immunologie-2.pdf

lOMoARcPSD|41706184 Immunologie 2 Immunologie (Artesis Plantijn Hogeschool Antwerpen) Scannen om te openen op Studocu Studocu wordt niet gesponsord of ondersteund door een hogeschool of universiteit...

lOMoARcPSD|41706184 Immunologie 2 Immunologie (Artesis Plantijn Hogeschool Antwerpen) Scannen om te openen op Studocu Studocu wordt niet gesponsord of ondersteund door een hogeschool of universiteit Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Immunologie 2 3 niveaus van verdediging: 1) Barrieres: fysisch, biologisch,biochemisch 2) Niet specifiek= aangeboren verweer 3) Specifiek verweer= verworven verweer Het niet specifieke verweer= aangeboren bevat 2 luiken: het cellulair en het humoraal (opgeloste stoffen) luik. Ongeacht het karakter van de indringer reageer je hetzelfde, een molecule van het niet specifiek verweer is ferritine. Het specifieke verweer=verworven is het 3e front De reactie is antigeen specifiek en blijft niet beperkt tot de infecte alleen, ook in bloed en lymfe. Na contact (=sensibilisatie), ga je bij een secundaire respons feller reageren Ook een cellulair en humoraal luik. Een molecule is een Antilichaam als voorbeeld. Selectieve herkenning: -vaccinatie -productie antiserum in dieren -immuundiagnotistiek: met een AL een antigen zoeken of omgekeerd. Vergelijking: Niet-specifiek Specifiek Bestaande, aangeboren componenten Verworven Snelle respons: min. Respons: dagen Niet-specifiek: zelfde moleculen voor hele reeks Zeer specifiek: pathogenen cellen zijn genetisch geprogrammeerd om te Algemene receptoren: reageren op één antigeen ‘pattern-recognition’ moleculen AG herkennende moleculen Geen geheugen Geheugen Weinig afwijkingen Frequent afwijkingen: auto-immuniteit, immuundeficiëntie  Cellen van immuunsysteem WBC worden ondergedeeld in een lymfoide en myeloide lijn. Bij een ontsteking is er een lokale opstapeling WBC. T en B lymfocyten en plasmacellen maken deel uit van het specifiek verweer. Eosinofielen,basofielenen, monocyten neutrofielen van het niet specifiek verweer Macrofagen, dentritische cellen en NK cellen komen in beide voor Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184  Cellulaire mechanisme Fagocytose (extracellulair pathogeen)door: -macrofagen -B-lymfocyten -neutrofielen -dendritische cellen Macropincocytose door dendritische cellen Cytotosche effecten(intracellulaire pathogeen) -apoptose (afbraak tot vesikels die opgeruimd worden) -cellyse (explosie van de cel)  beide leiden tot celdood maar een ander mechanisme  Eiwitten van het niet-specifiek verweer -acute fase eiwitten -complementfactoren -interferonen -transferrine -lyzozyme en andere lytische enzymen  lichaam maakt beschermingseiwitten  Ontstekingseiwitten of acute fase eiwitten De acute fase respons -> vroege stadium ontsteking wanneer er gefagocyteerd wordt. Deze cellen zetten dan cytokinen vrij (TNF, IL6 EN IL1), deze komen vrij in de bloedbaan en gaan naar de lever waar acute fase eiwitten gemaakt worden. Hier is CRP= C-reactief eiwit een voorbeeld van. Deze reageert tegen C-polysachariden. Verhoogde CRP waarden wijst op een bacteriële infectie (handig voor onderscheid virale/bacteriële infectie) WERKING VAN HET AANGEBOREN= NIET SPECIFIEKE VERWEER  Fagocytose De meest bekende verdediger van het niet specifiek verweer= macrofaag Deze voelen de aanwezigheid van bacteriën door receptoren op hun opp Deze receptoren herkennen moleculen van een pathogeen Bij contact maakt het een fagosoom, deze wordt opgenomen en fuseert met een lysosoom. Een lysosoom bevat enzymen die de bacterie vernietigen (zeer sterk dus vrij in vesikel en niet in macrofaag want anders macrofaag ook vernietigd) 1) Aanhechting microbe aan fagocyt 2) Opname in cel 3) Vorming fagosoom 4) Fusie met lysosoom= fagolysosoom 5) Degistie van de microbe door enzymen 6) Vorming restpartikel met onverteerbaar materiaal 7) Vrijstelling van deze afval Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184  De ontstekingsreactie De ontstekingsreactie versterkt fagocytose met behulp van acute fase eiwitten. Vb: -CRP -MBL: mannose bindend lectine -complement Ontstekingsreactie= opstappeling vloeistoffen en cellen op de plaats van infectie. Dendrietische cellen en macrofagen wachten tot er iets gebeurd, bij een wondje wordt er gefagocyteerd en worden er cytokines vrijgesteld die via de bloedbaan naar de lever gaan Acute fase eiwitten worden daar gemaakt Cytokines trekken WBC aan en deze weten de weg door de cytokines gradiënt =chemotaxis Opstapeling cellen en vloeistoffen= onsteking met pijn,roodheid,zwelling,koorts HET COMPLEMENT  Wat? Maakt deel uit van het niet specifiek verweer Ondersteunt werking AL Werking volgens watervalsystem (activatie) Complementeiwitten= plasmaeiwitten, sommige met enzymactiviteit 1) Klassieke activatie/MBL activatie C1 C4 C2 C3 C5 C6 C7 C8 C9 A= kleine molecule (vrij in plasma) B= grote molecule (vast aan membraan) 2) Alternatieve activatie Combi C3 en grote letters A= kleine molecule(terug vrij in plasma) B= grote molecule (vast aan membraan)  3 activatiewegen van het complement 1) Klassieke: C1 bindt met