Hématologie (cours théorie) PDF

PHYSIOLOGIE ET EXPLORATION DE L’HEMATOPOIESE Présenté par : Pr. BENCHAREF HANAA  Plan : I. Introduction V. Régulation de l’hématopoïèse II. Les Organes hématopoïétiques VI. Exploration de l’hématopoïè...

PHYSIOLOGIE ET EXPLORATION DE L’HEMATOPOIESE Présenté par : Pr. BENCHAREF HANAA  Plan : I. Introduction V. Régulation de l’hématopoïèse II. Les Organes hématopoïétiques VI. Exploration de l’hématopoïèse 1. Les Organes hématopoïétiques primaires VII. Conclusion 2. Organes hématopoïétiques secondaires III. Siège de l’hématopoïèse IV. Compartiments cellulaires de l’hématopoïèse 1. Cellules souches hématopoïétiques 2. Progéniteurs 3. Précurseurs 4. Cellules fonctionnelles I. Introduction Les cellules du sang: Durée de vie limitée et se renouvellent en permanence - Globules rouges : 120 jours - Globules blancs : 1 à 3 jours ( ou plus ∿ selon la catégorie ) - Plaquettes : 7 jours Nécessité de les remplacer ( maintenir un nombre stable ) Hématopoïèse (héma= sang et poise= élaborer, produire) : Ensemble des mécanismes physiologiques (processus normal) qui assurent la production et le remplacement continu et régulé des cellules sanguines  Elle implique : - La prolifération, la différenciation et la maturation cellulaire - L’adaptation par rapport aux besoins de l’organisme : capacité de s’adapter aux signaux de l’organisme Production : Importante - Globules rouges (= hématies ou érythrocytes ) : 200 milliards / jour - Globules blancs (= leucocytes) : 50- 100 milliards / jour - Plaquettes (= thrombocytes): 100 milliards/ jour  L’ hématopoïèse regroupe : L’ hématopoïèse est assurée par les organes hématopoïétiques  II. Les organes hématopoïétiques Les organes hématopoïétiques primaires : - La moelle osseuse ( Foie chez l’embryon) - Le thymus Les organes hématopoïétiques secondaires : - Les ganglions - La rate - Les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses (MALT) Les organes hématopoïétiques 1. Les organes hématopoïétiques primaires : a. La moelle osseuse (MO): Tissu semi-fluide localisé au centre des os Représente environ 4,6% du poids du corps et pèse chez l’adulte 2,6kg, dans les conditions normales Localisation: - Chez le fœtus : Elle est située à l’intérieur de toutes les cavités osseuses - Chez l’adulte : dans les logettes de l’os spongieux de certaines épiphyses (fémur, humérus), dans les vertèbres, les cotes, les os plats (sternum, os iliaque) et le crane. Localisation de la MO chez l’adute  MO comporte deux parties : - MO rouge très vascularisé et très active - MO jaune constituée de tissu adipeux Jusqu’à l'âge de 5ans on trouve uniquement la MO rouge puis chez l’adulte (50% MO jaune, 50% MO rouge) Types de MO  Structure : - Cellules réticulaires fibroblastiques , fibres de réticuline , macrophages , sinusoïdes - Cellules hématopoïétiques Structure de la MO  b. Le thymus: Localisation: -Organe lymphoïde situé entre le cou et le thorax en avant de la trachée - Il augmente de taille dés la naissance. Son activité et sa taille sont maximales au cours de la puberté, avant d’involuer à l’âge adulte. Structure: - Composé de deux lobes , chaque lobe est formé de lobules entourés partiellement par de fines capsules - Atteint sa taille maximale à la puberté Fonctions : Lieu de maturation des lymphocytes T. Localisation du thymus 1. Les organes hématopoïétiques secondaires : a. Les ganglions: Localisation: Ce sont des structures réniformes groupées le long du système circulatoire lymphatique, ils se regroupent en certains points stratégiques: - Les réseaux profonds : l’abdomen , le thorax, le cou - Les réseaux superficiels : inguinal , axillaire, occipital et cervical Fonctions : - Lieu de prolifération et de différenciation des cellules immunitaires Localisation des ganglions b. La rate: Localisation: Se situe dans l’hypochondre gauche en regard de la dixième cote , en position thoraco- abdominale Fonctions : - Immunitaire et hématopoïétique - Epuration sanguine : ( Elimine aussi bien les germes que les cellules vieillies ou dégénérées ) Localisation de la rate c. Les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses (MALT): Situés tout le long du tube digestif et de l’oropharynx - Cercle de Waldeyer : constitué par les amygdales, c’est le premier site d’interaction entre le tissu lymphoïde et les antigènes ingérés ou inhalés - Plaques de Peyer : amas de plusieurs follicules lymphoïdes répartis à intervalles réguliers à la partie terminale de l’iléon - Tissu lymphoïde pulmonaire : réparti tout le long de l’arbre pulmonaire Les organes hématopoïétiques  III. Siège de l’ hématopoïèse Le siège de hématopoïèse varie au cours de la vie Chez le fœtus: - Tissu conjonctif embryonnaire jusqu'au 2 éme mois - Hépatique et splénique du 2éme au 6éme mois - A partir du 6éme mois , elle est essentiellement médullaire Siège de hématopoïèse chez le foetus  Chez l’enfant: - Jusqu’à 5 ans la moelle de la totalité des cavités osseuses est une moelle rouge qui assure une hématopoïèse active Chez l’adulte: - Les os courts et plats; sternum, cotes, vertèbres, os iliaques IV. Compartiments cellulaires de l’ hématopoïèse Quatre compartiments cellulaires sont représentés : - Cellules souches totipotentes : peuvent donner naissance à toutes les cellules de l’ hématopoïèse - Progéniteurs: cellules engagées - Précurseurs: Cellules différenciées - Cellules fonctionnelles matures Le passage d’une étape cellulaire à une autre est sous l’influence de signaux ( cytokines et autres)  Différenciation : capacité sous l’influence de facteurs de croissance, de se diviser en s’engageant de façon irréversible vers une ou plusieurs lignées  Autorenouvellement: multiplication sans différenciation  1. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) : Cellule souche totipotente: origine de toutes les cellules sanguines Les CSH ont la capacité d’autorenouvellement et de différenciation Très faible représentation médullaire 0,01% à 0,05% Majorité sont au repos (phase G0) Ne sont pas identifiables morphologiquement Les techniques de morphologie de la moelle osseuse (myélogramme, biopsie ostéomédullaire) ne sont pas adaptées pour observer et quantifier les cellules souches.  Marqueur membranaire spécifique : CD34 Conservent leur propriétés après congélation dans l’azote liquide à - 196° ,puis décongélation, même de nombreux mois plus tard Usage : allogreffe ou autogreffe de CSH  2. Les progéniteurs : Cellules engagées dans la différenciation vers une ou deux lignées cellulaires ( lymphoïde et/ou myéloïd) Elles perdent progressivement leur capacité d'autorenouvellement au fur et à mesure de leur avancement dans la différenciation Faible représentation médullaire Non différenciables morphologiquement entre eux  Chaque nom de progéniteur est défini par le terme CFU (Colony Forming Unit) suivi de(s) lettre(s) qui caractérisent les lignées dont elle garde le potentiel de différenciation Les progéniteurs CFU-L possède la potentialité de différenciation vers les deux types de lymphocytes (T et B) Les progéniteurs CFU-GEMM : Granuleuse, Erythrocytaire, Macrophage et Mégacaryocytaire CFU-GEMM va poursuivre son programme de différenciation et donner naissance à des progéniteurs encore plus engagés :.CFU-GM Granulo-Macrophagique -----> P. Neutrophiles et Monocytes.CFU-G Granuleuse -----> Poly. neutrophiles.CFU-M Macrophagique -----> Monocytes.CFU-MK Mégacacaryocytaire -----> Plaquettes.CFU-Eo Eosinophile -----> Poly. éosinophiles.CFU-B Basophile -----> Poly. basophiles.BFU-E (Burst Forming Unit)Erythroïde -----> Hématies  3. Les précurseurs : Ce sont les premières cellules identifiables morphologiquement Engagées dans la différenciation vers une lignée cellulaire (GR, PNN, Plaquette …. ) Perte progressive de la capacité d’auto-renouvellement la multiplication et la maturation des cellules continue Selon les lignées, 3 à 5 mitoses entre chaque stade précurseur, de sorte qu’un précurseur immature conduit à 8 à 32 cellules matures  Les modifications morphologiques communes de maturation des précurseurs: - Diminution de la taille cellulaire (sauf lignée mégacaryocytaire) - Diminution N/C - Disparition des nucléoles - Condensation de la chromatine Les modifications spécifiques de chaque lignée au cours de la différenciation: - Lobulation du noyau (Polynucléaires) - Expulsion du noyau (Hématie) - Apparition de granulations spécifiques (P. neutrophiles et P. éosinophiles, basophiles) Les précurseurs neutrophiles au cours de la granulopoiese Les précurseurs des éosinophiles au cours de l’ éosinopoïèse Les précurseurs du GR au cours de la monocytopoièse Les monocytes migrent dans les tissus où ils vont vivre plusieurs mois après s'être transformés en histiocytes/macrophage à fonction macrophagique et immunitaire. Les précurseurs du GR au cours de l’érythropoïèse (cours GR) Les précurseurs des plaquettes au cours de la megacaryopoise  3. Les cellules fonctionnelles : L'ensemble de l'hématopoïèse a lieu dans la moelle osseuse Seules les cellules terminales, matures et fonctionnelles, vont passer dans le sang Représentées par: polynucléaires neutrophiles, éosinophiles et basophiles, hématies, plaquettes, lymphocytes et monocytes Pour la plupart de ces cellules le sang ne représente qu'un lieu de passage et de transport entre leur lieu de production (la moelle) et le lieu de leurs fonctions (les tissus) Les lymphocytes et les monocytes seront de plus capables de nouvelles différenciations après leur séjour sanguin.  V. Régulation de l’ hématopoïèse Trois éléments jouant un rôle dans la régulation de l’hématopoïèse : - Microenvironnement médullaire - Certaines vitamines et oligoéléments - Les facteurs de croissance Microenvironnement médullaire: - Le stroma médullaire (= ensemble de structures permettant le soutient de l’hématopoïèse) : formé des cellules fibroblastes, endothéliales, macrophages, épithéliales et adipocytes -Le stroma sécrètent des matrices extracellulaires et des facteurs de croissance  Les vitamines et oligoéléments: - Vitamine B12 et acide folique (synthèse d’ADN) - Fer (hémoglobine) Les facteurs de croissance: - Augmentent le nombre de cellules souches: IL 1, IL 4, IL 6 et le SCF (Stem Cell Factor) -Survie et la différenciation des cellules souches : IL 3, GM-CSF (CSF = Colony Stimulating Factor)  Les Inhibiteurs de l’hématopoïèse: - Plusieurs sont connus, surtout étudiés par leurs effets in vitro - TNF est une cytokine inhibitrice, impliquée dans l’anémie de l’état inflammatoire - IFN , TNFα, TGF β: peuvent induire une diminution des GB VI. Exploration de l’ hématopoïèse L'hémogramme : NFS -Frottis sanguin (FS)+/- Réticulocytes Myélogramme (étude cytologique) Biopsie ostéomédullaire (étude histologique) Immunophénotypage par cytométrie en flux Culture de progéniteurs hématopoïétiques Étude cytogénétique et biologie moléculaire Les explorations isotopiques  L’hémogramme : Renseigne sur une hématopoïèse physiologique normale ou non Les cellules sanguines sont en effet le reflet de l'activité médullaire et presque toutes les anomalies dans l'équilibre des lignées médullaires se traduisent par des anomalies quantitatives de la NFS Réalisé sur un prélèvement de sang veineux recueilli sur anticoagulant EDTA Examen le plus prescrit et le plus simple à condition d’une bonne interprétation Actuellement réalisé par des automates  L’hémogramme : Renseigne sur une hématopoïèse physiologique normale ou non Les cellules sanguines sont en effet le reflet de l'activité médullaire et presque toutes les anomalies dans l'équilibre des lignées médullaires se traduisent par des anomalies quantitatives de la NFS Réalisé sur un prélèvement de sang veineux recueilli sur anticoagulant EDTA Examen le plus prescrit et le plus simple à condition d’une bonne interprétation Actuellement réalisé par des automates  Myélogramme : Correspond à l’analyse cytomorphologique des cellules de la MO Prélèvement réalisé par ponction aspiration à l’aide d’un trocart Siege: sternum chez l’adulte , ou crête de l'os iliaque postérieure ou antérieure (adultes et enfants), chez le petit enfant, un site alternatif peut être la crête du tibia ; La MO aspirée peut être étalée sur lame, colorée comme un frottis sanguin et analysée au microscope Il comporte 3 étapes : appréciation de la richesse, détermination des % respectifs des cellules, étude cytomorphologique qualitative Le décompte n’inclut pas les histiocytes et les cellules du stroma médullaire (fibroblastes, adipocytes, ostéoblastes…), elles ne sont signalées que si leur nombre est anormalement augmenté Limites: il ne renseigne que très approximativement sur la véritable richesse de la moelle et ne donne aucun renseignement sur sa structure. Réalisation d’un myelogramme par ponction sternale Examen microscopique d’un myélogramme au faible et fort grossissement  Biopsie ostéomédullaire (BOM): Permet l’analyse histologique de la MO Siège de la ponction : épine iliaque postérosupérieure avec un trocart permettant de retirer un petit cylindre d’os spongieux de 2 à 3 cm de long et de 2 à 3 mm de diamètre Des coupes fines sont ensuite réalisées sur cette carotte d’os, colorées et observées au microscope Examen anatomopathologique complémentaire du myélogramme Avantages : - Définir l’architecture médullaire, - Mieux apprécier la richesse médullaire de la MO : le tissu hématopoïétique occupe 50 à 60% de la surface analysée chez un adulte normal - Mettre en évidence les anomalies de la charpente médullaire (la myélofibrose) Limites : - Apprécier moins bien la morphologie cellulaire Evaluation de la richesse médullaire par biopsie ostéomedullaire  Immunophénotypage par cytométrie en flux : Technique qui permet d’identifier les cellules en se basant sur la mise en évidence des antigènes membranaires ou cytoplasmiques spécifiques de lignée et/ou de différenciation cellulaire Permet une analyse rapide, fiable et simultanée de diverses caractéristiques cellulaires sur toutes suspensions cellulaires : prélèvements sanguins, médullaires et liquides de ponction (lombaire, ganglionnaire, pleurale, ascite). Outil majeur dans la démarche diagnostique et classification des cancers des cellules sanguine, en complément de l'analyse cytologique, notamment grâce à sa rapidité dans l’identification des sous populations leucocytaires et la détermination de leurs pourcentages Il est aussi utilisé pour le dénombrement des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ en thérapie cellulaire (greffes de CSH)  Il permet aussi le suivi des personnes infectées par le VIH/SIDA grâce à L’analyse des sous-populations de lymphocytes T basée sur l’expression de CD3, CD4 et CD8 Cette méthode consiste à ajouter des anticorps fluorescents aux échantillons cellulaires. Ces anticorps se fixent aux antigènes cellulaires, quand ils sont présents. Les cellules sont ensuite envoyés par un flux de liquide devant plusieurs lasers et détecteurs, ainsi chaque cellule est analysée individuellement Chaque cellule passant devant un faisceau laser va diffracter de la lumière ce qui permet mesure rapidement les caractéristiques de chaque cellule, telles que la taille et la granulosité, et évalue le type et la quantité de complexes antigène-anticorps fluorescents qui sont présents. Principe de marquage par cytometrie en flux Principe de mesure des caractéristiques cellulaires (FSC,SSC) par cytométrie en flux  Les appareils sont reliés à un ordinateur qui enregistre les données et