) Anvelopa este dobândită prin înmugurirea nucleocapsidei printr-o membrană celulară - Poate fi orice membrană celulară, dar este specifică virusului (membrana plasmatică, RE, Golgi) Nucleocapsidele din interiorul anvelopei pot avea o simetrie helicoidală sau icosaedrică 58  Glicoproteinele anvelopei virale Glicoproteinele virale sunt proteine intramembranare (solid ancorate în stratul lipidic) ce prezintă un scurt domeniu membranar („membrane-spanning domain”). El separă domeniul extern (ce cuprinde numeroase oligozaharide) de domeniul intern, format din mici segmente: - Domeniul extern (ectodomen) conține locuri de atașare a receptorilor virali, determinanți antigenici precum și segmente care mediază fuziunea particulelor virale cu membranele celulare, proces ce are loc în timpul pătrunderii virusului în celulă. -Domeniul intern (care este în contact cu alte componente ale particulei virale) este adesea esențial pentru asamblarea virusului. virus gripal 59  Glicoproteinele anvelopei virale Paralele sau perpendiculare Anvelope nestructurate: Glicoproteinele sunt așezate aleatoriu Anvelope structurate (Flavivirus): proteinele ce formează anvelopa urmează o arhitectura icosaedrala. 60  Nucleocapside helicoidale vs icosaedrice 1. Nucleocapside icosaedrale- anvelope structurate Togavirus (rubella virus) 2. Nucleocapside helicoidale – anvelope nestructurate Herpesvirus Influenza virus Ebolavirus 61  Particule virale complexe (fără simetrie) Pandoravirus Poxvirus Particulele virale ale poxvirusurilor nu au o arhitectură icosaedrală sau helicoidală și formează două forme distincte de particule infecțioase, care diferă ca număr și ca origine membranară: - Virioni maturi : sunt mari (350-370 x250 x270 nm) cu cel puțin 75 de proteine ce apar la microscopul electronic ca niște cărămizi sau in forma de butoi (in funcție de orientare); prezintă un perete central ce înconjură miezul central care conține genomul (DNA de aproximativ 200 kb). - Virioni extracelulari cu anvelopă 62  Alte componente ale virionilor Enzime - polimeraze, integraze, proteine asociate - proteaze - poli(A) polimeraza - enzime de limitare („capping”) - topoizomeraze Activatori, responsabili de degradarea ARNm, (necesari pentru o infecție eficientă) Componente celulare - histone, ARNt, lipide, și multe altele 63  MULTUMESC SORBONNE-UNIVERSITE.FR