Labo 5: Chromosomes Polytènes et Cartographie Génétique (PDF)

Laboratoire 5 Chromosomes polytènes et cartographie génétique Dans ce labo, vous disséquerez les glandes salivaires des larves de la mouche des fruits Drosophila virilis pour observer leurs chromosomes polytènes. Il est possible d’observer directement les chromosomes polytènes sous un microscope con...

Laboratoire 5 Chromosomes polytènes et cartographie génétique Dans ce labo, vous disséquerez les glandes salivaires des larves de la mouche des fruits Drosophila virilis pour observer leurs chromosomes polytènes. Il est possible d’observer directement les chromosomes polytènes sous un microscope conventionnel car ce sont d’énormes molécules ! Chaque chromosome polytène contient plusieurs brins d'ADN partiellement déroulés. Les chromosomes polytènes forment des complexes moléculaires gigantesques ! À l’aide d’un microscope optique, vous allez prendre des photos de vos chromosomes polytènes et mesurer leur longueur. Cette information vous sera utile afin d’estimer la compaction relative de l'ADN dans les chromosomes polytènes comparativement aux chromosomes réguliers. Le port de gants jetables est obligatoire pour l’étape de la coloration de l’ADN : merci d’apporter vos gants. RÉSULTATS D'APPRENTISSAGE ATTENDUS Théorie Description et particularités de la polyténie Morphologie, nature multibrin et motif en bandes des chromosomes de polytène Cartographie génétique, localisation cytologique Expérience pratique et analyse des données Isoler les glandes salivaires des larves du 3e stade de Drosophila virilis Colorer les chromosomes à l’aide d’un colorant ayant une forte affinité pour l’ADN Observer les chromosomes polytènes colorés des cellules des glandes salivaires Prendre des images en microscopie et mesurer les chromosomes polytènes Accéder à, faire des recherches et récupérer de l’information de la base de données FlyBase ACTIVITÉS PRÉ-LABORATOIRES 1. Examinez attentivement ces deux vidéos (Vidéo 1 et vidéo 2) illustrant la technique pour disséquer les glandes salivaires des larves du 3ème stade de Drosophila virilis. Une bonne technique de dissection est essentielle pour compléter le laboratoire. 2. Consacrez une 10 à 15 minutes pour explorer le génome de Drosophila melanogaster via le site Genome Data Viewer. Le but de cet exercice est d'apprécier l’utilisation du motif des bandes des chromosomes polytènes comme marqueurs de référence pour déterminer le positionnement de gènes le long des chromosomes (cartographie génétique). Sélectionnez un chromosome de référence à afficher (case bleue # 1), puis effectuez un zoom avant et arrière (case bleue # 2) et notez la région affichée le long du chromosome sélectionné (case # 3). Notez le motif de bandes de référence du chromosome sélectionné (case # 3). INTRODUCTION Les chromosomes polytènes sont des chromosomes géants observés chez certaines mouches. Les exemples de polyténie les plus étudiés sont les chromosomes polytènes présents dans certaines cellules des stades larvaires de mouches. Les chromosomes polytènes sont initialement des chromosomes normaux qui, grâce à des cycles répétés de réplication de l’ADN sans aucune division cellulaire (un processus appelé endoréplication), deviennent des chromosomes denses et à bandes (Figure 1). Pour des raisons inconnues, les télomères (un télomère est la région terminale d’un chromosome riche en motifs répétitifs) des chromosomes ne se répliquent pas très bien. En conséquence, les télomères des différents chromosomes se regroupent dans une masse appelée le chromocentre (Figure 1). Figure 1. Chromosomes polytènes des glandes salivaires de Drosophila virilis. L’ensemble chromosomique de D. virilis se compose de cinq paires de grands chromosomes télocentriques (#1 à #5 sur la photo à gauche) et d’une paire de microchromosomes (#6 sur la photo de gauche). La photo de droite montre une disposition plus compacte des chromosomes en polytène écrasés. Photos de Genetica, 1984 (à gauche) et G. Guillet (à droite). Les chromosomes polytènes sont denses et longs car ils contiennent plusieurs brins d’ADN partiellement déroulés. Il a été estimé qu’un chromosome polytène typique de D. virilis a subi 10 cycles de réplication de l’ADN pour un total de 1024 brins identiques par chromosome. Les chromosomes polytènes sont si grands qu’ils peuvent être vus pendant l’interphase même avec un microscope optique de basse puissance. Une fonction présumée des chromosomes polytènes est de permettre des niveaux plus élevés d’expression génique et donc de permettre une croissance larvaire plus rapide. La présence dans chaque cellule de multiples copies chromosomiques permet des taux