antigeen-antilichaam complex 2) MBL: lectine bindt aan opp pathogeen 3) Alternatieve: C3 bindt met opp pathogeen In alle 3: C3 convertase is het centrale enzym  knipt C3 (hier convergeren alle pathways) Klassieke pathway: C1 complex (C1q +2 keer C1r en 2 molecule C1s) bind aan een antigeen-antilichaam complex (antigeen opp van een pathogeen) C4 wordt gekliefd door C1’s waarna het covalent bindt op het bacterie-oppervlak. (= C4 bindt C2) C1’s klieven de C2 -> vorming C4bC2b-complex= C3 convertase Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Mannose bindende lectine pathway: Start bij de binding van het mannose bindend lectine complex en de serine proteasen op een reeks mannose groepen op een bacterie-opp MASP2 werkt hetzelfde als C1 tot vorming van C4bC2b complex MASP1 kloeft C3 rechtstreeks Alternatieve pathway: C3b altijd in serum aanwezig (lage hoeveelheid) bindt op hydrocylgroepen op het opp en wordt geactiveerd door C3 klieving. C3b bindt factor B (homoloog C2) samen vormen ze het C3bB complex Factor D klieft factor B Ontstaan C3bBb = C3 convertasse (gestabiliseert door properdine) Zie ook cursus Gemeenschappelijk: C3 convertase klieft C3’s tot C3b, die covalent binden in de buurt van een complement-activering Sommige C3b’s binden C4b en C3b in de klassieke en alternatieve pathway waarbij C5-convertase gevormd wordt C3b dient als acceptorplek voor C5, dat gekliefd wordt C5a= anafylatoxine =aantreikkin WBC C5b= inhibeert vorming membraan aanvallend complex C5b complex met C6 C7 C8 en veel C9’s tot een porie -> MAC= membraan aanvallend complex= cel lyseert Functie complement? 1) Opsonisatie van mo (fagocytose): C3b  Complementreceptoren op een macrofaag kunnen reageren met C3b en mbv C5a gaan fagocyteren 2) Chemotaxis: C3a en C5a = anafylatoxines 3) Lysis van alle cellen : MAC (C9) GASTHEERCELLEN beschermt tegen lysis door inhibitoren. Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Niet-specifieke afweer: Het verworven immuunsysteem= specifiek De verworven immuunrespons:  Creëren van veel B en T-lymfocyten voor antigeen en cel-gemedieerde immuniteit 1) Antigeen gemedieerde immuniteit B-lymfocyten,plasmacellen en antilichamen Humorale immuniteit= AL circuleren in bloed 2) Cel-gemedieerde immuniteit T-lymfocyte, antigeen presterende cellen en MHC cellen Cellulaire immuniteit Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Antigeen gemedieerde immuniteit (humoraal) = gericht tegen extracellulaire micro-organismen en toxines Bevat B-lymfocyten die zich differentiëren in plasmacellen die AL produceren Deze B-lymfocyten dienen als antigeen presenterende cellen De indeleing van AL (=immuunglobinen) Cel-gemedieerde immuniteit = gericht tegen intracellulaire micro-organismen T-lymfocyten differentieëren in effectorcellen na antigeenpresentatie Deze hebben fucntionele types: -helper (CD4 cellen) -cytotoxische (CD8 cellen) -regulatorische cellen (CD4 en CD8 tregs)  Dendrietische en macrofagen wachten op indringer in NS, niet voldoende? Start specifiek verweer Antigenen = zorgen voor ontstaan AL = molecule dat de productie stimuleert en bindt aan een AL 1) Hapteen= klein antigeen molecule dat een AL kan binden maar geen verworven immuunsrespons kan uitlokken 2) Immunogeen= antigeen dat een AL kan binden en wel een verworven immuunrespons kan uitlokken  Goede immunogenen hebben MW > 10000 Een antigeen wordt herkent door het immuunsysteem en een immunogeen lokt een postieve immuunrespons uit. Hapteen: Meestal niet biologisch Hapteen + carrieer (immunogeen) -> immuunrespons Deze respons wordt opgewekt tegen het hapteen+ de epitopen van de immunogeen. = polyklonale antilichamen, elk AL is gericht tegen een ander epitoop van het hapteen-drager complex Vb: geneesmiddelen (penicilline), ontlasting van dieren Allergeen: Een antigeen waar we een hypergevoelige reactie op krijgen Door contact,inhalatie,injectie,… dit is erfelijk. igE Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Vaccins: Een vorm van actieve immunisatie Langdurig effect, beschermt tegen re-infectie,… Soorten vaccins: 1) Levend: toediening van levende organismen die in staat zijn te infecteren en repliceren 2) Verzwakte vaccins: gebasseerd op een leven vaccin maar hun virulentie daalt. 3) Gedode vaccins: dode organismen of geïnactiveerde toxines= toxoïden Deze kunnen niet infecteren en repliceren maar wel een immuunrespons op gang brengen 4) Deelvaccins: geisolleerd uit gelyseerde organismen Men gebruikt deze als dode vaccins zelf te veel schade zouden toedienen door de mogelijkheid van levende organismen in het preparaat 5) Recombinant vaccin a) De genetische code van het mo waar je bescherming tegen wilt krijgen in een levend organisme gebracht, dit eiwit wordt tot expressie gebraacht en dat moet je nog opzuiveren b) Een genetisch gemodificeerd virus inbrengen in cultuur zodat je een grote hoevelheid krijgt wat kan gebruikt worden als vaccin. 6) Synthetische oligopeptiden: Als het epitoop dat een immuunrespons opwekt geïntificeerd is kan men het overeenkomstige peptide maken. Dit peptide is het vaccin. 