Laboratorio 3. Esterilización y Preparación de Medios de Cultivos.pdf

PRACTICA Nº3: ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Código: No aplica Versión: 4.0 Página: 1 de 6 Elaborado por: Dina Marcela Ricardo Caldera Shirley Salcedo Arteaga...

PRACTICA Nº3: ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Código: No aplica Versión: 4.0 Página: 1 de 6 Elaborado por: Dina Marcela Ricardo Caldera Shirley Salcedo Arteaga Revisado por: Catalina Tovar Acero Aprobado por: Luis Carlos Garces Paula Andrea Avilés Vergara 1. OBJETIVOS Identificar las principales técnicas de esterilización, desinfección y antisepsia en el laboratorio. Conocer los diferentes medios de cultivo y su preparación. 2. DESCRIPCIÓN GEENRAL ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN La esterilización tiene como objeto la destrucción de los microorganismos, incluyendo formas resistentes como esporas, capsulas, virus y hongos. Es importante recordar que para cualquier procedimiento en el laboratorio se requiere un ambiente libre de agentes patógenos y contaminantes, tanto para garantizar resultados confiables como para proteger la salud del operador. Algunos métodos de esterilización son: esterilizantes físicos desnaturalización Calor húmedo: el objeto es la destrucción de los microorganismos por coagulación de las proteínas celulares. El principal método es la esterilización por vapor a presión, esta se lleva a cabo en una autoclave, equipos que emplean vapor de agua saturado, a una presión de 15 libras y que alcanzan una temperatura de 121º C. Existen protocolos dependiendo del tipo de material que se quiere esterilizar, donde varían los tiempos y la temperatura. Generalmente para material limpio se utiliza entre 10 y 15 minutos y para material contaminado se utiliza de 30 a 40 minutos. Calor seco: La destrucción de los microorganismos se produce por oxidación de sus componentes celulares. Dentro de este se contemplan métodos como: aire caliente, llama directa e incineración. Se utiliza para esterilizar materiales termosensibles, como medios de cultivo, enzimas, vacunas y soluciones de antibióticos. Filtración: utilizando filtros de partículas de alta eficiencia (HEPA). RADIACION: daño que depende de longitud de onda, intensidad y duración Rayos ultravioletas o radiación ionizante: Los rayos ultravioletas inhibe replicacion son altamente ionizacion del agua mutagénicos, radicales de hidroxilo NO IONIZANTE: causan alteraciones en el DNA. Las radiaciones ionizantes producen iones y radicales libres que longitud de onda mayor - Exposicion directa alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y estructuras para la viabilidad de los microorganismos. IONIZANTE: Rayos gamma, rayos X o haces de electrones de alta energía. esterilizantes químicos Esterilizante gaseoso: ejemplo óxido de etileno, formaldehído gaseoso, peróxido de hidrogeno. Son agentes alquilantes funcionan por medio de tres mecanismos diferentes, los cuales todos alcanzan el mismo resultado - la interrupción de la función del ADN y la muerte celular. agentes alquilantes: dioxido de cloro Esterilizantes químicos: como el ácido paracético y el glutaraldehido. Agentes con actividad oxidante; cuya actividad se relaciona con la alquilación de componentes celulares alterando la síntesis proteica de los ácidos ADN Y ARN. Página 1 de 6  PRACTICA Nº3: ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Código: No aplica Versión: 4.0 Página: 2 de 6 Elaborado por: Dina Marcela Ricardo Caldera Shirley Salcedo Arteaga Revisado por: Catalina Tovar Acero Aprobado por: Luis Carlos Garces Paula Andrea Avilés Vergara La desinfección es un procedimiento que busca eliminar patógenos utilizando métodos químicos y físicos, aunque los más resistentes pueden sobrevivir. Se conocen tres grados de desinfección: Desinfectante de grado alto: mata patógenos microbianos, tiene una eficiencia semejante a la esterilización, pero hay algunas formas resistentes como microorganismos formadores de esporas. Ejemplos: calor húmedo, glutaraldehido, peróxido de hidrogeno, compuestos clorados entre otros. Desinfectante de grado medio: erradica microorganismos patógenos, con excepción de endosporas bacterianas. Ejemplos: alcoholes, compuestos yodados entre otros. Desinfectante de grado bajo: mata la mayoría de las bacterias en estado vegetativo y virus de tamaño intermedio y con envoltura lipídica. Ejemplos: compuestos de amonio cuaternario. Antisepsia es un procedimiento en caminado a combatir y prevenir las infecciones ocasionadas por microbios; pero este término se reserva para agente que se aplican en tejidos vivos. Los antisépticos se utilizan para reducir el número de microorganismos patógenos presentes en la superficie cutánea. Algunos de los compuestos utilizados son: alcoholes, compuestos yodados, clorhexidina entre otros. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar al momento de usarlos. Los medios de cultivo pueden clasificarse según su estado físico, composición, y al uso que se destinan: Según su estado físico Se dividen en sólidos, semisólidos y líquidos: Sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos y presentan en su composición un agente solidificante como el agar que es un polímero de azúcares, obtenido de algas marinas. En este tipo de medio se utiliza en una proporción de 1.5 a 2 % de agar. Semisólidos: presentan agar en su composición, pero a una concentración menor que el medio sólido. En este medio se utiliza 0.5% de agar. Uno de los usos de este tipo de medio es la investigación de la movilidad de las bacterias. Líquidos: también son llamados caldos, estos medios no presenta ningún agente solidificante. Página 2 de 6  PRACTICA Nº3: ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Código: No aplica Versión: 4.0 Página: 3 de 6 Elaborado por: Dina Marcela Ricardo Caldera Shirley Salcedo Arteaga Revisado por: Catalina Tovar Acero Aprobado por: Luis Carlos Garces Paula Andrea Avilés Vergara Según su composición compuestos químicos Definidos: se conocen las cantidades exactas de compuestos químicos que los conforman ya sean de tipo orgánico e inorgánico. Complejos: están compuestos de un número limitado de sustancias complejas de extractos de plantas y animales cuya composición química exacta no se conoce. Según su utilización Medios básicos o comunes: contienen sustancias nutritivas mínimas para el crecimiento de las bacterias metabólicamente no exigentes, también son la base para la preparación de otros medios. Agar nutritivo, agar base sangre, agar tripticasa. Medios enriquecidos: Se emplean para cultivar microorganismos que requieren un gran número de factores de crecimiento. Generalmente contienen extractos biológicos poco usuales como sangre, suero en polvo, extracto de cerebro de res, yema de huevo, etc. Agar sangre, agar chocolate, agar BHI. Medios selectivos: Son aquéllos que poseen uno o más componentes añadidos, los cuales inhibirán o prevendrán el crecimiento de ciertos tipos de especies de bacterias y/o promoverán el crecimiento de las especies deseadas. Uno puede ajustar las condiciones físicas de un medio de cultivo tales como el pH, la temperatura, para hacerlo selectivo para los organismos de interés. Un medio selectivo es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos. Medios diferenciales: Permiten al investigador distinguir entre diferentes tipos de bacterias con base en alguna característica observable en su patrón de crecimiento en el medio, ya sea por producción de algún pigmento o por cambios de color en el medio debido a indicadores de pH, o por halos de degradación de algún componente en el medio de cultivo. Agar SS, Mc Conkey, CLED. Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que contienen un agente que inhibe las especies no deseadas pero que favorece el crecimiento irrestricto del agente infeccioso. Caldo tetrationato, caldo selenito. Medios de transporte: son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria sin multiplicación significativa de los microorganismos desde el momento de su extracción hasta su posterior estudio. Utilizan generalmente cuando las muestras deben ser enviadas de un laboratorio a otro. Se recomienda un límite de dos horas desde la recolección de las muestras y su estudio en el laboratorio. s. Los medios de transporte más frecuentemente utilizados son los de Stuart, Amies, Carey – Blair, buffer glicerinado. Página 3 de 6  PRACTICA Nº3: ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Código: No aplica Versión: 4.0 Página: 4 de 6 Elaborado por: Dina Marcela Ricardo Caldera Shirley Salcedo Arteaga Revisado por: Catalina Tovar Acero Aprobado por: Luis Carlos Garces Paula Andrea Avilés Vergara Medios bioquímicos: son aquellos que revelan las características bioquímicas particulares de las bacterias. TSI, SIM, UREA, LIA, citrato. 3. MATERIALES Bata* Guantes* Tapabocas* Marcador de vidrio* Encendedor* Erlenmeyer Balanza Mechero de Bunsen Espátula Probeta Medios de cultivo (agar sangre, agar nutritivo, Mc Conkey) Autoclave Agua destilada Cinta indicadora Nota: Los materiales que contienen * deben ser traídos por el estudiante. 4. PROCEDIMIENTO 1. Lea cuidadosamente las indicaciones del medio asignado y siga las indicaciones de la casa comercial para la preparación. 2. Realice los cálculos para preparar 200 ml de medio de cultivo y pese la cantidad de medio necesaria para la preparación. 3. Mida el volumen del agua destilada con una probeta y agregue el medio de cultivo, mezcle bien hasta que desaparezcan los grumos. 4. Tape el Erlenmeyer con papel kraft y selle con cinta indicadora, marcar el recipiente con el nombre del medio y el número del grupo. 5. Esterilizar en autoclave según las indicaciones impresas en el producto. 6. Una vez esterilizado saque de la autoclave deje reposar y sirva de forma aséptica cerca del mechero, sirva de 15 a 20 ml en cajas de petri grandes. Página 4 de 6  PRACTICA Nº3: ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Código: No aplica Versión: 4.0 Página: 5 de 6 Elaborado por: Dina Marcela Ricardo Caldera Shirley Salcedo Arteaga Revisado por: Catalina Tovar Acero Aprobado por: Luis Carlos Garces Paula Andrea Avilés Vergara 7. Deje solidificar por 30 minutos. Control de Calidad Control de esterilización: se debe guardar en la incubadora el 4 % de los medios preparados de 5 a 7 días, con revisión diaria para evidenciar cualquier cambio. Control de calidad de crecimiento: deberá determinarse la capacidad del medio recién preparado para permitir el desarrollo de las bacterias utilizándose cepas conocidas como S. aureus (ATCC 25923), E. coli (ATCC 25922) y P. aeruginosa (ATCC 27853). 