Introduction aux Antibiotiques - Microbiologie - PDF

Microbiologie Introduction aux antibiotiques : Modes d’actions, mécanismes de tolérance et de résistance : I- Introduction : Un antibiotique est une molécule inhibant la croissance bactérienne à très faible concentration. Il faut que ce soit spéc...

Microbiologie Introduction aux antibiotiques : Modes d’actions, mécanismes de tolérance et de résistance : I- Introduction : Un antibiotique est une molécule inhibant la croissance bactérienne à très faible concentration. Il faut que ce soit spécifique (=à faible concentration la molécule doit inhiber la croissance bactérienne) Les antibiotiques ont été développer dans les années 1940. Ils sont quasiment tous d’origine naturel (très peu sont synthétiques ou d’origine humaine) : la nature est la mine d’or. Les sources d’antibiotiques : - 36 % des champignons - 64 % d’origine bactérienne. Parmi les bactéries, le genre streptomyces est le premier antibiotique utilisé (origine naturel) Pourquoi des bactéries produisent des antibiotiques ??? Elle sont développé cela comme des armes pour coloniser le milieu et se débarrasser des compétiteurs Les sulfamides sont les premiers antibiotiques utilisés (d’origine synthétique). Les fluoroquinolones dérivé de l’acide nalixidique est le deuxième antibiotique le plus utilisés dans le monde On peut combiner des antibiotiques synthétique avec des antibiotiques naturels : c’est l’hémisynthèse. On part d’un produit naturel qu’on modifie par la chimie de synthèse. L’hémisynthèse permet : - échapper la résistance bactérienne, - LEVER LA TOXICITÉ, - améliorer la bio- disponibilité (transformé un composé non absorbable par un composé absorbable) Les cibles des antibiotiques : Les antibiotiques ciblent en grande majorité une ou plusieurs enzymes bactériennes dont l’activité est essentielle. Elles ciblent les étapes majeures de la synthèse. Les antibiotiques ciblent : - mécanise de l’ADN : Les fluoroquinolones agissent sur le mécanisme de l’ADN - transcription - traduction - ribosomes - synthèse de l’acide folique (une vitamine) : Nous on ne peut pas la synthétiser car c’est une vitamine.Pourtant les pathogène ont cette voie : si on inhibe cette voie de synthèse cela va être spécifique du pathogène car on ne l’aura pas nous (pas d’effet secondaire). - inhibition de la synthèse de la paroi ❕ ❕ Chaque ois qu’on utilise un antibiotique il y a apparition de la résistance. Le seul facteur variable est le temps d’apparition de la résistance. Pour la vancomycine on a du attendre plusieurs 10aine d’années pour que la résistance apparaisse. La résistance est systématique. 700 000 morts sont dû à la résistance aux antibiotiques. On estime qu’en 2050 on aura 10 millions de morts attribuables à la résistance (plus que le cancer….) et aura un coût énorme sur le PIB (100 milliards de milliards de dollars). II- Mode d’action des antibiotiques : On distingue deux types d’antibiotiques : - les antibiotiques bactériostatiques : arrêtent la croissance et la multiplication des bactéries mais ne les tuent pas (le système immunitaire peut prendre en charge la charge bactérienne) - antibiotiques bactéricides : tuent les bactéries → Mesure de l’activité antibactérienne (sur exemple d’un antibiotique bactéricide) : La concentration minimale inhibitrice : CMI C’est la plus faible concentration d’antibiotique qui inhibe la multiplication bactérienne en 24 heures (pour E.coli, pour beaucoup de pathogènes à croissance rapide, ou le temps de croissance habituel en général) La concentration minimale bactéricide : CMB C’est la la plus faible concentration d’antibiotique qui tue 99,99 % d’une population bactérienne en 24 heures (pour E. coli ou le temps de croissance habituel en général) Pour mesurer l’activité bactérienne, on fait un antibiogramme avec des disques. On a culture du pathogène qu’on met sur un milieu gélosé (on l’inonde) et on remarque que l’antibiotique diffuse et empêche la croissance de la bactérie. Donc plus le diamètre