7) DNA vaccins: Naakt DNA als vaccin op plasmide en onder hoge snelheid in lichaam -> niet bij mensen -> kan genen in/uitschakelen Adjuvans: Een bacteriële component die de effectiviteit van een vaccin verhoogt Het bacterieël materiaal trekt fagocyten aan en versnelt de activering en Ag presentatie aan T-cellen voor het ontwikkelen van een immuunrespons. MHC= majeure histocompatibiliteit complex= HLA Genen liggen op korte arm van chromosoom 6 Deze zijn belangrijk nij tranplantaties : HLA matching eerst doen MHC1 en 2 belangrijk bij immuuncapaciteit MHC1 - Heeft glycoporteïnen op celoppervlak - Vindbaar op opp van elke gekernde cel - Geen dimeer - Associatie met een B2-microglobuline - 3 loci: A,B,C >15000 allelen - Min3 max6 MHC op 1 cel MHC2: - Heeft glycoproteïnen op celoppervlak - Komt voor op: dendrietische cellen, macrofagen en geactiveerde B-cellen Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 - Heterodimmer (DP,DQ of DR) - Min3 max12 HLA2 eiwitten op 1 cel - B-keten is membraangebonden maar nier covalent - > 5000 allelen Antigeen presterende cellen: macrofagen, DN en monocyten Presentatie van antigeneenfragmebten aan T-lymfocten Presentatie via MHC1: endogeen antigeen Presentatie via MHC2: exogeen antigeen DENDRIETISCHE CEL EN MACROFAAG KUNNEN MHC1 EN 2!!!!! Antigeen presentatie: a) Klasse 1 moleculen presenteren endogene antigenen: (op eigen kracht binnen of van binnen uit) -proteasoom breekt AG af in peptide fragmenten -deze fragmenten worden opgenomen in het RER -MHC1 antigen aanwezig zodat er een vesikeln ontstaat MHC1 eiwit + peptide op buitrenkant cel via golgi b) Klasse 2 molecullen presenteren een exogeen AG (binnen gefagocyteerd): Het MCH2 eiwit zit in ER met een invariant chain (tijdelijke blokkering van de bindingsgleuf zodat er geen eiwitten van de endogene pathway kunnen binden) MHC Eiwit via golgi naar boven en invariant chain verwijderd Het gedegradeerde antigen bindt en wachten op een T-cel Het specifiek verweer= verworven: antilichamen Antilichaam= immuunglobulinen= deel van gamma globuline (elektroforese) Een antilichaam herkent een epitoop op een antigeen Synthese + secretie door plasmacellen (= terminaal gedifferentieerde B-cellen) De binding antilichaam en antigeen is niet covalent! Antilichamen behoren tot de serumglobinen en door hun werking in de immuunrespons -> immunoglobinen Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Structuur immunoglobinen: cursus 1e jaar: Humaan Ig: 4 polypeptiden, omwille van het moleculair gewicht spreekt men over: 2 identieke lichte ketens: gecodeerd door een V, J en C gen 2 identieke zware ketens: gecodeerd door een V, D, J en C gen Zware en lichte ketens zijn aan elkaar verbonden met S-S bruggen (disulfide bruggen) (in rood) NH terminus: 1 lichte en 1 zware keten  epitoop bindingsplaats De zware en lichte ketens bestaan uit domeinen*. Sommige hebben een variabele tot hypervariabele aminozuursamenstelling, andere hebben een meer constante samenstelling. Men spreekt over VH: variabel domein in zware keten (H = heavy) CL: constant domein in de lichte keten (L = light) In de zware keten heeft men meerdere constante domeinen met een verschillende functie. Men nummert ze dan: CH1, CH2, CH3 en CH4. Niet alle klassen hebben een vierde constant gebied. Immuunglobulinen bevatten ook suikerresidu’s op de constante gebieden van de zware ketens. *Een eiwitdomein = een apart deel van een eiwitsequentie en –structuur die apart evolueert en functioneert. Elk domein heeft een compacte 3D structuur die meestal onafhankelijk is Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 opgevouwen. De meeste eiwitten bestaan uit verschillende structurele domeinen. Eén bepaald domein kan voorkomen in verschillende evolutionair gerelateerde eiwitten. Domeinen zijn dikwijls functionele eenheden, vb. een calciumbindend domein. VERDERE UITLEG ZIE CURSUS 1E OF 2E JAAR TOT P16 Isotype= bepaalt klasse en subklasse van H keten en type en subtype van L keten.  Isotypische determinanten= antigene determinanten die een immuunrepsons uitlokken  Anti-isotypische antilichamen= de antilichamen ertegen AL tegen variabele delen zijn zeldzaam want er zijn slechts enkele kopijen en dit is niet voldoende om een immuunrespons uit te lokken Allotype= kleine verschillen in de AZ-sequentie op de H of L keten tss individuen. Dit is een gevolg van verschillende allelen van een zelfde gen. Idiotype= verschil in de hypervariabele regio’s, dit deel staat in voor de Ag herkenning. Allelische exclusie: Overerving van een zware en een lichte keten. Maternaal of paternaal, niet beide, B-cel schakelt andere uit B-cel brengt slecht 1 zware en 1 lichte keten tot expressie. De meeste T-cellen hebben een aB-TCR Andere hebben een gammedelta TCR -> deze cellen zitten op een plaats waar mo ons lichaam binnenkomen. Deze hebben geen CD4 en CD8 Co-receptor Deze cellen herkennen ook het antigeen zonder MHC eiwitten (gepresenteerd), ze herkennen intacte eiwitten en peptiden op pathogenen of abnormale cellen. Isotype switch: Ongesstimuleerde B-cellen (produceren) hebben igM en igD op hun opp Stimulatie van een B-cel -> isotype wijzigt maar geen epitoop specificiteit