affiche les résultats des mesures , sous formes de graphiques ou cytogrammes représentant l’intensité de fluorescence des cellules pour chaque paramètre. Les profils d’expressions permettent l’identification des sous-populations cellulaires d’intérêt Exemple d’un cytogramme lors d’une leucémie aigue  Culture de progéniteurs hématopoïétiques: Etude fonctionnelles du tissu hématopoïétique Réalisée à partir de sang ou de MO et utilise la capacité de maturation et de différenciation in vitro des progéniteurs en présence de facteurs de croissance hématopoïétiques Utilisée dans le cadre des greffes de CSH La recherche d’une croissance spontanée sans facteurs de croissance des progéniteurs érythroides ( dans les polyglobulies primitives), ou progéniteurs mégacaryocytaires ( dans les thrombocytémie essentielle) Recherche d’un mécanisme d’inhibition de la granulopoïèse en cas d’agranulocytose (PNN< 0,5G/L)  Etude cytogénétique et biologie moléculaire: La cytogénétique est l’étude des chromosomes, elle a pour but de détecter les anomalies chromosomiques acquises grâce à des techniques microscopiques Ces anomalies peuvent toucher: -Le nombre : plus ou moins de 46 - Ou la structure (translocations, délétions…) Les analyses sont effectuées sur : sang, moelle osseuse, ganglion, rate, liquide pleural… L’analyse comporte un caryotype conventionnel éventuellement complété par une technique de fluorescence in situ après hybridation (FISH) ciblée sur les régions d’intérêt  Cytogénétique conventionnelle : Etude des chromosomes de la cellule en métaphase, par le caryotype. Ce dernier , permet une représentation, sous forme de photographie, de l'ensemble des chromosomes d'une cellule, classés par paire et selon la taille. Il est généralement réalisé en vue de détecter d'éventuelles anomalies chromosomiques Cytogénétique moléculaire : Etude de fragments chromosomiques avec des sondes moléculaires fluorescentes FISH Génétique moléculaire : Etude de l’ADN, recherche de mutations dans des gènes, après extraction de l’ADN des cellules nucléées Caryotype d’un patient porteur de t(9,22) Principe de le technique FISH Détéction de t(9,22) par technique FISH  Cette analyse peut contribuer à la prise en charge diagnostique et/ou pronostique des malades atteints d’hémopathies malignes : Leucémies aiguës et chroniques, syndromes myéloprolifératifs, Elle est également utile dans la surveillance au cours du traitement de la maladie et la détection des rechutes  Explorations isotopiques: Ils permettent : - Soit d’étudier la répartition et la richesse globale de la moelle osseuse active (par injection d'isotopes radioactifs de Technetium ou Indium) et d'obtenir des images scintigraphiques de cette répartition - Ou bien explorer la physiologie de la lignée érythroblastique et la synthèse de l'hémoglobine par l'injection de Fer radioactif.  VII. Conclusion L’hématopoïèse est un processus complexe , encore imparfaitement compris Son déroulement s’effectue dans quatre compartiments cellulaires de la MO Schéma : CSH progéniteurs précurseurs éléments figurés matures. Plusieurs méthodes d’ explorations +++  Questions / Réponses Citer les compartiments de l’hématopoïèse Que signifie CFU ? rôle? Citer les différents organes hématopoïétiques Quelle est la différence entre la Moelle rouge et Moelle jaune ? Quelles sont les modifications morphologiques communes des précurseurs ? Quels sont les cellules précurseurs neutrophiles ? Citer les méthodes d’exploration de l’ hématopoïèse PHYSIOLOGIE ET PATHOLOGIE DES GLOBULES ROUGES Présenté par : Pr. BENCHAREF HANAA  Plan : I. Introduction VII. Méthodes d’étude des GR et de l’hémoglobine II. Origine des GR : Erythropoïèse VIII. Pathologies des GR IX. Conclusion III. Morphologie des GR IV. Structure des GR 1. La membrane 2. L’hémoglobine V. Métabolisme énergétique des GR VI. Fonctions des GR VII. Devenir des GR: Hémolyse physiologique  I. Introduction Le globule rouge (GR) ou hématie ou érythrocyte : cellule anucléée du sang (la plus nombreuse du sang) Il provient des érythroblastes de la moelle osseuse, et de la maturation finale du réticulocyte Caractéristiques: -Grande déformabilité - Très simplifiée - Dépourvue de noyaux et d’organites cytoplasmiques (Impossibilité d’effectuer toute synthèse) - Contenu principal= l’hémoglobine (Hb): pigment respiratoire  Métabolisme limité relié à la glycolyse assure la protection de l’Hb et de la membrane Lutter en permanence contre le risque d’oxydation et d’hyperhydratation Fonction principale :transporte l'oxygène des poumons vers les tissus et est responsable de la fonction de l'hématie, grâce à l’hémoglobine Sa durée de vie est d’environ 120 jours Intérêt en pathologie : Anémies +++ II. Origine des GR: Erythropoïèse Erythropoïèse est le processus physiologique qui conduit à la production continue et régulée des GR à partir d’une cellule souche pluripotente Production régulée pour maintenir une masse globulaire physiologique constante en s’adaptant aux besoins tissulaires en oxygène Chaque jour 200 milliards de GR sont produits par la MO de l’adulte sain Compenser les pertes physiologiques et l’éliminations des GR vieillis (= hémolyse physiologique ) Peut être multiplié par 7-10: situations d’hyperhémolyse et hémorragie  Compartiments des cellules souches : - Proviennent : cellule souche totipotente commune au lignées myéloïdes et lymphoïdes: CFU-S - CFU-S: va se différencier en cellules pluripotentes : CFU-GEMM ou CFU mixte Compartiments des progéniteurs : BFU-E et CFU-E sont : - Cellules engagées de façon irréversible vers l’érythropoïèse - Non morphologiquement reconnaissables - BFU-E: Progéniteurs érythroblastiques précoces (peu sensible à érythropoïétine (EPO)) - CFU-E : Progéniteurs tardifs, proches du proérythroblastes ( plus sensible à l’EPO) Processus de l’hématopoïèse Processus de l’érythroproïèse  Compartiments des cellules précurseurs : - A partir de CFU-E, la maturation des GR s’effectue en 6à 7 jours - La première cellule identifiable de la lignée érythroblastique est le proérythroblaste qui en 4 mitoses successives donnera naissance en 4 jours environ à 16 réticulocytes - l’évolution cellulaire au cours de la maturation est traduite par : Une réduction de la taille cellulaire Une réduction de la taille du noyau avec condensation intense de la chromatine Une perte progressive de la basophilie cytoplasmique Une synthèse progressive d’hémoglobine L’évolution cellulaire au cours de l’érythroproïèse - Deux phénomènes synchronisés : Synthèse d’ADN dans le noyau Synthèse protéique dans le cytoplasme - A un même stade d’évolution nucléaire correspond morphologiquement un stade de différenciation cytoplasmique - L’arret de synthèse de l’ADN survient quand la concentration en hémoglobine dans le cytoplasme est proche de 32% Compartiments des cellules précurseurs  Les éléments nécessaires à l’érythropoiese : - Protéines: 14% des protéines utilisées par l’organisme - Métaux : Fer, cuivre, cobalt, zinc - Vitamines: Vitamine B12, Folates, vitamine B6, vitamine C , vitamine B2 - Erythropoïétine - Autres cytokines : Il3,SCF,Il9,Il6,GM-CSF - Hormones: insuline, thyroïdiennes , androgènes - Erythropoïétine: Facteur de croissance principale et spécifique de l’érythropoïèse +++ Glycoprotéine sécrétée par les cellules endothéliales des capillaires des tubes proximaux Rénaux Faible production hépatique (10%) (chez le fœtus, production totalement hépatique ) Sécrétion régulée par : l’hypoxie Demi vie 4à 7H Physiologie : 10 à 20 mU/ml de sérum Anémie : jusqu’à 1 à 6 U/ml de sérum Utilisation thérapeutique+++ III. Morphologie des GR A l’état frais : - Disque biconcave - Diamètre : 7,5 - 8,3 μm - Epaisseur: 1-2 μm - Volume globulaire moyen (VGM): 80-100 fl - Surface : 140 μ2 - Tendance à se disposer en rouleaux Aspect du GR  Sur frottis / MGG: - Disque homogène - Coloré en beige rosé - Plus clair en son centre - Epaisseur plus faible au centre (1 μm) qu’au bord (2 μm) - Dénué de tout organite cytoplasmique et de noyau - Tendance à se disposer en rouleaux  IV. Structure des GR: Le globule rouge mature , ne renferme aucun organite cytoplasmique de type mitochondrie ou ribosome Il est incapable de synthétiser des lipides ou de nouvelles protéines Tous les composants nécessaires à ses fonctions et sa survie sont présents Outre sa membrane , le GR est constitué de : - Eau : 60% - Hb: 92% du poids sec - Electrolytes : K+, NA+, Ca++, Mg++, CL- - Enzymes - Glucose  1. La membrane: La membrane du GR est constituée de : 40% lipides (65% de phospholipides, 23% de cholestérol, 12% d'acides gras). 