est important et plus l’antibiotique est actif. Plus le diamètre de l’antibiogramme est important plus la CMI est basse : il faut peu d’antibiotique pour inhiber la croissance (et donc plus la souche est sensible). Plus le diamètre est faible et plus la souche est résistant. A l’hôpital on utilise des automates (puis validation avec un œil humain). On peut déterminer la CMI en culture liquide : la plus faible con On a une culture bactérienne et on va inoculer la même chose partout. Dans les tubes on va rajouter des concentrations croissantes d’antibiotiques. On intube et on attend 1j. On va regarder la plus faible concentration de l’antibiotique qui empêche une croissance en 18- 24h : on regarde le tube où on a pas de croissance pour trouver la CMI (ici 1 ug/uL). On prend le tube ou on a dit que c’était la CMI : on compte le nombre de bactérie restant dans le tube. CIM = 16 bactérie ne pousse pas on compte le nombre de bactérie restante On regarde les cellules mortes Si on tue 4log, on a la CMB avec 32c car on en a plus La CMB est toujours supérieur ou égale à la CMI. III- Deux exemple d’antibiotiques et mécanismes de résistances associés : A- La pénicilline : Les bêta- lactamines ont révolutionné la santé humaine (pénicilline) A.Flemming découvre la pénicilline. La pénicilline on un effet spectaculaire sur la mortalité des infections pulmonaires. Les pénicilline appartiennent à la famille des bêta- lactamines : fonction amide en position bêta. → Structure chimique des bêta- lactamines : La pénicilline agit sur la synthèse du polymère majeure de la paroi bactérienne : le peptidoglycane. → La synthèse du peptidoglycane est la cible des bêta- lactamines : fonctions et structure du polymère majeur de la paroi des bactéries : - molécule inique de 10⁶ daltons - résistance à la pression osmotique - forme de la bactérie : allongée - division cellulaire par fission binaire On a des chaînes de glycanes reliés entre elles par des souches peptidiques. C’est un disaccharides. Le peptidoglycane possède une structure partiellement conservée. Il contient deux sucres : N- acétylglucosamine et N- acétylmuramique On a deux sucres et une alternance de résidus d’acide aminé en configuration L et D. Ceux trouvés dans la nature sont du L. En effet, les protéases digère des protéines avec des résidus en configuration L : en altérant entre L et D, le peptidoglycane ne pourra pas être digérer par les protéases. On peut avoir des variations dans la chaîne latérale. En revanche, l’extrémité D- Ala- D- Ala est conservé et ne change pas, elle est non variable ❕ → Polymérisation des précurseurs peptidoglycane : La synthèse des précurseurs du peptidoglycane commence dans le cytoplasme de la bactérie. On a un sucre (UDP- GlcNac= uridine diphosphate N- acétylglucosamine) et les résidus vont s’associer pour former la chaîne peptidique. Ce substrat sera associer à un transporteur lipidique et sera flipper vers la face externe de la membrane. Deux activités enzymatique permettent la biosynthèse : - les glycosyltransférase : font les liaisons osidique et allonge la chaîne de glycane - les D- D transpeptidases (ou protéines de liaisons à la pénicilline PLP) : associe les chaînes de glycane en formant des liaisons peptidiques entre deux tiges peptidiques. → La paroi des bactéries : Le peptidoglycane est une macromolécule qui englobe les bactéries, leur donne leur forme, et permet de résister à la pression osmotique du cytoplasme. Dans le cytoplasme la pression osmotique est forte : sans protection, la bactérie éclate. Si on utilise des antibiotiques inhibant le peptidoglycane : bactérie explose. Le peptidoglycane c’est des chaînes glycanes reliés par des chaînes peptidiques. La sous unités contient du N- acétylmuramique et N- acétylglucosamine. Les acides aminés L et D : permet de résister aux protéases grâce aux liaisons amides et peptidiques de configuration L et D. Il y a des variations/décorations en fonction des bactéries mais la terminaison D- Ala 4 et D- Ala 