DOEL: gericht tegen hetzelfde antigen maar verschillende immuunrespons Primaire respons= igM Iedere B-cel produceert een ig met specifiteit voor 1 epitoop Ongeactiveerde B-cel -> geactiveerd door contact Ag -> isotype switch -> genomlegging -> andere c- keten afgeschreven B-cel wordt geheugencel, bij 2e contact kan er nog een switch gebeuren -> veel AL met andere immuunrespons (zie fcties ig’s) IgM = gemaakt door kortlevende plasmacel igG = door langlevende plasmacel Somatische hypermutatie: =immuunsysteem past zich aan aan een nieuw antigeen Puntmutaties (dna b-cel wijzigt) na herhaalde bloostelling aan epitoop in Vh en Vl Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Door deze mutaties -> verhoogde affiniteit Affiniteit maturatie = cellen gaan sneller delen na binding met het antigeen Antigeen-antilichaaminteractie: 4 krachten: -h bruggen -vdw -elektrostatische interactie -hydrofobe interactie Affiniteit vs aviditeit en paratoop vs idiotoop Affiniteit= bindingssterkte tussen AL en Ag (1 stuk) -> monovalent antigeen Aviditeit= totale bindingsterkte tussen AL en multivalente antigenen (niet gelijk aan som want stijgt exponentieel met het aantal bindingsplaatsen) Paratoop= hypervariabel polypeptide gedeelte van het AL, eigen aan de plaats waar het epitoop bindt. Affiniteit bepaalt specificiteit Idiotoop= hypervariabel polypeptide gedeelte van het AL, aanwezig op lichte en zware keten Idiotopen maken het AL uniek. Uniek AL= idiotype Werking AL 1) Opsonisatie: afdekken Ag met AL voor betere fagocytose (vlag)  igG’s merken het mo  verschillende Fc receptoren op macrofagen voor de verschillende AL isotypes  FcgammaR op macrofagen voor het cte deel van igG  RcepsilonR op mestcellen, specifiek vvoor het cte deel van igE  Combinatie van Fc-receptoren en complement = beter opsonisatie 2) Neutralisatie van bacteriele toxines Exotoxines vs endotoxines  Toxines of infecteuze partikels worden geblokeerd -> niet meer in andere cellen 3) Kolonisatieresistentie= verhindering hechting bacterie aan epitheel 4) Activering complement  igG en igM spelen een rol bij klassieke pathway/ activatie 5) Agglutinatie  Hierdoor = minder gemakkelijke spreiding mo in lichaam  igM (igA) belangrijke rol 6) Binding aan cilieen en flagellen van mo -> minder beweging mo 7) igE = verweer tegen hogere parasieten -> vochtuitstoot 8) interferentie metabole processen mo 9) ADCC= antilichaam gemedieerde cellulaire cytotoxiciteit  Fc receptoren op NK’s herkennen AL op geinfecteerde cellen of tumorcellen= granulen vrij die celmembraan beschadigen  Fc receptoren op eosinofielen Deze herkennen igE’s op parasieten, weer granulen vrij. ADCC is niet fagocytose!! Bij ADCC is het target te groot voor fagocytose! Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 SPECIFIEK VERWEER:WERKING Het immuunsysteem: Werkt via het lymfatisch stelsel, dit stelsel is belangrijk voor cardiovasculair stelsel en het immuunsysteem Lymfestelsel is vertakt netwerk van: 1) Lymfevaten: lymfevocht terugsturen naar bloedbaan 2) Lymfeknopen  Zuiveren van infectueze agentia en kankercellen  Overwoekeling door cellen: knobbel  Mogelijke kankerhaarden: ook knobbel maar niet pijnlijk = verdere verspreiding 3) Lymfoide organen  Milt, tymus, amandelen, MALT = mucosa-associated lymfatic tissue Primaire organen: T-cellen rijpen inde thymus door tymosine (hormoon) B-cellen rijpen in de bursa van Fabricius(vogel), mens in het beenmerg  Beenmerg Onstaan B en T cellen B cellen rijpen hier -> ontwikkeling BCR door DNA omleggingen Educatie van B-cellen: psotieve en negatieve selectie = vermijden van zelfdestructie= ontwikkelen van zelftolerantie, 5% slaagt. Na incompetent worden -> cellen naar lymfeknopen waar contact antigeen kan gebeuren. Incompetent= in staat om immuunrespons uit te lokken na contact Ag, cellen zijn dat al voor het contact, info hiervoor ligt in de genen. Dus we hebben afweercellen die nooit gebruikt worden.  Tymus Rijping van T-cellen, onwtikkeling TCR door DNA omlegging en educatie: positieve en negatieve selectie Secundaire weefsels/organen= contact tss verschillende cellen:  Cellualire interacties= specifiek verweer!!!! Contact tss cellen! Hier gebeurt ook filtratie van vreemde cellen, dode cellen en eiwitaggregaten  Bloed en lymfevaten: transport cellen  Milt= grootste lymfoid orgaan, veel leukocyten en plasmacellen -> secrete ig in bloedstroom  Lymfeknopen= opstapeling leukocyten, filters lymfevocht  Mixing lymfocyten, monocyten en DC = initatie van immuunrespons Lymfocyten: Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184  B-lymfocyten: B-cellen Rijping in beenmerg Humorale immuniteit BCR receptor  T-lymfocyten Rijping in thymis Cellulaire immuniteit TCR  NK-cellen Celullaire respons Geen TCR of BCR KIR en KAR via Fc receptor -> ADCC Dus cellulaire repspons via T cellen en NK cellen! T-cellen en de cellulaire respons: T-cellen binden GEEN vrije antigenen (B-cel wel)  Herkenning via gepresenteerde antigenen op macrofaag/ dendrietische cel  Deze antigeenpresterende cellen: nemen Ag op + verwerken = tonen van brokstkken Ag via hun MHC eiwitten  Endogene via