de transcription beaucoup plus élevés qu’avec seulement deux copies dans les cellules avec des chromosomes réguliers. Les chromosomes polytènes présentent un profil de bandes sombres alternant avec des bandes claires. Le contraste entre les bandes sombres et claires peut être mis en évidence en ajoutant un colorant avec une forte affinité pour l’ADN comme celui que vous utiliserez dans le présent labo. Les bandes sombres semblent plus foncées car leur ADN est plus condensé de sorte que la machinerie transcriptionnelle peut à peine y accéder. Les bandes sombres sont donc associées à des niveaux plus faibles d’expression génique ou d’activité transcriptionnelle. Les bandes claires sont élargies parce que leurs brins d’ADN sont plus lâches, et ce profil est associé à un accès facilité de la machinerie transcriptionnelle. Les gènes qui sont situés dans les bandes claires des chromosomes polytènes sont donc ceux qui sont les plus activement transcrits. L’élargissement des chromosomes au niveau des bandes claires réfère au concept de renflement chromosomique (puffing). Le motif des bandes claires et sombres est unique à chaque chromosome et à chaque espèce. Les chercheurs ont exploité le profil de bandes des chromosomes polytènes pour dessiner la cartographie à haute résolution. Le Drosophila Genome Project réfère aux chromosomes polytènes comme référence pour réaliser leur cartographie génétique. Dans le présent labo, vous étudierez les chromosomes polytènes des glandes salivaires des larves de 3e stade de Drosophila virilis. PROCÉDURES EXPÉRIMENALES Préparation de chromosomes polytènes partir des glandes salivaires de larves de Drosophila virilis Vous disséquerez des larves de 3ème stade de Drosophila virilis pour isoler leurs glandes salivaires dans un tampon salin contenant 0,7 % de NaCl. Le tampon salin est utilisé pour préserver l’homéostasie des glandes salivaires excisées. Vous aurez probablement besoin de pratique pour réussir la dissection, la coloration et l’écrasement des glandes salivaires. L’écrasement des glandes salivaires pour étaler les chromosomes est une étape particulièrement délicate. Vous devrez probablement disséquer quelques larves avant d’être compétent dans la préparation de chromosomes comme illustré à la figure 1. Dissection 1. Prenez une lame de microscope et ajoutez une goutte du tampon salin à chacune de ses deux extrémités. 2. Utilisez des pinces pour transférer une grosse larve de 3ème stade à chaque extrémité de votre lame et directement dans le tampon. Il est important de choisir des larves qui sont encore actives; utilisez les larves claires car les larves foncées sont généralement sur le point d’entrer en pupation et elles ont des taux métaboliques plus faibles et de plus petites glandes salivaires (Figure 2). Figure 2. Cycle de vie d’une mouche des fruits. Cette photo a été obtenue de Biotope One. 3. Saisissez (1) l’extrémité buccale avec une paire de pinces et (2) le corps environ au tiers inférieur avec l’autre paire de pinces, puis tirez sur la capsule buccale afin que les glandes salivaires soient exposées (Figure 3). Les glandes salivaires resteront généralement attachées à la région de la tête et séparées du reste du corps. Figure 3. Anatomie des larves du 3ème stade de Drosophila sp. Cette figure a été adaptée de Anatomy Charts. 4. Séparez les glandes salivaires de tous les organes encombrants tel que l’intestin, si toujours en place. Il sera plus facile de manipuler les glandes, qui sont petites et translucides, si vous les laissez attachées à l’armature buccale. Il n’est pas nécessaire d’enlever les corps lipidiques adhérents car leur enlèvement implique le risque d’endommager les glandes (Figure 4, photo du centre). Si vous avez une dextérité fine, vous pourriez préparer des glandes salivaires « propres » (Figure 4, photo de droite). Figure 4. Diagramme (gauche) et photos de microscopie d’une préparation satisfaisante (au centre) et optimale (droite) des glandes salivaires. Au centre, les glandes salivaires sont toujours attachées à la capsule buccale, mais cela n’aura aucun impact sur la coloration de l’ADN et des chromosomes. Les images en microscopie sont de G. Guillet. 