5 est très conservée. → Polymérisation des précurseurs du peptidoglycane : La synthèse des précurseurs du peptidoglycane débute dans le cytoplasme. Cela commence à partir d’UDP- N- acetlymuramique et les acides vont être attaché un par un sur cet UDP. Cet UDP va être associé à un transporteur lipidique membranaire et enfin le deuxième sucre (UDG N acétyl glucosamine) va être ajoute. On forme l’UDP- murnac- pentapeptide associe à un transporteur lipidique membranaire et le deuxième sucre est ajoute. Une fois qu’on a le précurseur complet : translocation sur la face externe de la membrane par une flipase. Deux activités majeurs ont lieu : - activité glycosyl transférase catalysant l’élongation des chaînes glycanes : une chaîne glycane préexistante et les enzymes ajoute des glycanes sur cette chaîne et l’allonge. - il faut associer les chaînes glycanes entre elles : ce sont les enzymes D,D transpeptidases (Protéines de liaisons à la pénicilline ou PLP) Ces enzymes font une liaison peptidique (L lys3 → D ala4, liaison de type 4- 3) entre une tige peptidique d’une glycane et l’autre tige peptidique d’une autre glycane. Précurseur dans le cytoplasme et deux activités des enzymes dans le périplasme. → Les protéines de liaison à la pénicilline: cibles des β- lactamines : On a tout d’abord le substrat des protéines de liaisons à la pénicilline (tige glycane pentapeptique). Les PLP sont des protéines à sérines actives : c’est un nucléophile. La PLP attaque la liaisons D- Ala 4 et D- Ala 5 et forme un adduit ester. Quand elle attaque cette liaisons, la D ala 5 est hydrolysé et éjecté. L’ester est attaque par l’accepteur (second substrat) : l’amine libre du 3ème résidu de l’accepteur attaque l’ester (l’adduit) donnant une liaison peptidique (liaison amide). On a bien réticulé les deux chaînes de glycanes. L’enzyme libre est relargué et est à nouveau disponible pour un nouveau cycle catalytique complet. La liaison D- Ala 4 et D- Ala 5 est très conservé dans le monde bactérien. Les bêta lactamines sont des analogues structuraux de la terminaison D- Ala 4 et D- Ala 5 des précurseurs du peptidoglycane. Les PLP (enzyme) se lie au bêta lactamine et l’enzyme deviendra inactif. La PLP attaque la bêta lactamine comme si c’était son précurseurs formant un adduit covalent : la réaction s’arrête et on a une impasse et l’enzyme est inactivé. En général un inhibiteur avec une enzyme est non covalent : diluer l’inhibiteur permet d’avoir une enzyme sous forme libre. Ici ce n’est pas le cas, : ce n’est pas réversible. Avec les bêta lactamine l’affinité n’a pas d’importance car l’enzyme va être inactivé. Les bêta lactamines sont des substrats suicides de la terminaison D- Ala 4 et D- Ala 5 des précurseurs du peptidoglycane. Comment les bactéries deviennent résistantes aux antibiotiques ? On a 3 modes : → l’imperméabilité et l’efflux : - imperméabilité : la bactérie ne peut pas entrer dans la cellule (modifications des porines empêchant le passage). - L’efflux correspond à des ponts : « expirateurs » qui éjecte la molécule toxique → inactivation de l’antibiotique par une enzyme : une enzyme est dédié à la destruction de l’antibiotique. Elle le coupe en deux ou ajoute un groupement empêchant l’action de l’antibiotique. → Modification/substitution de la cible : - modification : on a notre cible. Cette cible loge l’antibiotique. Si on modifie la cible, l’antibiotique ne peut pas rentrer. C’est une diminution de l’affinité. - substitution de la cible : on a une réaction enzymatique essentiel à la survie de la bactérie.En générale cette réaction est effectué par une enzyme ciblé/apparenté par l’antibiotique. La bactérie recrute une autre enzyme non apparenté à la précédente qui ne sera pas inhibé (non apparente) par l’antibiotique. → Si la bactérie produit une enzyme cible de l’antibiotique à un niveau basale : tue la bactérie. Si on surproduit la cible : on a plus de cible que de l’antibiotique et seul une partie restant est inhibe par l’antibiotique. Si on