klasse 1 en exogene via klasse 2 1) Endogeen Ag + MHC1 -> CD8+ cellen 2) Exogeen Ag+ MHC2 -> CD4+ cellen DUS: DUBBELE HERKENNING: a) T cel receptor herkent Ag b) CD4 en CD8 herkennen het MHC eiwit  Bij deze interactie: monokines een rol Monokines: vrijgezet door macrofagen Lymfokines: vrijgezet door T-lymfocyten -> rol bij differntiatie tot effectorcellen Zie figuur p.9 Specialisatie T-cellen: T-cellen kunnen zich specialiseren: 1) En ontwikkelen cytotoxische activiteit: Tc cellen= cytotoxische cellen= CD8+ Geactiveerd door dendrietische cellen -> prolifereren tot CTLs = cytotoxische T lymfocyten CTLs binden op virusgeinfecteerde cellen en kankercellen -> interactie: productie toxische eiwitten (= perforines en granzymes)  cel lysseert of apoptose 2) Manager immuunsysteem: helper cellen= Th cellen= CD4+ a) Th1: zorgen voor cel-gemedieerde immuniteit (intracellulaire patogenen)= stimmulatie Tc- cellen b) Th2: deze helpen de B-cellen of plasmacel te worden( AL-gemedieerde immuniteit) (extracelullaire pathogenen) 3) Regulatorische T cellen: controle over Th cellen 4) T-geheugencellen: een antigen specifieke T-cel die na de primaire respons gemaakt wordt, bij 2e contact terug actief. Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 a) Th – geheugencel b) Tc-geheugencel  Geheugencellen prolifereren en differentieren sneller dan naïeve T-cellen = snellere reactie! T cel receptoren: De meeste circulerende T cellen:  Alfa beta receptor (meestal)  Gamme delta receptor: buitenbeentje: geen MHC eiwitten nodig voor herkenning Ag (idem als PPRs= binden Ag die voorkomen op hele reeks pathogenen= deze liganden kunnen oplosbaar als celgebonden zijn.) Als ze geactiveerd zijn proliferen en differentieren -> Th en Tc cel (,net zoals alfa beta vorm) maar sneller en in kleinere aantzzallen De keuze tussen de 2 heterodimeren : vroege ontwikkeling stadium Binden geen oplosbare epitopen!!! De T cel receptor wordt gestabilliseerd door CD4 (Th cel) en CD8 (Tc cel) De t cel recptor zit in het membraan van een T cel CD3 complex= intracellulaire signaaltransductie Immunoglobuline supperfamilie: = immunoglobine gerelateerde moleculen C en V gelijkende domeinen (CD4 en CD8 hebben een V domein dat niet variabel is!) Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 T-helper cellen: Interactie TCR en MHC2 -> primaire signaal via CD3 naar kern (TCR op T cel) In werkelijkheid: meerdere TCR’s gegroepeerd doordat ze dezelfde Ag herkennen. Initiele ontmoeting T cel en Ag= priming= dit bepaald de verdere immuunrespons Geprimede CD4+ cellen worden Th cellen= T helper cellen Helper cellen= herkennen peptide gebonden MHC 2 complexen  Th cellen sleutelrol in bepalen immuunrespons= keuze cellulair of humoraal (Th1 of 2) a) Bepalen de epitopen waartegen immuunrespons ontwikkeld wordt b) Bepalen soort immuunrespons c) Noodzakelijk voor normale B-cel functie Cytotoxische T-cellen: Tc cel geactiveerd tot CTLs door een dendrietische cel die antigeen presenteert in MHC1 De rol van Th cel in Tc avtivering is productie Il2 -> proliferatie Tc-cellen Zie figuur p16 Perforines -> lysis granzymes -> apoptose Activering T-helper cel: B en T cellen zijn gevaarlijke wapens, dus ze moeten geactiveerd worden door 2 sleutels: 1) Herkenning overeenkomstig antigeen 2) Niet-specifiek signaal Celluaire repsons: natural killer cellen: NK-cellen scannen cellen op MHC1 moleculen. Sommige virussen zorgen ervoor dat expressie MHc aan buitenkant daalt-> minder interactie met KIR dus NK cel krijgt singaal -> cel vernietigen (NK-cel heeft blaasjes met perforines en granzymes NK cellen actief tot dat S-immuunsysteem in werking treedt en er CD8 cytotoxische cellen worden geproduceerd dien celdoding overneemt. B-cellen en de humorale respons: Activatie na antigeen binding= klonaal geselecteerd Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Klonale selectie: Niet rijpe cellen= immuuncompetente cellen-> geen Ag tegengekomen. Ag dat ze binden -> genetisch bepaald. Het Ag selecteert de B-cel met de perfecte receptor = activatie B-cel Een kloon is een identieke cel afkomstig van 1 voorlopercel. Klonale selectie= primaire humorale respons  Meeste nakomelingen bij klonering zijn plasmacellen= eiwitfabriek= specifiek immuunoglobulinen aangemaakt (productie 4/5 dagen dan afsterven) Afstammelingen van een B-cel die geen plasmacellen worden -> geheugencellen -> snellere en hevigere 2e respons Ook T-cellen klonale selectie!! Bij vaccinatie -> proberen geheugencellen te activeren zodat je levenslang immuun bent Plasmacellen en geheugencellen: = terminaal gedifferentieerde B-cel Produceren grote hoeveelheid Ig’s -> niet meer op membraanoppervlak Plasmacel is groter dan B-cel B-cel activering: Zie foto andere blz B-cel getriggerd als ze Ag passend tegenkomen -> opname + afbraak in fragmenten -> Ag gepresenteerd op opp met MHC klasse 2 eiwitten Deze combi trekt Th cellen aan die de combinatie van het epitoop en klasse 2 moleculen herkennen. (B en T cel herkennen niet noodzakelijk hetzelfde epitoop) Hierdoor gaat B-cel differentieren en prolifereren Exaam!!!! Zie fuguur p24 + foto andere bladzijde Ook hier 2 sleutels voor activering: 1) Groepering BCR’s en hun geassocieerde signaalmolecullen 2) Co-stimulatie door CD40L op het Th celoppervlak dat bindt op de CD40 van de B-cel Deze cellen vormen de groep van langlevende plasmacellen (1a2m) -> isotype swoitch ondergaan dus igG Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 T-cel onafhankelijke B-cel activering: Voor herkenning van niet-eiwit Ag Geen co-stimulatie nodig door CD40L B-cellen moeten niet wachten op Th cel dus snellere respons!