5. Utilisez un mouchoir de papier (Kimwipe) pour éliminer délicatement l’excès de solution saline entourant vos glandes salivaires disséquées. Veillez à ne pas toucher les glandes avec le mouchoir car il serait quasi impossible de les récupérer. Puis, procédez à la coloration de vos chromosomes polytènes. Coloration Le colorant d’ADN, l'acéto-orcéine, a une toxicité relativement faible, mais la fiche MSDS précise que des lunettes de sécurité et des gants jetables doivent être portés pour éviter tout contact avec la peau et les yeux. En cas de contact accidentel de la peau ou des yeux avec l'acéto-orcéine, il faut rincer abondamment la zone exposée avec de l'eau pendant 15 à 20 minutes. Cette procédure de lavage suite à une exposition accidentelle est nécessaire pour minimiser le risque de pénétration cutanée de l'acéto-orcéine pour atteindre, lier et éventuellement altérer l'ADN. Le port de gants jetables est donc obligatoire pour l’étape de coloration. Si vous n'avez pas de gants, effectuez une autre étape pendant que vos coéquipiers gantés complètent la procédure de coloration. 1. Ajoutez une goutte de la solution d’acéto-orcéine directement sur les glandes salivaires et laissez incuber au maximum une minute. Si vous incubez plus longtemps, un fond rose-rouge foncé sera visible en raison de la spécificité limitée du colorant pour l’ADN. 2. Utilisez un mouchoir pour éliminer l’excès de tampon et de colorant, puis ajoutez une goutte de la solution saline. 3. Répétez le rinçage (étape 2) pour enlever autant que possible l’excès de colorant. 4. Placez votre lame sur un nouveau mouchoir et ajoutez une lamelle sur vos glandes salivaires, puis utilisez le mouchoir pour absorber l’excès de colorant à la périphérie de la lamelle. Prenez une photo de vos glandes salivaires colorées à 40X, 100X et 400X. Organisez vos trois images de microscopie afin qu’elles puissent apparaître côte à côte sur la même rangée et utilisez une seule légende. Sur votre image à 400X, utilisez Lumenera Analyze pour mesurer le diamètre d’une cellule typique et de son noyau pour (1) les corps lipidiques gras et (2) les glandes salivaires. Reportez-vous à vos images de microscopie pour discuter de la spécificité relative de l’acéto-orcéine pour la coloration de l’ADN. Figure 5. Chromosomes polytènes des larves de 3ème stade de Drosophila virilis préparés avec un tampon salin (NaCl de 0,7%) et l’acéto-orcéine (grossissement 400X). L’organe montré en rose est une glande salivaire avec des noyaux intacts et sphériques contenant des chromosomes polytènes. Un coussinet de corps lipidiques est visible sous la glande avec des noyaux généralement plus petits et à plus pâles. Les cellules lipidiques peuvent être facilement distinguées en raison de leur accumulation de petites gouttelettes lipidiques qui ont tendance à devenir gris foncé à cause de l’oxydation en présence de l’oxygène présent dans l’air ambiant. Image de G. Guillet. Quelle est la ploïdie de vos chromosomes polytènes? Justifiez votre réponse. Rapport de compaction de l’ADN dans les chromosomes polytènes Copiez votre « meilleure » image de microscopie de vos chromosomes polytènes à 400X. Reportez-vous à votre image pour estimer la longueur d’un chromosome polytène représentatif. Gardez à l’esprit que votre image illustre une masse de chromosomes attachés au chromocentre. Estimez la compaction relative de l’ADN dans vos chromosomes polytènes étalés en comparant son rapport de compaction à la référence de 2x104 paires de bases/nm pour un chromosome humain en interphase (cette référence a été estimée à partir des résultats publiés dans Am..J Hum. Genet., 2002). Pour estimer ce rapport, vous devrez d’abord établir la longueur moyenne des chromosomes (nombre de paires de bases d’ADN) chez Drosophila virilis. Cette information peut être obtenue en référant à la base de données Genome Data Viewer de Drosophila melanogaster pour calculer la longueur moyenne de ses chromosomes - on peut raisonnablement supposer que les deux espèces « sœurs » de mouches des fruits des chromosomes de tailles comparables. Vous pouvez ensuite estimer le rapport entre les paires de bases d’ADN/nm dans votre préparation de chromosomes polytènes en divisant le nombre moyen de paires de bases par chromosome par la longueur chromosomique linéaire mesurée à la question précédente. Enfin, comparez la valeur du rapport de votre préparation de chromosomes polytènes à celle des chromosomes humains en interphase pour déduire la compaction relative de l’ADN dans les chromosomes polytènes des glandes salivaires de D. virilis. Pouvez-vous maintenant expliquer pourquoi on peut observer directement les chromosomes polytènes sous un microscope optique conventionnel ? Insérez tous vos détails de calcul et expliquez votre raisonnement. Cytogénétique et cartographie génétique Les généticiens organisent l’information contenue dans un chromosome à l’aide de cartes chromosomiques appelées des idéogrammes. Ces derniers identifient les emplacements des différents loci tels que les gènes ou les anomalies chromosomiques. Les idéogrammes sont généralement couplés à des bases de données de référence telles que le projet