surexprime la cible : cela permet d’être résistant car on a + de cible que d’antibiotique. → Si on réduit le nombre de cibles : conséquences sur le phénotype de la bactérie ? La bactérie sera plus sensible à l’antibiotique. Bêta lactamase permettent de résister aux antibiotique : inactivation de l’antibiotique. → Les β- lactamases hydrolysent les β- lactamines et permettent la résistance : La β- lactamases est une eznyme sérine active qui hydrolyse les β- lactamine les rendant inactive. Cela rappelle le mécanisme de la PLP et au lieu d’avoir une impasse on a une H20 Les β- lactamases ont évolué suite à la pression de sélection des antibiotiques, des PLP (dérive des PLP) - Turnover d’une β- lactamase: 5000 sec- 1 - En 1 seconde, 5000 moles d’antibiotique sont inactivés par 1 mole d’enzyme - Parmi les enzymes les plus rapides au monde - Très répandues - Enjeu sanitaire mondial Le seul facteur limitant est la rencontre avec l’antibiotique. COMMENT AVOIR DE LA RÉSISTANCE : → On a une bactérie qui produit des β- lactamases : on prend un inhibiteur qui va permettre d’inhiber l’enzyme et produire les β- lactamines. C’est le cas de l’augmentin : Clavulanate (inhibe la β- lactamase) + Amoxicilline (inhibe les cibles (PLP)). → Pression de sélection - > mutations, fréquence élevée Ex: cible (perte d’affinité), activation (efflux) et/ou modification des porines : - on a des mutations sélectionné par la présence de l’enzyme. - On a des substitutions. - GyrB est une gyrase qui est la cible des fluoroquinolones. C’est une modification de la cible sélectionné sous la pression de sélection des antibiotiques. - Modifications dans le génome avec perte d’affinité pour l’enzyme. - Pompe d’efflux : toujours présente mais à niveau de production bas → mutation dans son promoteur qui permet d’activer fortement cette pompe. - mutations des porines pour empêcher l’antibiotique de rentrer.C → Transfert de gènes : comment les β- lactamases sont transmises : c’est la conjugaison. On a un plasmide avec des gènes de résistances qui est conjugatif, transmissible à une réceptrice. Ainsi la sensible devient résistance Transmission de pathogène en pathogène après conjugaison. Transfert d’un gène de résistance d’une autre espèce grâce aux plasmides conjugatifs dans beaucoup de cas un seul gène est suffisant (ex beta- lactamase) pour devenir résistant, mais pas toujours…. B- La Vancomycine : - La vancomycine est un mécanisme de résistance. - La vancomycine a une longévité accrue. Elle a été découvert dans l’âge d’or de la découverte des antibiotique, en 1956. On a envoyé des scientifiques pour récolter des échantillons de sols. Streptomyces orientalis isolé produit la vancomycine (=Actif contre les bactéries à Gram positif car les gram négatif ont deux membrane et la vancomycine est trop grosse pour franchir la membrane externe supplémentaire des gram négatif). Mode d’action de la vancomycine : cible la biosynthèse du peptidoglycane La terminaison D- Ala 4 et D- Ala 5 est conservé chez les bactéries. La vancomycine se fixe sur l’extrémité D- Ala4- D- Ala5 des précurseurs du peptidoglycane provoquant une gène stérique empêchant la polymérisation des précurseurs et inhibe l’activité glycosyltransférase et transpeptidases. On regarde l’interaction entre la vancomycine et les précurseurs du peptidoglycane. On a ici en rouge une liaison hydrogène : Changer D- Ala par D- Lactate empêche la formation de la liaison hydrogène en rouge, il y a Perte d’affinité. Pour devenir résistance les bactéries ont développer ce stratagème. L’enzyme VanH produit du D- lactaate à partir du pyruvate. Van A forle le depsipeptide D- Ala D- Lac à partir du D- Lac. Normalement une enzyme introduit les précurseurs naturelle (rouge et bleu). Cette enzyme est permissive et peut incorporer le D- Ala D- lac Les précurseurs D- Ala D- lac sont incorporés dans la voie de biosynthèse : la vancomycine ne peut plus se fixer et la machinerie de polymérisation peut reprendre Pour effectuer cela, il nous faut