= front linie verdediging Deze cellen ondergaan geen isotype swicht dus igM en vormen geen B-geheugencellen, deze groep vormen de kort levende plasmacellen (4a5 dagen) Vergelijking beide: Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Ontmoetingen in lymfoïde weefsels: Maagdelijke lymfocyten van primaire lymfoïde weefsels (beenlmerg en thymus)  naar secundaire lymfoïde weefsels (milt en lymfeknopen) APC’s ook afgeleid va, beenmerg stamcellen. Deze APC’s komen weefssels binnen -> Ag oppikken -> transport naar lymfoïde weefsels om te presenteren aan T en B-cellen De APC’s: 1) DC: belangrijkste want kunnen immuunrespons initiëren door maagdelijke T-cellen te activeren. = wachtsoldaten Bij invasie -> geactiveerd door cytokines -> naar lymfeknopen -> Ag preseneten aan T-cellen Leven niet lang en deel van NS verweer en zijn brug tussen S en NS verweer Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 2) Macrofagen: ook wachtsoldaten maar migreren niet Funtie: ervaren T-cellen( al gestimuleerd door DC) telkens opnieuw activeren Ervaren B-cellen kan ook APC zijn. Belangrijk bij 2 e aanval -> snel S verweer opkrikken -> kleine hoeveelheid Ag presenteren aan Th cellen. Dus enkel nuttig als er al geactiveerde Th cellen zijn. Immuuundiversiteit: - Door diversiteit van de Ag -> diversiteit van de Ag receptoren - Diversiteit BCR en TCR - Genetische omleggingen DNA en RNA niveau Inversie Junctionale diversiteit= toevoegen van extra nucleotiden aan het einde van een exon door tdt: terminaal deoxynucleotidyk transferase= leesraamverschuiving Wegknippen nulcleotiden op het uiteinde Locus zware keten op chromosoom 14 In elke B-cel, op de chromosomen (14) die coderen voor de zware keten van een immuunglobuline bevinden zich verschillende kopijen van 4 types segmeten. V= variabel segment:40 D= diversity segment:25 J= joining segment:6 C= constant segment Elk kopij per soort veschilt lichtjes van een andere, en door de zoveel verschillende kan een B-cel willekeurig van elke soort 1 nemen en aan elkaar zetten= diversiteit Op de manier: 10000000 AL -> niet genoeg!! -> basen toevoegen en verwijderen aan het einde van elk exon door tdt Elke B-cel en zijn klonale afstammelingen produceren 1 ig met 1 specificiteit = GEBEURD VOOR BLOOTSTELLING AAN AG!! Overzicht: Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Specifiek verweer: bescherming tegen infecties  Afweer tegen bacteriën 1) Niet-invasieve bacteriën= ziek door toxines 2) Invasieve extracellulaire bacteriën: humorale respons, opgegeten door macrofagen 3) Invasieve intracellulaire bacteriën = moeilijkst te bestrijden!!= opgenomen door macrofaag maar blijven daar leven/groeien  NIET-INVASIEVE BACTERIËN Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 = ziek door exotoxines OPL: AL bestrijden deze bacteriën! IgG inactiveert deze toxines Als ons lichaam met AL niet volstaat? -> kant en klare AL= anitsera toedienen sIgA belet het aanhechten door: 1) hechting aan ciliën of 2) vermijd binnendringen  EXTRACELLULAIRE INVASIEVE-BACTERIËN NS: - Directe aanval door macrofaag of dendrietische cel - Binding complementfactoren S: - AL bindt op opp-eiwitten van bacterie= opsonisatie - Binding sIgA - Activering ccomplement door Ag-AL binding -> klassieke pathway -> MAC als resultaat - neutralisatie  INTRACELLULAIRE INVASIEVE-BACTERIËN = opgenomen door macrofaag maar resistent tegen afbraak( AL kan er niet aan) 1) MO in endosoom DTH cel stuurt bioactieve moleculen naar macrofaag vb: zuurstofradicalen, proteolyse enzymen,… + NK-cel stuurt IFN-gamma dat de macrofaag activeert 2) MO in cytoplasma De deadly kiss Macrofaag en MHC1+ Tc (met CD8 en TCR) = vrijstelling perforines en granzymes  Afweer tegen VIRUSSEN 1) Rechtstreeks virus aanvallen 2) Doden van geinfecteerde cellen= deadly kiss Zie figuur voor de volgende nummers: (exaam uitleggen en vb cellen en moleculen NS en S) 1) De gastheercel brengt virale eiwitten naar het oppervlak, deze eiwitten herkent door AL= activatie klassieke pathway complement 2) Neutralisatie van de spikes voor de hechting 3) NK-cellen kunnen killen door KIR en KAR’s OFFFFF ADCC 4) NK-cellen zetten IFN-gamma vrij = activering macrofaag 5) Deadly kiss 6) Macrofagen fagocyteren vrij virus, eventueel na opsonisatie door AL Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184  Werking interferon NS alfa en beta = antivirale afweer  Afweer tegen PARASIETEN Parasieten vermijden ons afweersysteem door: immuunsupressie, intracellulaire groei en antigene aanpassing Bestrijding: 1) AL: als parasiet in vrij bloed zit 2) Cellulair: tegen intracellulaire parasieten= deadly