8% Glucides (constituent la partie oligo-sacharridique des glycoprotéines et des glycolipides). 52% de proteines Responsable des propriétés physiques des GR +++ Forme biconcave, plasticité et déformabilité pour GR  a. Lipides: Phospholipides : 65% - Disposition en deux couches opposées par leurs groupements hydrophobes - Répartition asymétrique Cholestérol: 23% - Exclusivement sous forme libre , intercalé entre les molécules de phospholipide Acides gras et glycolipides : 12% - Support de l’activité antigénique des groupes sanguins Disposition des lipides membranaires des GR  b. Protéines: Protéines intrinsèques , transmembranaires , représentées par : Bande 3, glycophorines Protéines extrinsèques, tapissant la face interne de la bicouche lipidique. Elles forment le squelette de la membrane érythrocytaire : spectrine , actine, protéine 4.1(facilite la liaison entre spectrine et l’actine) Protéine d’ancrage : Ankyrine (= rattacher le squelette membranaire au reste de la membrane ) Autres protéines: protéine 4.2, protéine Rh, myosine, tropomyosine, tropomoduline … C. Glucides: Forment un film à la surface externe de la membrane Structure membranaire des GR Structure membranaire des GR  Propriétés physiques: - La forme biconcave est la morphologie la plus apte à la déformabilité : les GR passent dans des capillaires de 3 μm de diamètre. - Quand le GR s'écarte de la forme biconcave, il devient fragile, moins souple, ne circule plus dans les petits capillaires et s'hémolyse - La charge négative de la membrane permet d'éviter l'agglutination des hématies - La membrane permet l'entrée du glucose dans le GR par diffusion passive - Une pompe ATP ase Na+K+ dépendante assure le transport actif des cations et maintient la composition du globule rouge en cation  2. L’hémoglobine: Pigment coloré des GR Fonction principale : transport d’O2 Plusieurs hémoglobines humaines Structure : tétramère constitué de 4 sous unités identiques 2 à 2 Chaque unité comporte : - Une partie protéique, la Globine - Un groupement prosthétique , l’hème Structure de l’hémoglobine  a. L’hème: Une ferro-protoporphyrine de type IX (tétrapyrolique centré par un atome de fer) Quatre noyaux pyrroles unis par des ponts méthényles De huit chaines latérales : 4 méthylènes (CH3) 2 vinyl es (CH=CH2) 2 propionyles (CH2-CH2-COOH)  a. L’hème: Une ferro-protoporphyrine de type IX (tétrapyrolique centré par un atome de fer) Quatre noyaux pyrroles unis par des ponts méthényles De huit chaines latérales : 4 méthylènes (CH3) 2 vinyl es (CH=CH2) 2 propionyles (CH2-CH2-COOH)  Le fer en position centrale de l'hème se lie aux: - Quatre atomes d'azote du noyau proto porphyrinique - Et forme deux autres liaisons de part et l'autre du plan de l'hème : L’une avec l’O2, qui ne peut se lier que si le fer est à l'état ferreux [lorsque le fer est à l 'état ferrique = met hémoglobine qui est incapable de fixer l’O2] L’autre avec une chaîne polypeptidique de globine Chaque complexe hème + globine forme une sous unité: les quatre sous-unités s'adaptent les unes aux autres pour former un tétraèdre = la molécule d'hémoglobine  La synthèse de l’hème s’effectue indépendamment de celle de la globine L’hème ne vient que secondairement s’accrocher aux chaines polypeptidiques néosynthétisées pour réaliser la sous unité d’hémoglobine Certaines étapes de sa synthèse sont localisées dans les mitochondries, d’autres dans le cytosol Structure de l’hémoglobine  b. La globine: Enchainement des acides aminés On distingue les: - Les chaines α : 141 acides aminés, présentes dans toutes les Hb normales (gène : chromosome 16) - Les chaines non α : 146 acides aminés ( gène : chromosome 11) Les chaines β caractérisent l’Hb A1: α 2 β 2 Les chaines ɣ caractérisent L’Hb F: α 2 ɣ 2 Les chaines ẟ caractérisent L’Hb A2: α 2 ẟ 2 - 2 paires identiques  Chaque chaîne est repliée sur elle-même (enroulement en hélice alpha), et est subdivisée en 8 zones (A à H): On retrouve dans ces zones l'histidine qui se lie au fer de l'hème (la molécule d'hème se loge dans une poche superficielle, hydrophobe) La disposition spatiale des quatre sous-unités assemblées constitue la structure quaternaire  Chez l’homme , plusieurs hémoglobines se succèdent au cours de la vie , ces hémoglobines se distinguent par la nature des sous unités qui les constituent Ces modifications s’effectuent parallèlement au lieu de l’érythropoièse (Sac vitellin chez l’embryon, foie rate et MO chez le fœtus, MO chez l’adulte normal ) la chaîne alpha est synthétisée dès le troisième mois de gestation les chaînes zêta, epsilon et gamma apparaissent dès le 3ième mois de gestation et produisent les hémoglobines embryonnaires Gower 1 (zéta2 epsilon2), Gower 2 (alpha2epsilon2) et Portland (zéta2 gamma2)  A partir de 5 – 6 mois la synthèse de chaîne gamma est majoritaire, donnant l'Hb F (Hb fœtale : alpha2 gamma2), la synthèse de la chaîne gamma cesse quasi totalement à la naissance La synthèse de chaîne bêta débute au voisinage de la naissance (HbA ou adulte = alpha2 bêta2), de même que la chaîne delta (qui reste minoritaire, donnant l'Hb A2 (alpha2, delta2) Hb normale chez l'adulte: Hb A (alpha2 bêta2) =97 % Hb A2 (alpha2 delta2)= 2.2 – 3.2 % Hb F (alpha2 gamma2) < 1 %  V. Métabolisme énergétique des GR: Le GR a besoin d’énergie : - Maintenir l’intégrité de la membrane permettant de maintenir l’équilibre ionique par le fonctionnement des pompes NA+-K+ ATP ase qui nécessite l’ATP fourni par la glycolyse d’embden Meyerhof - Maintenir l’Hb sous sa forme active c’est a dire réduite ( fer2+ ), normalement chez l’adulte il y’a moins de 1% de méthémoglobine (Hb fe 3+ ). Protection de l’oxydation des groupements thiol de l’hémoglobine et des protéines membranaires  Métabolisme de glucose : - Le glucose fourni par le plasma dans le GR est catabolisé de deux façon : Par glycolyse anaérobie grâce au cycle d’Embden Meyerhof (de 90 à 95%) Par la voie des pentoses phosphates (de 5 à 10%)  La voie d’Embden Meyerhof: - Le glucose est dégradé jusqu'à l’acide lactique par l’action de : l’hexokinase, la phosphofructokinase et la pyruvate kinase - le catabolisme de glycose par cette voie fournit deux composants énergétiques : ATP (adénosine triphosphate ) NADH (nicotinamide adénine dinucléotide hydrogène)  ATP : - Le fonctionnement des pompes à sodium , permettant l’entrée du cholestérol, des phospholipides et des acides gras provenant du plasma NADH : - La réduction de la méthémoglobine en hémoglobine fonctionnelle (coenzyme d’une méthémoglobine réductase) 2,3 diphosphoglycérate: - Fixé au niveau de la cavité central de l’Hb, joue un rôle important dans la distribution de l’oxygène aux tissus  Métabolisme de glutathion : - Les agents oxydants entraine l’accumulation des peroxydes au sein de GR - Les peroxydes sont responsables de la dénaturation des constituants de GR - Le GR lutte contre les peroxydes