5. POSTLABORATORIO 1. ¿Qué factores se deben tener en cuenta al seleccionar un método de esterilización adecuado para diferentes tipos de instrumentos y materiales de laboratorio? caracteristicas de estos, parámetros de eficacia, duración, compatibilidad, toxicidad, penetrabilidad, resistencia a materia orgánica, adaptabilidad y monitorización, entre otros. carga biologica 2. ¿Cuáles son los equipos utilizados para la esterilización de instrumentos y medios de cultivo en el laboratorio de microbiología? 3. ¿Cuál es el propósito de la preparación de medios de cultivo en microbiología? ¿Qué componentes son esenciales en un medio de cultivo? añadir todos los componentes necesarios para permitir el desarrollo exitoso del organismo que desea ser aislado. intervienen intensidad de luz recibida, temperatura y nivel de acidez o alcalinidad del medio 4. ¿Cuáles son los indicadores de esterilidad y cómo se utilizan para verificar la efectividad de los procesos de esterilización? 5. Complete la información de la siguiente tabla: indicadore fisicos: integrados, censan temperatura, presion y tiempo Tipo de medio (Estado Composición del Medio de cultivo físico, Composición y Microorganismos medio Utilización) Indicadores Químicos: contienen sustancias que cambian de color o estado cuando se exponen a ciertas condiciones críticas del proceso de esterilización, como la INDICADORES temperatura y la humedad2. Se dividen en varias clases según la ISO 11140: 3. pregunta: BIOLOGICOS azucares sencillos, Agar Nutritivo esporas bacterianas Clase 1: Indicadores externos, como cintas testigo, que diferencian los paquetes carbono, nitrogeno altamente resistentes, procesados de los no procesados. (peptonas), tampon como las de de pH (fosfatos Geobacillus Clase 2: Indicadores de pruebas específicas, como el test de Bowie-Dick, que evalúan disódicos stearothermophilus la evacuación de aire en autoclaves de vacío. para esterilización a (Na2HPO4) o monosódicos Agar Sangre vapor y Bacillus Clase 3: Indicadores uni-parámetro, que responden a un solo parámetro crítico, como (NaH2PO4)., Na,K, atrophaeus para óxido la temperatura. de etileno3. Después Caldo BHI del proceso de Clase 4: Indicadores multi-parámetro, que validan varios parámetros críticos del (Brain Heart Infusion) esterilización, los proceso. indicadores biológicos se incuban para Clase 5: Indicadores integradores, que responden a todos los parámetros críticos del verificar si las esporas proceso. Página 5 de 6 han sido eliminadas. Si no hay crecimiento Clase 6: Indicadores emuladores, que cambian cuando el ciclo de esterilización ha bacteriano, el proceso alcanzado el 95% de sus condiciones1 de esterilización se considera exitoso2.  PRACTICA Nº3: ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Código: No aplica Versión: 4.0 Página: 6 de 6 Elaborado por: Dina Marcela Ricardo Caldera Shirley Salcedo Arteaga Revisado por: Catalina Tovar Acero Aprobado por: Luis Carlos Garces Paula Andrea Avilés Vergara Agar McConkey Agar Sabouraud Agar CLED (Cysteine Lactose Electrolyte Deficient) Agar EMB (Eosin Methylene blue Lactose) Agar cetrimida REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. López Reyes, Cecilia; escudero, Eliana. Guía de materiales de laboratorio. DuocUC (Departamento universitario obrero campesino universidad católica). Escuela de medicina. Chile. 2. Pedrique de Aulacio M, Gutiérrez S. Microbiología. Manual de métodos generales. Facultad de farmacia universidad central de Venezuela.2001. Principales componentes Indicador de pH: Es una sustancia que permite medir el pH de un medio. Peptonas: es un término químico indefinido, que describe un producto Habitualmente, se utilizan como indicador a sustancias químicas que soluble en agua, obtenido de la hidrólisis de una proteína (aa, péptidos) cambian su Proteínas: origen vegetal, leche, carne. color al cambiar el pH de la disolución. Rojo de fenol, azul de bromotimol, Extractos: púrpura Carne: (músculo libre de tendones y grasa) es base para nutrientes. de bromocresol, rojo neutro, azul de metileno para anaerobiosis. Levadura: lisis de células de levaduras es fuente de vitaminas. Agentes selectivos: Colorantes y antibióticos como cristal violeta inhibe Malta: alto contenido de carbohidratos para el cultivo de mohos y levaduras los cocos gram positivos no inhibe los beta hemolíticos, verde brillante inhibe los cocos gram positivos, sales biliares (oxgall), azida de sodio, etyl fenil alcohol. Agentes reductores (anaerobios): Producen una baja tensión de oxigeno como: acido ascórbico, tioglicolato de sodio, hidrosulfito de sodio (agar brucella), cisteina. Página 6 de 6