kiss 3) igE: tegen parasitaire wormen  Ag stimuleert vorming igE -> worm Ag bindt met igE die binden op mestcellen via IgE- receptor-> vasodilatie -> neutrofielen en eosinofielen binnen = helpen tegen de strijd tegen wormen beddekt met igG en igE  GISTEN EN SCHIMMELS DTH-cel, zie samenvatting puntje intracellulaire invasieve bacteriën  Ontsnappingsmechanismen Virus: genetic shift en genetic drift Bacteriën en protozoa: systematische verandering van opp Ag Plasmodium: infecteren cellen zonder kern zodat er al geen deadly kiss kan gebeuren want er is egeen MHC1 dus Tc-cel kan niet aanvallen Schistosoma: bedekken zichzelf met gastheermolecullen Secreteren enzymen Vernietigen immuuncellen Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184  Genetic drift vs genetic shift Genetic drift:  Vb: aids  Opstappeling van kleine mutaties in de genen die nadelig of in hun voordeel kunne zijn, zorgen voor grote variatie  Erfelijk materiaal slaagt op hol zogezegd Genetic shift:  2 virussen komen samen= uitwisseling erfelijk materiaal  Hybride virussen= misschien virulenter en dus ook veel varianten - Ontspanningsmechanisme van intracellulaire bacterie: Veranderen pH van fagolysosoom en inhibeert fusie van endosoom en lysosoom. = verhinderen fagocytose Monoklonale antilichamen Productie monoklonale AL -> zie schema en tot pagina 11  Immuunassay’s = immuuntesten Beoordelen: -kwantitatief/ kwalitatief? -directe of indirecte bepaling? (indirect is opsporing AL) -gemerkt of niet gemerkt? Opsplitsing vanaf gemerkt: -homogeen of heterogeen? (heterogeen is in 2 fase (V-Vl) en vaak een wasfase) Opsplisting heterogeen: -competitief of niet competitief ? (competitief is competitie voor binding tss gemerkt en niet gemerkt) Opspiltsing vanaf niet competitief: -directe of indirecte detectie? Direct= gemerkt molecule bindt rechtstreeks op te meten Ag  Agglutinatie Gebruikt voor bloedbepalingen Niet gemerkt, directe bepaking, kwalitatief Varianten: 1) Latex agglutinatie test: Zorgt voor betere agglutinatie en via turbidimetrie conc bepalen Kwantitatief, directe bepaling en niet gemerkt E Log conc Ag 2) Indirecte of passieve agglutinatie Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Test voor onoplosbare Ag of lage conc detecteren Ook via turbidimetrie Direct of indirect, kwantitiatief, niet gemerkt  RIA 1) Directe RIA AL toevoegen dat gemerkt is, ogebonden AL wegwassen Kwantitatied, directe bepaling, radioactieg gemerkt aan AL, heterogeen, niet competitief, directe detectie 2) Indirecte RIA Met 2 AL, 2e AL is gemerkt en bindt op cte ddeel van 1 e AL Kwantitatief, directe bepaling, radioactief gemerkt aan AL, heterogeen, niet competitief, indirecte detectie  FIA 2e AL bevat fluorochroom Kwantitatief, directe bepaling of indirect Fluoroscent gemerkt aan AL Heterogeen Niet competitief Indirecte detectie of directe detectie  ELISA Zie tekeningen op p19 2e AL is enzym gemerkt Verschil met FIA: je moet substraat toevoegen, bij FIA licht erop Kwantitatief, direcet of indirecte bepaling, gemerkt met enzym aan AL, heterogeen, niet competitief, direct of indirecte detectie  Bij ELISA: gevoeligheid en specificiteit Gevoeligheid= de kans dat de test positief is als de patient die ziekte heeft (LLOD) Specifiteit: de kans dat de test negatief is als de patient de ziekte niet heeft Verschillende soorten ELISA: -directe of indirecte detectie -elisa met singaalamplificatie -AL of Ag ELISA: directe of indirecte bepaling -sandwich ELISA -competitieve of niet-competitieve ELISA -multiplex ELISA 1) Directe vs indirecte detectie Direct: snel, geen kruisreactie (meer AL -> meer kruisreacties) Nadelen: weinig signaalamplificatie, primair AL labelen is duur, geen flexibiliteit voor kiezen AL Indirecte: gemerkt AL kan gebruikt worden voor veel assays, gevoeligheid test is hoog want signaal wordt versterkt 2) ELISA met signaalamplificatie Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 2e AL gebruiken OF 1 avidine bindt 4 biotines: AL bindt biotine(biotine wordt geconjugeerd met een merker) Verhoogd signaal -> verhoogde gevoeligheid 3) Ag of AL ELISA Indirecte bepaling= AL- ELISA Directe bepaling= Ag-ELISA 4) Sandwich ELISA Bij sandich elisa op p27 is 3e AL toegevoegd dat gemerkt is Sandwich want Ag zit tussen 2 antilichamen 5) Niet competitieve assay HRP= horse radish peroxidase= enzym 6) Multiplex elisa Meerdere Ag en AL coaten  Protein chip= supergeminialissserde multiplex elisa = geautomatiseerd!  Ijklijn en Hook effect Bij een niet-competitieve assay: sigmoidaal stijgend verband! Het hook effect krijg je doordat er voldoende Ag aanwezig is dat vrij rond zweeft en daar binden AL op, deze worden weggewassen -> lager signaal dan verwacht -> afbuiging einde grafiek Het dyanmisch bereik tussen: LLOQ-ULOQ Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184  Competitieve assay Toevoegen van Ag + enzym aan Ag -> competitie voor binding op AL Bij een hoge concentratie Ag-> signaal Bij lage concentraties Ag -> hoger signaal! = VOORDEEL= hoge gevoeligheid Vaak gebruikt als er slechts 1 passend AL ter beschikking is. CURVE: x-as= log conc ligand= log conc wat je berekent Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 y-as= gebonden gemerkt/ totaal gemerkt ligand  Lateral flow test = een sneltest Vb: opsporen HGC Zie p35  Immunodipstick Ook een sneltest zie p36  Affiniteischromatografie 1) AL aan agarose met het Fc deel 2) AL kan met variabel deel binden aan Ag 3) Resultaat is een zuiver Ag= opzuivering eiwit = preparatieve test  Immuunprecipitatie 1) Mengsel Ag toevoegen 2) AL herkent specifiek Ag 3) Proteine A of G wordt toegevoegd -> bacteriël eiwit met affiniteit voor AL 4) Centrifugeren= bereiding Ag uit mengsel, daarna nog SDS page Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 = preparatieve test!  