grâce à un système réducteur efficace comprenant Le glutathion réductase Le glutathion peroxydase Glucose 6 phosphate  V. Fonctions des GR: Le GR assure deux fonctions importantes: besoin d’énergie : - Transport de l’oxygène des poumons aux tissus : Une molécule d’oxygène se fixe par atome de fer et 1g d’Hb peut transporter au max 1.34ml d’O2 lorsque la saturation est totale La courbe de saturation de l’Hb en fonction de pO2 présente une allure sigmoïde La pression de demi saturation (P50): pression partielle en O2 à laquelle coexiste 50% de formes oxygénées et 50% de formes désoxygénées Pour une PO2 est voisine de 100mmhg , correspond la pression de l’alvéole pulmonaire , l’Hb est saturée presque complétement (97,5%) -Transport du Co2 des tissus aux poumons  Par contre au niveau des tissus o la pO2 est voisine de 35mmhg l’Hb saturée à 30% -Transport du Co2 des tissus aux poumons: Le gaz carbonique produit ar la respiration cellulaire est transporté sous trois forme : A l’état dissous : 5% Sous forme de bicarbonate (70%) , le CO2 libéré par les tissus diffuse dans le plasma et pénètre dans les GR: CO2 + H2O HCO3- + H+ - Le bicarbonate formé est libéré dans le plasma alors que les ions d’hydrogène son retenus par l’Hb désoxygénée Sous forme de carbaminohémoglobine (25%): le CO2 se lie à l’Hb désoxygénée V. Devenir des GR: Hémolyse physiologique A l'âge de 120 jours, les GR sont phagocytés par le système réticulohistiocytaire (monocytes, macrophages) Hémolyse = Lyse des GR vieillis et libération du contenu hémoglobinique dans le milieu extérieur L’hémolyse physiologique est essentiellement intratissulaire, une faible partie (10 à 20%) est intravasculaire  L’hémolyse intratissulaire+++ : siège: Mo Macrophage du système mononuclée GR vieilli/ modifications : - Biochimiques : diminution du contenu enzymatique, perte de lipides membranaires, phénomène oxydatifs - Morphologique: Tendance à la sphéricité par diminution de la surface membranaire et hyperhydratation - Plasticité par diminution de la déformabilité des GR Stagnation dans les capillaires des sinus médullaires  L’hémolyse intratissulaire+++ : Conséquences de l’hémolyse : - 1GR/120 jours détruit 6 à 8 dr d’Hb - Catabolisme de l’hémoglobine  L’hémolyse invasculaire (10 à 20%) : Faible , libère l’Hb dans le plasma Hb-haptoglobine Hépatocytes - Haptoglobine : glycoprotéine sérique synthétisée par le foie , neutralise l’Hb produite lors d’une hémolyse intravasculaire physiologique en formant un complexe Hb-haptoglobine - Après élimination du complexe l’haptoglobine n’est pas recyclé : l’hémolyse physiologique consomme environ 1g d’haptoglobine par jour VI. Méthode d’étude de l’hémoglobine et des GR: NFS : - Taux de GR - Taux d’hémoglobine - Hématocrite - Indices érythrocytaires : VGM, CCMH, TCMH , IDR Frottis sanguin : - Aspect du GR - Anomalies de taille - Anomalies de la forme - Anomalies de la couleur - Inclusions érythrocytaires GR d’aspect normal: Même taille , même forme, même couleur Anisocytose : variation de la taille des GR+ Hypochromie Macrocytose au cours d’un déficit en vitamine B12 Sphérocyte: Petits GR ne possédant pas de zone clair Stomatocytes : présence d’une dépression rectiligne au centre du GR Elliptocytes : GR elliptique GR en forme de faucille au cours de la drépanocytose Hématies cibles : GR avec un centre coloré entouré d’une zone clair puis une zone colorée  Etude de l’hémoglobine : Méthodes électrophorétiques : - L’électrophorèse de l’hémoglobine permet la séparation et l’analyse qualitative des hémoglobines normales (HbA et HbA2), ainsi que les principales hémoglobines anormales : S ou D et C ou E - Principe : Dans un champ électrique , les hémoglobines se déplacent en fonction de : - la Charge - La taille de la molécule - La force ionique , du pH, du tampon , et de la nature du support - Par conséquent, les substances chargés différemment vont migrer à des vitesses différentes - Prélèvement : veineux sur tube EDTA - l’Hb A est la plus rapide - On distingue : - Electrophorèse sur acétate de cellulose à pH alcalin ( classiquement 8,6) - Electrophorèse sur gel d’agarose à pH acide (Ph 6) limites ; certaines hémoglobines migrent selon la même vitesse : exp; les hémoglobines S et D à Ph alcalin - Isoélectrofocalisation : appelée encore focalisation isoélectrique , c’est une technique réalisée sur gel d’agarose ou sur gel polyacrylamide , sépare les Hb dans un gradient de pH selon leur point isoélectrique ( migration jusqu’à atteindre la région ou le pH est égale à leur pH isoélectrique ) : Utile chez le nouveau né - Electrophorèse capillaire : Les fractions d’Hb se séparent sous l’influence d’un champ électrique, généralement sur base de leur rapport charge//masse, c’est une technique rapide, automatisée et offre une approche plus résolutive que celle de l’électrophorèse à pH alcalin  Méthodes chromatographiques : - la chromatographie liquide de haute performance (HPLC) : permet le dépistage et la confirmation des anomalies de l’hémoglobine avec une grande spécificité et sensibilité - Analyse rapide - Les différentes hémoglobines sont séparées par un gradient de tampons de force ionique et de pH croissants - Cette technique, automatisée et adaptée à de grandes séries, permet une quantification précise de l’Hb A2, Hb F, Hb A, Hb S et Hb C notamment - Elle doit être couplée à une autre technique, par exemple 26 électrophorétique, de manière à confronter les résultats obtenus par ces deux techniques différentes Profil chromatographique d’un patient homozygote S/S en HPLC  Techniques hématologiques et biochimiques spécifiques : - Le test de solubilité de l’hémoglobine S (= test d’Itano): est réservé à la confirmation de la présence d’hémoglobine S. Ce test manuel est basé sur la précipitation de l’hémoglobine S désoxygénée en présence d’hydrosulfite de sodium - Le test de facliformation : Le test de falciformation d’Emmel peut représenter une alternative au test d’Itano. Il consiste à mettre en contact, sur une lame, une goutte de sang à analyser avec une goutte de métabisulfite de sodium. En raison de la diminution de solubilité de l’hémoglobine S en condition de désoxygénation, les hématies contenant de l’hémoglobine S changent de forme et subissent une falciformation. Ces tests manquent toutefois de sensibilité et de spécificité , aujourd’hui de moins en moins utilisés  - Recherche de corps de Heinz : Les colorations supravitales utilisant un agent oxydant comme le bleu de crésyl brillant ou le violet de méthyl sont également utiles pour le diagnostic d’hémoglobine instable par la mise en évidence des corps de Heinz sur frottis sanguin. les corps de Heinz apparaissent comme des inclusions, souvent attachées à la membrane Retrouvés en nombre élevé chez les : splénectomisés , déficit en enzymes G6PD, hémoglobine instable , intoxication médicamenteuse Etudes génétiques : Permet de dépister les couples à risque de donner naissance à un enfant malade et, le cas échéant, de réaliser un diagnostic prénatal ( recherche des mutations ou délétion d’un gène de globine )  Etude de la fragilité osmotique : - Etude de la résistance des GR à des solutions de pression osmotique décroissante - La valeur normale de la concentration saline donnant l’hémolyse initiale : 4à4,4 g/L NaCl et elle est totale vers 3,4 g/L NaCl - La fragilité osmotique des GR est - Diminuée en cas d’anomalie membranaire : sphérocytose, elliptocytose, stomatocytose - Augmentée : Thalassémie ( anomalie de synthèse de chaine de globine )  Dosage des enzymes érythrocytaires : - Dosage de l’activité enzymatique de G6PD - Dosage du pyruvate kinase Exploration du bilan martial : - Fer sérique : N=13-20 μmol/L - La capacité totale de fixation de la