les enzymes Van H et Van A : on ne peut pas obtenir par mutations spontanées (pas deux enzymes obtenues par mutations) La vancomycine est actif chez les gram + en particulier chez Streptomycètes. Chez les bactéries résistances on trouve le transposons suivant contenant les deux enzymes nécessaire pour que la souche devienne résistante à la vancomycine. La bactérie qui produit la vancomycine si elle n’a pas de mécanisme de défense s’auto- intoxique. La bactérie qui produit la vancomycine doit avoir ces gènes de résistances A cote des gènes de biosynthèse de la vancomycine on a les gènes de résistance Van A et Van H Le transposon des souches résistances entérocoques (dans les intestins) était initialement dans le chromosome mais a sauté sur un plasmide conjugatif hautement mobilisable contient les gènes de résistance transmis à une fréquence élevé. → Streptomyces est une bactérie à Gram positif appartenant à l’ordre des actinomycètes et c’est dans le sol qu’on trouve les producteurs de streptomyces. Comme les entérocoques ont récupéré les gènes du sol ? L’élevage permet d’avoir des bovins, qui vont émettre des entérocoques via dans les fèces des vaches (les entérocoques vivent dans les commensaux de la vache). Ses fèces vont se retrouve dans le sol. Un transfert de gènes de résistance (échanges génétiques) va ainsi avoir lieu. En effet, dans le sol on aura ainsi sur l’herbe entérocoques et streptomyces. La vache va se nourrir de l’herbe et donc ingérera entérocoques et streptomyces : la vache possède déjà les entérocoques mais va récupérer les streptomyces. Dans la bouse de vache on a des entérocoques favorisant le contact avec les bactéries du sol qui héberge les gènes de résistance via les streptomyces qui vont s’échanger avec le sol. Si on donne de la vancomycine a la vache : les vaches grossissent et on a un moyen de détecter les souches résistances. On peut sélectionner l’événement entre entérocoques et streptomyces. La vache en mangeant l’herbe (streptomyces) ou y avait ses fèces va récupérer ses entérocoques. L’éleveur va être malade a force d’être avec la vache et récupérer ses entérocoques. L’éleveur sous vancomycine est malade : éleveur aime sa vache donc les commensaux des vaches vont aller chez l’homme ce qui va faire qu’il va avoir de la vancomycine favorisant les échanges entre homme et vache. L’hypothèse expliqué ici est non vérifié. → Transfert des gènes de résistance est la voie principale d’apparition des souches résistantes : La transduction : moyen d’échange de gène de résistance entre espèce et permettre l’apparition de souche de résistance par l’introduction d’un plasmide. Le phage introduit un gène de résistance à la bactérie réceptrice. → Phénomène de résistance aux antibiotiques : Sélectionner la résistance : on applique un antibiotique tue les sensibles et permettant d’avoir les résistants. On retire l’antibiotique et les nouvelles populations sont résistantes. Résistance aux ATB par mutations: - Notion de fréquence: Il faut une base modifiée dans le génome pour conférer la résistance - Le génome fait environ 4 Méga bases - Je dois donc partir d’un population >= à 1 x 10^6 bactéries pour sélectionner le mutant résistant - Si j’ai besoin de deux mutations, de quelle population dois- je partir? 10^12 - Ce mutant pré- existe dans la population, l’antibiotique n’agit pas comme agent mutagène - L’antibiotique agit ici comme un sélecteur Ce n’est pas l’antibiotique qui favorise la résistance, il sélectionne les résistants. → Persistantes – les bactéries qui s’endorment : On a une population génétiquement homogène sensible. Dans cette population on a des dormeurs à métabolisme ralentit : l’antibiotique n’agit pas sur les dormantes et tue les autres. Quand l’antibiotique est retiré, le dormeur se réveille et redonne la population initiale génétiquement homogène avec que des sensibles : c’est une persistance phénotypique, avec une récurrence des infections. La persistance amène à la résistance DES ANTIBIOTIQUES.