Immuunfluorescentie in cellen Fluurochroom gemerkt AL-> detectie van epitopen op cellen en weefsels Je zoekt Ag en dat is zichtbaar doordat AL bindt! Kwalitatief+ localisatie mogelijk Flow cytometrie en FACS Zie filmpjes link op powerpoint Flow= transport van cellen in een vloeistostroom Cyto= afzondderlijke cellen die men meet met behulp van een gebundelde lichtstraal Metrie= detectie van lichtsiganelen opgewekt ter hoogte van de doorgang  Toestel opbouw 1) Vloeistofgedeelte: cellen aanvoeren voor analyse (richting het optisch gedeelte via een hulpvloeistof, dit is een zoutoplossing) 2) Optisch systeem(lenzen +spiegel): produceren van lichtsignalen en deze verzamelen= PMT 3) Elektronisch systeem: licht omzetten in een elektrisch signaal Hydronamische focusering: 1) Staalinbreng 2) Hulpvloeitstof voor goede focusering Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 3) Gecentreerde celstroom 4) Laserlicht 5) Lichtverstrooing  Optisch systeem Bestaat uit PMT, meten van de lichtintensiteit Filters: LP: longpass filter vb: LP500: golflengtes groter dan 500 nm en verzwakte kortere worden doorgelaten SP500: shortpass filter: lagere golflengtes dan 500 nm worden doorgeleten  LP en SP zijn gebaseerd op hun cutoff waarde BP wordt genoemd naar het centrale punt in de filter Vb: BP460-540 of 500+-40 of 500/80  Lichtverstrooiing FSC= forward scatter = maat voor grootte van de cel= grote puls (V) is een grote cel (het licht passeert een absuration bar) SSC: zijwaarste scattering= maat voor complexiteit van de cel= korreligheid/granulen  Histogram 1D Cel teling ifv FSC of SSC Niet altijd mogelijk om verschillende celpopulaties te onderscheiden  Scatterplots 2D SSC ifv FSC Dit kan je indelen in 4 kwadranten -> hulp bij indelen van verschillende celpopulaties Klein: lymfocyten, monocyten, neutrofielen: groot Vaak gebruik van forward scatter treshold: niet geïnteresseerd in de kleine cellen en de debris, die laat je weg vallen = drempelwaarde  FACS = fluorescentie geactiveerde cel sorteerder (op basis van monoklonale AL) Principe: Verschillende cellen -> verschillende oppervlaktemoleculen-> herkenning monoklonale AL met ieder een verschillend fluorofoor Bouw FAC en flow cytometer: exaam kunnen tekenen! Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Er is nog een 3e waste opvang tube en een verbinding van alle PMT met een pc  Op basis van gemeten fluorescentie krijgt de cel een lading -> sortering in elektrisch veld en valt in buisje  Weergave van de resulaten Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 Bovenaan: scatter plots+ Bovenaan: density plot: kleur densiteit, geven evenveel info als contour plot enkel kleur Midden: contourplots : meer acurate info dan scatter plots Onderaan: histogram -> in de linkse grafiek zie je een zone met hele lage waarde die logaritmisch slecht zichtaar zijn dus dat deel lineair uitzetten en de rest logaritmisch= rechtse grafiek = LOGICLE METHODE: bi-exponentieël plot Logicle methode= verbeterde representatie van cellen met miniamle fluorescentie= opgehoopt.  Compensatie = meerdere fluoroforen worden tegelijkertijd gemeten -> correctie voor spectrale overlap Opl: voor het experiment elk staal met 1 kleur meten Bij een experiment met 3 of meer kleuren: Gebruik van ‘tandem conjugaten’ om data te genereren met drie fluoroforen met één enkele excitatie en emissie-golflengten die voldoende ver uit elkaar liggen. Excitatie van R- PE met 488 nm, via FRET wordt Alexa Fluor 700 geëxciteerd. Zie filmpje!  Gating = 1 bepaalde celpopulatie selecteren, de rest wordt genegeerd = via software  Voorbeeld: leukocyten adhesie deficiëntie Door chemotaxis gaan leukocyten naar plaats ontsteking via een receptor, als er een puntmutatie is in CD18 van de receptor dan blijven de leukocyten in de bloedbaan. Gedownload door Sandria San ([email protected])  lOMoARcPSD|41706184 CD18 is een beta-2-integrine: 4 soorten CD11a,b,c,c + CD18 CD11aCD18: aantrekken van leukocyten naar plek infectie Homozygoot: geen normale CD18, klinische symptomen, veel neutrofielen in bloed Heterozygoot: geen klinische symtomen Diagnose en behandeling: - PCR: ASA, FRLP(als puntmuatie in restrictie gebied ligt) - Flow cytometer: hetero/homo onderscheid - Met expressie van CD11a Geen behandeling enkel opsporen dragers (heterozygoten) -> stieren  Verschil FAC vs flow cytometrie FAC heeft een elektrisch veld en flow cytometrie niet! Gedownload door Sandria San ([email protected])