Transférine (Nle= 45-70 μmol/L) - Le coefficient de saturation: le rapport du Fe sérique à la capacité totale N= 30% -Exploration des réserves: Le taux de ferritine circulante: dosage radio-immunologique ou immuno- enzymatique. (Nle=30- 300 μg/L chez l’homme, 20-200μg/L chez la femme) -Colorations de Perls: le Fer non hémoglobinique se colore par le ferrocyanure de potassium sous forme de grains bleu de Prusse (sidérosomes) VI. Pathologies des GR: 1. Les anémies: Définition: C’est une diminution de la masse d'hémoglobine circulante , les critères OMS utilisés pour la définition de l’anémie en fonction de l’âge et du sexe Taux d’Hb (g/100mL) inférieur à : - Femmes < 12 - Hommes < 13 - Femmes enceintes < 11 - Enfants < 5 ans < 11 Eliminer les causes d’erreurs : fausse anémie au cours des hémodilutions ou hémoconcentration (diminution / augmentation du volume plasmatique)  Les caractéristiques de l’anémie : - VGM: 80 – 100 fl Microcytose: < 80 fl Macrocytose: > 100 fl - CCMH: 32 - 36% Hypochromie: < 32% - TCMH: 27 – 32 pg Hypochromie < 27 pg - Réticulocytes: 25 – 75 000/mm3 < 75 000/mm3 : arégénérative 75 000/mm3 - 120 000 : peu régénérative > 120000 : régénérative  Les mécanismes de l’anémie : Deux mécanismes peuvent induire une anémie: 1.Central: Défaut de production par la moelle osseuse - Insuffisance quantitative de l’érythropoïèse : Anémies arégénératives Raréfaction ou absence de cellules souches hématopoïétiques ⇒ aplasies médullaires, envahissements (cellules malignes ou blastes ) - Anomalie qualitative de l’érythropoïèse Défaut de synthèse de l’hémoglobine : Anémie microcytaire non régénérative -Carence en fer - Syndrome inflammatoire - Insuffisance de synthèse de la globine (thalassémie) ou de l’hème  Insuffisance de synthèse de l’ADN > carence en acide folique ou vitamine B12 : Anémie macrocytaire non régénérative Atteinte qualitative de l’érythropoïèse > dysérythropoïèse Anémies normocytaires ou macrocytaires (souvent associées à une atteinte des autres lignées avec des cellules détruites dans la moelle) 2.Périphérique: Perte excessive (exp : hémorragie aigue, destruction excessive GR) -Perte excessive de globules rouges: Destruction exagérée (hémolyse) Perte (hémorragie aiguë) Anémies régénératives : réticulocytose augmentée  Les signes cliniques de l’anémie : - Deux signes sont spécifiques de l’anémie quelque soit la cause: 1.Paleur: - D’intensité variable , cutanée et muqueuse - Surtout nette au niveau de la coloration unguéale et au niveau des conjonctives 2. Les manifestations fonctionnelles hypoxiques: comportent - Un signe général: Asthénie - Signes cardio-respiratoires: Dyspnée d’effort , palpitation, tachycardie, douleurs angineuses à l’effort puis au repos, souffle cardiaque systolique - Signes neurosensoriels: vertiges, céphalées, bourdonnement d’ oreille, parfois troubles de conscience et coma si anémie sévère Pâleur cutanéomuqueuse  Classification des anémies :  2. Les polyglobulies: Définition: C’est l’augmentation du taux d’Hb ou de l’hématocrite (Ht) : - Femmes >16g/dl ou Ht > 48% - Hommes >16,5g/dl ou Ht>49%  Deux mécanismes distincts : - La polyglobulie primitive (ou maladie de Vaquez) est due à une anomalie des cellules souches de la moelle hématopoïétique qui acquièrent des caractéristiques tumorales, prolifèrent et entrainent une surproduction de globules rouges - La polyglobulie secondaire +++, liée à une augmentation du taux sanguin d’hormones stimulant l'érythropoïèse, en particulier l'EPO (érythropoïétine): - Le plus souvent secondaire à une hypoxie chronique ( stimulation de la sécrétion d'EPO par le rein) - Sécrétion inappropriée d’EPO (Exp: tumeur du rein ) Dans ce cas, la moelle est normale  V. Conclusion Globule rouge cellule simple mais hautement spécialisée Processus de production : Erythropoïèse (Lieu: MO a partir de la naissance ) Les érythroblastes proviennent des progéniteurs CFU-E et BFU-E eux mêmes issus des cellules souches totipotentes L’érythropoiètine ( EPO ) est le facteur de croissance principale de l’érythropoièse Pathologies : Anémies/polyglobulies Cas N° 1 Femme , 45ans : GR: 4 M Hb 9,8 g/100 ml Hte 30 % VGM 94 fl CCMH 32% TCMH 32 pg Pq 350000 GB 8000 PNN 70% PEos 2% Mono 4% Lc 24% Interpréter ces résultats Quels sont les autres examens à demander ?  Cas N° 1 Réticulocytes : 180.000/mm3 Interpréter le frottis sanguin : Quel est l’examen à demander pour confirmer le diagnostic ? Cas N° 1 Homme, 60ans : GR: 3,2 M Hb 8 g/100 ml Hte 26 % VGM 74 fl CCMH 30% TCMH 23 pg Pq 380000 GB 8000 PNN 70% PEos 2% Mono 4% Lc 24% Interpréter ces résultats Quels sont les autres examens à demander ? Cas N° 1 Ferritinémie : 10ug/l - Quel est le mécanisme à évoquer - Quels sont les autres étiologies qui peuvent donner le même type d’anomalie sur l’hémogramme ? ETUDE DE L’HEMOGRAMME Présenté par : Pr. BENCHAREF HANAA  Plan : I. Introduction VI. Hémogramme en pratique courante II. Indications VII. Conclusion III. Réalisation 1. Prélèvement 2. Numération Formule sanguine (NFS) 3. Frottis sanguin IV. Interprétation des résultats de l’hémogramme 1. Analyse des globules rouges 2. Analyse des globules blancs 3. Analyse des plaquettes V. Anomalies de l’hémogramme  I. Introduction L’hémogramme : Ensemble des mesures quantitatives et qualitatives des éléments figurés du sang (Globules rouges , globules blancs et plaquettes) Il est classiquement dénommé : Numération Formule Sanguine (NFS) Il consiste à : - Faire la numération des cellules sanguines circulantes dans 1mm3 de sang - Calculer les constantes érythrocytaires - Etablir la formule leucocytaire (répartition des différentes sous populations de leucocytes) - Etudier la morphologie  Il est effectué sur un sang veineux prélevé sur anticoagulant (EDTA) (parfois sur citrate de Na+ pour confirmation d’une diminution du taux de plaquettes) , éventuellement sang capillaire C’est un Examen simple, peu coûteux, automatisé et standardisé Indications sont très nombreuses, 1er examen biologique prescrit +++ Demande séparée: NFS, Frottis sanguin , Réticulocytes ( Intérêt quand l’hémoglobine est basse +++) Pour exploiter correctement les résultats il faut : - Connaître les valeurs normales - Savoir reconnaître et définir les anomalies  II. Indications Nombreuses+++ et très difficiles à standardiser Hémogramme est demandé devant : - Signes évoquant la diminution d’une ou de plusieurs cellules sanguines : Anémie , saignement, infection…. - Atteinte de l’état général : Fatigue, fièvre au long cours , amaigrissement inexpliqué - Augmentation du volume d’un organe : Rate , foie…. - Systématique: grossesse, bilan préopératoire, bilan pré thérapeutique, suivis thérapeutiques III. Réalisation 1. Prélèvement : a. Renseignements fournis avec la prescription de l’analyse :  Trois données rigoureusement indispensables : Nom , Prénom, l'âge et le sexe du patient  Recommandations actuelles impose également : nom et adresse du médecin prescripteur, le type d’échantillon, le site anatomique de prélèvement  Guident dans l’étude et l’interprétation des résultats de l’hémogramme  b. Conditions du prélèvement :  Matériel: - Anticoagulant: l’acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) , idéalement K2EDTA - Type tube: en plastique ou en verre siliconé sous vide ( attention à la date de péremption et conditions de stockage (température ambiante autour de 20°c))  Site de prélèvement: - Ponction veineuse franche , du coté opposé d’une perfusion (dilution du prélèvement)  Durée du maintient du garrot: - Mise en place prolongée: hémolyse et hémoconcentration - laisser le garrot moins d’une minute , - Enlever le garrot ou le desserrer lorsque le sang commence à arriver dans le tube  Ordre des prélèvements : - Parmi les