du génome humain. Les critères de la nomenclature des idéogrammes a été définie par le International System for Cytogenetic Nomenclature (ISCN) pour le génome humain (Nature Education). Ces critères sont : Les chromosomes se voient attribuer un bras long et un bras court, en fonction de la position de leurs centromères. Le bras le plus court du chromosome est appelé p pour petit, et le bras le plus long est nommé q pour queue qui signifie une file d’attente. Les régions chromosomiques présentes sur le bras court commencent par la désignation p, tandis que les régions du bras long commencent par q. Chaque bras du chromosome est ensuite divisé en régions, et les nombres attribués à chaque région augmentent selon l’éloignement du centromère. Des régions de référence sont identifiées en fonction des caractéristiques morphologiques telle la présence des bandes sombres ou claires observées lors de l’ajout d’un colorant standard. Les régions sont nommées p1, p2, etc., sur le bras court et q1, q2, etc., sur le bras long. Selon la résolution de la procédure de coloration, il peut être possible de détecter des bandes supplémentaires dans chaque région, qui sont désignées en ajoutant un autre chiffre au nombre de la région. Les idéogrammes des drosophiles publiés dans FlyBase ne suivent pas les règles de nomenclature de l’ISCN et sont plutôt basés sur des éléments arbitraires initialement définis par Muller. Les idéogrammes dans FlyBase sont basés sur les éléments de Muller en raison de la valeur historique de ceux-ci pour la comparaison des cartes de liaison génétique de différentes espèces de Drosophila dans le but d’étudier le processus de spéciation. La nomenclature FlyBase est particulièrement pertinente pour le présent laboratoire car elle est basée sur les patterns des bandes claires et foncées dans les chromosomes polytènes. Dans FlyBase, les chromosomes des mouches drosophiles sont désignés en fonction de trois critères de niveaux de taille décroissante : D ou la division (numérotée 1 à 102 pour l’ensemble du génome) S ou la sous-division (généralement de A à D, bien que A à F soit utilisé chez certaines espèces) B ou le numéro de bande (1 à n, selon la subdivision particulière). La capture d’écran suivante illustre une partie de l’idéogramme pour le chromosome X de D. virilis. Accédez à FlyBase et, dans la barre de menu supérieure, sélectionnez Tools, puis Genomic Tools et Chromosome maps. À partir du menu déroulant pour l’espèce, choisissez D. virilis, puis sélectionnez un des éléments de Muller de la liste du menu adjacent. Copiez/collez la partie d’un chromosome de D. virilis de votre choix. Sur votre écran, encerclez en rouge une courte région d’intérêt et notez son emplacement cytologique ou ses coordonnéesen fonction du système D, S, B. Accédez à la page d’accueil de la FlyBase et sélectionner Tools, puis Genomic Tools et Cyto Search. Dans le menu déroulant, sélectionnez Cytological Location et écrivez vos coordonnées choisies pour récupérer les loci correspondants. Avant de soumettre votre requête, utilisez les options de filtre à gauche pour affiner votre recherche aux gènes dont la séquence a été cartographiée. Soumettez votre recherche et copiez/collez votre liste de gènes retournés (seuls les codes de gènes sont affichés). Si votre recherche ne donne aucun résultat, répétez la recherche de vos coordonnées, mais en incluant toutes les options du filtre de recherche (gènes et aberrations). Vous avez identifié les loci génétiques correspondant à un emplacement cytologique dans l’exercice précédent, mais le processus inverse d’identification de l’emplacement cytogénétique pour un locus d’intérêt est également possible. Accédez à l’outil de conversion FlyBase converter tool pour convertir les identificateurs de code génique en identifiants équivalents dans FlyBase. Vous pouvez simplement taper le nom d’une enzyme pour récupérer son code de gène FlyBase (la capture d’écran ci-dessous illustre l’information pour la requête « hexokinase ». Cette étape peut s'avérer fastidieuse compte tenu des contraintes internes de la base de codes ; vous devriez réussir à identifier un code de locus valide en utilisant des métabolites courants tels que « acetate », « glucose » ou « melatonin ». Accédez à nouveau à FlyBase et sélectionnez Tools, puis Genomic Tools et Cyto Search, mais utilisez le menu déroulant pour sélectionner FlyBase Gene ID#. Saisissez votre code FlyBase pour votre gène d’intérêt puis soumettez votre requête. Insérez une capture d’écran montrant l’information affichée. Quel est l’emplacement cytologique de votre gène d’intérêt? Quelle est la longueur de ce gène en nombre de paires de bases ?