derniers, après le tube sec, le tube citrate - Lorsque seul le tube EDTA doit être prélevé , l’utilisation des premiers millimètres est possible  Remplissage du tube : - Atteindre la concentration recommandée en anticoagulant K2EDTA (1,5+/-0,25mg/ml)  - Tube pas trop rempli, volume d’air représentant au moins 20%  Mélange anticoagulant-sang : - Au moment du prélèvement , il faut préciser la date et l’heure du prélèvement ainsi que le nom du préleveur c. Conservation des échantillons : stabilité des paramètres et recommandations relatives aux délai avant analyse - Analyse dans les 6h après le prélèvement , 4h pour les prélèvement en micro méthodes - Attendre 30min après le prélèvement pour réaliser l’analyse - Réanalyse possible ne dépassant pas les 24h 2. Numération Formule Sanguine : Correspondant au décompte cellulaire. Décompte des différents types de leucocytes sur 100 cellules (PNN, PNB, PNE, Ly, Mo) Méthode Classique: -Lente et fastidieuse - La détermination GR, GB et des Pq: au microscope Méthode automatique: - Rapide et reproductible, formule exacte dans la plupart des cas - Control de qualité En cas d’anomalie : Compléter obligatoirement par un FS à partir du tube qui permet une identification précise des cellules et de leur anomalies  Correspondant au décompte cellulaire. Décompte des différents types de leucocytes sur 100 cellules (PNN, PNB, PNE, Ly, Mono) Méthode Classique: -Lente et fastidieuse - La détermination GR, GB et des Pq: au microscope Méthode automatique: - Rapide et reproductible, formule exacte dans la plupart des cas - Control de qualité En cas d’anomalie : Compléter obligatoirement par un FS à partir du tube qui permet une identification précise des cellules et de leur anomalies  1950 : Les premiers appareils de cytologie hématologique automatisée (pas de réalisation de formule leucocytaire Etude microspique parallèle est toujours nécessaire A partir des années 1960- 70 : Automates de plus en plus performants qui utilisent différentes méthodes physiques et chimiques pour caractériser puis décompter les éléments du sang. - D'abord limités aux paramètres quantitatifs , - Ils proposent maintenant une formule leucocytaire complète - polynucléaires neutrophiles (PN), éosinophiles (PE), basophiles (PB), lymphocytes (Ly) et monocytes (Mo) - et, pour certains, la numération des réticulocytes  Amélioration de la précision des mesures sous réserve d'un calibrage et d'un suivi rigoureux des instruments Principe de mesure des automates : - Analyse par impédance : Les cellules mises en suspension dans un liquide conducteur et guidées à travers un petit orifice cylindrique vont déclencher lors de leur passage entre deux électrodes immergées dans ce liquide une augmentation de la résistance électrique (variation d'impédance) qui génère une impulsion électrique. Le nombre d'impulsions correspond au nombre de cellules ayant franchi l'orifice. L'amplitude de l'impulsion est proportionnelle au volume de la cellule. Les impulsions sont ensuite classées dans différents canaux selon leur amplitude, ce qui permet la construction d'histogrammes de distribution volumétrique Exemple d’hémogramme automatisé - Analyse par diffraction laser: Les cellules en suspension sont acheminées dans une gaine liquide afin de les aligner.. Chaque cellule passe ainsi individuellement devant un faisceau laser dont elle diffracte la lumière. La lumière diffractée peut alors être analysée sous différents angles. La mesure de cette lumière renseigne sur la granularité du cytoplasme et la densité chromatinienne de la cellule - Analyse par cytochimie: permet d’identifier ou sélectionner les populations leucocytaires. Elle repose sur la mise en évidence des enzymes (exp: la peroxydase contenue dans les granulations primaires de certains leucocytes, les lymphocytes sont négatifs pour cette réaction) - Analyse par un courant à haute fréquence : Un courant de haute fréquence est appliqué simultanément au courant continu sur deux électrodes. Le passage d'une cellule crée une différence de potentiel qui est en fonction du degré de conductivité cellulaire donnant ainsi des indications sur le contenu du cytoplasme et la structure du noyau - Analyse par Lyse chimique : Cette lyse détruit la membrane des leucocytes et les réduit à leur noyau à l'exception des basophiles qui conservent leur membrane et leur cytoplasme et sont ainsi identifiés puis numérés par leur taille ( tous les GB sauf es PNB). D’autres réactifs de lyse réagissent préférentiellement avec la membrane des granuleux les plus matures, sélectionnant ainsi les populations plus immatures Chaque automate pour combiner plusieurs technologies donc plusieurs critères de reconnaissance  Les résultats sont rendus en valeur relative % et en valeur absolue par mm3, mais l’interprétation n’est valable que sur les valeurs absolues   Limites : des causes d’erreur +++ poser l'indication de contrôles  manuels dans certaines circonstances 3. Frottis sanguin: But: - Observer et noter la morphologie des GR - Etablir la formule leucocytaire (% de chaque sous type cellulaire ) - Observer la morphologie plaquettaire +/-estimation du taux plaquettaire Principe : Il s’agit de préparer un étalement mince d’une goutte de sang sur une lame de verre, après une coloration appropriée , le frottis est observé au microscope Matériel: - Lames de verre propres et dégraissées, il ne faut jamais poser les doigts sur la surface pour ne pas laisser d’empreintes grasses - Lame à bords rodés  Technique: - Déposer une goutte de sang de 2mm de diamètre à 1cm de l’extrémité de la lame  - Placer le bord de la lame rodée sur une lame et glisser celle ci jusqu’à ce quelle entre en contact avec la goutte , en maintenant un angle d’environ 45°. La goute de sang s’étale le long de l’arète par capillarité - D’un mouvement souple et régulier, étaler la goutte de sang  - Sécher complètement le frottis à l’air pour bien conserver la forme des GR et éviter la formation d’artéfacts - Identifier le frottis à une extrémité de la lame  Critères d’un frottis de bonne qualité : - Régulier sans coupures , pas de trous ni de stries - Taille suffisamment grande, de manière à occuper au moins la moitié (1/2 au ¾ de la lame) - Les bords sont parallèles à la lame mais distants de ceux-ci - Ne doit pas être trop épais ni trop mince - Se termine par une extrémité arrondie ou en pinceau Exemples de frottis sanguins de mauvaise qualité (erreurs à éviter)  Variations : - Un étalement rapide donnera un frottis plus épais - Un étalement lent donnera un frottis plus mince - L’angle de la lame rodée peut affecter l’épaisseur du frottis :. Si l’angle est supérieur à 45°, le frottis sera plus épais et plus court. Si l’angle est inférieur à 45°, le frottis sera plus mince et plus long  Coloration du frottis sanguin , après séchage complet de la lame, permet l’identification et coloration des différents composants cellulaires Coloration May Grunwald Giemsa (MGG ): se base sur l’emploi successif de deux colorants - May Grunwald : fixe le frottis par son alcool méthylique et colore les éléments acidophiles et les granulations spécifiques des leucocytes - Giemsa: Colore surtout les noyaux et les parties azurophiles - Critère qualité: couleur chamois des hématies et bonne visibilité des grains de PNN Observation au microscope de la lame sécher à l’air: - D’abord à faible grossissement (objectif x40) : Déterminer la distribution des cellules, la qualité de l’étalement et de coloration - Puis au fort grossissement(objectif x 100) (ajout d’un petite goutte d’huile à immersion) : formule leucocytaire + anomalies morphologiques (GR,Pq,GB)et identification des cellules anormales Frottis de sang normal coloré au MGG (Grx100) Cellules anormales (=blastes) identifiées sur frottis sanguin coloré MGG (Grx100)  Actuellement, L’automatisation de la réalisation et la coloration des frottis sanguins a subi de grands progrès passant du stade des automates qui réalisent l’étalement et la coloration indépendamment aux automates qui réalisent en même temps l’étalement et la coloration Exemple d ’automate de confection et de coloration des frottis sanguins IV. Interprétation des résultats de l’hémogramme: Les valeurs varient en fonction de l'âge, du sexe et de l'origine ethnique Les laboratoires donnent les résultats du patient, les valeurs normales en fonction de l'âge et du sexe et au moins une antériorité quand elle existe Les valeurs normales sont des valeurs simplifiées au-delà desquelles une investigation complémentaire doit être entreprise Quelques principes généraux d'interprétation de l'hémogramme peuvent être dégagés : - Chaque lignée doit être interprétée quantitativement (nombre de cellules en valeur absolue, volumes, indices…) et qualitativement (anomalies morphologiques, cellules anormales) - Les données de l'hémogramme sont des mesures de concentration : la numération cellulaire tient compte à la fois des cellules et du contenant (plasma)  1. Analyse des globules rouges : a. Les mesures de références : Les trois mesures de références sont: - Nombre de GR circulant dans un volume de sang ( millions/mm³) (M/mm³) - Taux de l’hématocrite (Hte) : correspond au rapport du volume érythrocytaire sur le volume du sang total (exprimé en %) - Taux d’hémoglobine (Hb) : La quantité d’Hb contenue dans les GR/ unité de volume sanguin( g/dl)(g/100ml) (= définition de l’anémie si diminution ou polyglobulie si augmentation ) C’est Trois paramètres permettent de calculer les constantes érythrocytaires  Homme Femme Enfant NNé GR 4,4–5,4 4 - 5 4 - 5 5-6 (M/mm3) Hte (%) 40-50 38-47 38-47 44-77 Hb 13 -18 12-16 11,5-16 14-19 (g/100ml) - Variation en fonction de l'âge et du sexe - Augmentation physiologique de l’hémoglobine chez le Nouveau-Né  b. Les constantes érythrocytaires : Volume globulaire moyen (VGM): correspond au volume moyen d'un GR VGM =Ht x10 = 80 – 100 fl (femtolitre-fl) Nb de GR. VGM: 80-100 fl = normocytose globulaire.Si < 80 fl: microcytose.Si > 100 fl : macrocytose Teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TCMH): correspond à la quantité moyenne d’hémoglobine contenu dans chaque GR TCMH = Hb = 27 – 32 picogammes (pg) Nb de GR. TCMH: 27-32 pg = normochromie. Si < 27 pg : hypochromie  La concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH): Correspond au volume occupé par l’Hb dans un GR CCMH = Hb x 100 = 32 – 36 % Hte. CCMH: 32-36 % = normochromie. Si < 32% : hypochromie. Il n’y a pas d’hyperchromie En pratique: VGM: classe les anémies en normocytaire microcytaire macrocytaire TCMH: définit les anémies hypochromes CCMH: définit les anémies hypochromes  c. Autres indices érythrocytaires : Indice de distribution des globules rouges (IDR): correspond à un calcul fait par les automates lors d'un hémogramme, concernant la variabilité de la taille des globules rouges - La valeur normale de la largeur de distribution des globules rouges (IDR) est de 11 à 15% - Une valeur plus élevée indique une plus grande variation de la taille des hématies que la normale (anisocytose) et se voit dans de nombreux types d’anémies.  c. Numération Réticulocytes : La numération des réticulocytes ne fait pas partie de l’hémogramme Analyse spécifique Permet d’apprécier l’activité érythropoiétique de la moelle Réticulocyte : GR immatures issus de la MO, persistent dans le sang pendant 1 à 3 jours avant de devenir des hématies Ils contiennent encore des restes d’organites cytoplasmiques : réticulum endoplasmique, ribosomes, mitochondries, et de l’ARN Mise en évidence par une coloration spécial utilisant le bleu de crésyl ou le bleu de méthylène : dans ces conditions les organites cellulaires (ribosomes , mitochondries) sont rendus visibles sous la forme d'une « substance granulo-filamenteuse » caractéristique  Le bleu de méthylène étant un marqueur basique, il se fixe sur des cellules acides, le réticulocyte est donc acide (de par la présence d'ARN entre autres) il sera donc dit comme basophile Le taux des réticulocytes est exprimé en pourcentage du nombre de G.R. par millimètre cube. Le taux normal est de :. 0,2 à 2 % chez l'adulte (généralement 0,5 à 1,5 %). 2 à 6 % chez le Nouveau né Aspect des réticulocytes sur frottis sanguin après coloration au bleu de crésyl Aspect des réticulocytes sur frottis sanguin après coloration au bleu de crésyl  Actuellement, la numération des réticulocytes est automatisée (Réactif mettant en évidence l’ARN résiduel des réticulocytes ) Ils doivent toujours être calculés en chiffre absolu Valeur normale : 25 à 75.000/mm3 Il permettent de classer l’anémie :. Anémie régénérative: Taux de réticulocytes> 120000/mm³. Anémie non régénérative: Taux de réticulocytes< 120000/mm³  2. Analyse des globules blancs : Exprimé en % , convertie en valeur absolue ( interprétation doit être toujours en valeurs absolues et non pas en pourcentage ) Variations en fonction de l’âge: Naissance : 10 à 26 G/L (=10 – 26.000/mm3 ) 3 mois : 6 à 12 G/L 1 an : 6 à 15 G/L 3 à 6 ans : 10 à 15 G/L 10 à 12 ans : 4,5 à 13,5 G/L Adulte : 4 à 10 G/L Leucocytes chez l’adulte: < 4000 /mm3 = leucopénie >10.000 /mm3 = Hyperleucocytose  Chez le nouveau-né donne : de façon physiologique des résultats plus élevés pour chaque type de leucocytes : Polynucléaires neutrophiles : 6 à 26 G/L Lymphocytes : 2 à 11 G/L Monocytes : 0,4 à 3,1 G/L Au cours du premier mois de la vie il y a une diminution des polynucléaires neutrophiles et des monocytes. Il s'installe une formule à prédominance lymphocytaire dans le contexte d'une leucocytose totale plus élevée que chez l'adulte (jusqu'à 15 G/L)  3. Analyse des plaquettes : C’est le décompte des plaquettes dans le sang circulant Taux normal : 150-450.000/mm3 Thrombopénie : < 150.000/ /mm3 Hyperplaquettose (=thrombocytose) : > 450.000/ /mm3  En pratique : Interprétation en deux temps Paramètres de la numération ligne par ligne : variation quantitative Paramètres de la formule (en valeur absolue ) Variation qualitative ( commentaire morphologie des cellules ) Il faut toujours confronter les résultats : - La population de référence - Aux conditions cliniques - Evaluer une éventuelle hémodilution  V. Anomalies de l’hémogramme Anomalies des GR :  Quantitatives : - Anémie c’est la diminution de taux de l’Hb Hb 9 G/L chez le nourrisson > 7 G/L chez l'enfant Causes: Causes:  Qualitatives : - Anomalies morphologiques : PNN hyposegmenté (infection, myelodysplasie ) PNN hypersegmenté ( carence en vit B12) PNN hypogranulé ( myelodysplasie ) - Présence de cellules immatures : myélemie , éryhtroblastes, blastes ….. Myélémie: c’est le passage dans le sang de formes immatures de la lignée granuleuse de la moelle : métamyélocytes, myélocytes et moins souvent promyélocytes. Une myélémie significative est pathologique - Principales étiologies des myélémies : Infections graves (septicémies) Métastases ostéomédullaires Syndromes myéloprolifératifs Régénérations médullaires : ○ Réparations d'hémorragies ○ Anémies hémolytiques ○ Réparation d'insuffisance médullaire (post chimiothérapie par ex.) - L’ érythroblastose sanguine (érythroblastémie) correspond au passage dans le sang d'érythroblastes - L' érythromyélémie est l'association d'une myélémie et d'une érythroblastose sanguine. Myelemie sur un frottis sanguin Cellules blastiques avec un batonnet d’auer  Anomalies des plaquettes :  Quantitatives : - Thrombocytose : taux de plaquettes >450.000/mm3 Primitive Secondaire - Thrombopénie : taux de plaquettes