Production of Polyclonal and Monoclonal Antibodies in Vitro PDF

Productie van polyklonale - en monoklonale antilichamen in vitro antilichamen = antistoffen = immunoglobulines 34 Opfrissing van basisstructuur van een antilichaam. Immunoglobulins in labo’s produceren en verkopen 2 zware identieke regionen 2 lichte ketens En variabele stukken 34 35 2 reagen...

Productie van polyklonale - en monoklonale antilichamen in vitro antilichamen = antistoffen = immunoglobulines 34 Opfrissing van basisstructuur van een antilichaam. Immunoglobulins in labo’s produceren en verkopen 2 zware identieke regionen 2 lichte ketens En variabele stukken 34 35 2 reagentia: Het meervoud of een mengsel aan antilichamen wordt ‘antisera’ genoemd. Er is een verschil tussen monoklonale antisera en polyklonale antisera. Verschil: Monoklonale antisera: mengsel met enkel monoklonale antilichamen → binden met maar 1 soort epitoop Polyklonale antisera: mengsel antilichamen dat bindt met verschillende epitopen → goedkoper in productie 35 Hoe groot is 1 epitoop? Antwoord: Epitopen variëren in groote en hun oppervlak komt overeen met ongeveer 5 of 6 aminozuren. Dit betekent dat 1 eiwitantigeen samengesteld is uit al dan niet lineaire volgorde gegroepeerde aminozuren. 36 Geen examenvraag 36 Immunisatie 37 Polyklonale antisera: hoe geproduceerd? Immunisatie (= opwekken van een immuunrespons) door antigeen te injecteren in een muis. → een ziekte geven 37 38 Productie van polyklonale antilichamen kan ook in andere dieren gebeuren: zoals konijnen, geiten, schapen, kippen, maar ook paarden, lama’s, etc… 38 39 Samengevat: Om een immunologische reactie tegen een antigeen op te wekken, wordt het antigeen opgelost of opgeschort in water en geëmulgeerd in olie met behulp van een emulgator, soms met gedode tuberkelbacillen om de immuunrespons te versterken. Deze emulsie wordt bij een proefdier (bijvoorbeeld een konijn, muis, schaap) geïnjecteerd, meestal intramusculair of subcutaan. Zodra het antigeen in een lymfoïd orgaan arriveert, wordt het opgenomen door macrofagen. Gedeeltelijk gemetaboliseerde antigenen verschijnen geconcentreerd aan het oppervlak van de macrofagen en kunnen nu worden gepresenteerd aan T- en B-lymfocyten. T- en B-cellen herkennen en binden aan verschillende epitoopregio's van het antigeen via speciale receptoren. Na binding ondergaan T- en B-cellen transformatie en proliferatie, waarbij B-cellen worden gestimuleerd door T-cel factoren. T-cellen produceren lymfokines, die verdere proliferatie van T-cellen stimuleren en macrofagen aanzetten om de antigenen te neutraliseren. B-cellen rijpen uit tot plasmacellen, elke plasmacel vermenigvuldigt tot een kloon die specifieke antilichamen produceert tegen een epitoop van het antigeen. Het gevormde antiserum is polyklonaal, waarbij de bindingsaffiniteit tussen antilichamen van verschillende klonen kan variëren. Een deel van de T- en B-cellen transformeert na het eerste contact met het antigeen tot geheugencellen tijdens de primaire immuunrespons. Bij een tweede contact met hetzelfde antigeen zorgen deze geheugencellen voor een snellere en krachtigere immuunrespons, bekend als de secundaire immuunrespons. Het 'boosteren' van antilichaamproductie wordt bereikt door het proefdier na enkele weken tot een maand opnieuw met hetzelfde antigeen te injecteren. Herhaling van dit proces resulteert in een verhoogde concentratie van antilichamen, ook wel bekend als een hoge antilichaamtiter. 39 Booster s 40 40 Figuur 28 58 De primaire -en secundaire antilichaamrespons Samengevat: Bij de eerste blootstelling aan een antigeen wordt voornamelijk IgM geproduceerd, wat de primaire afweerreactie is. Na een tijdje bereikt de synthese van IgG-antilichamen een piek. Bij een tweede blootstelling aan het antigeen is er opnieuw een IgM-reactie, vergelijkbaar met de eerste keer, maar met een mogelijk hogere piek. De IgG-antilichaamproductie wordt echter snel verhoogd tot een veel hogere concentratie, gevolgd door een geleidelijke afname. Plasmacellen, de effectorcellen van B-lymfocyten, scheiden zowel IgM als IgG uit tijdens de primaire respons (eerste contact met het antigeen). Bij de secundaire respons (tweede contact met het antigeen) zijn het de geheugencellen die zorgen voor de secretie van IgM en vooral IgG. In een notendop, tijdens het eerste contact met een antigeen wordt voornamelijk IgM geproduceerd, terwijl bij een volgende blootstelling vooral IgG wordt aangemaakt. Het immunoglobulinepatroon, met de dominante aanwezigheid van IgM bij de primaire respons en de snelle toename van IgG bij de secundaire respons, kan helpen onderscheid te maken tussen een acuut of chronisch ziekteproces. Cursus: IgM is de eerste immunoglobulineklasse die geproduceerd wordt in een primaire reactie op een antigeen; het is eveneens het eerste immunoglobuline dat een neonaat kan aanmaken. Bij het eerste contact met een lichaamsvreemde stof of antigeen is er een vroege IgM-reactie, de primaire afweerreactie, die meestal ook weer snel afneemt. De synthese van IgG-antilichamen bereikt een maximum na een langere periode. Na een tweede blootstelling aan het antigeen lijkt het verloop van de IgM-reactie in de tijd op wat men na de eerste kennismaking ziet, hoewel de piek hoger kan zijn. In tegenstelling daarmee wordt de synthese van IgG-antilichamen bij het tweede contact in korte tijd opgevoerd tot een veel hogere titer en wordt deze gevolgd door een veel geleidelijker terugval van de antilichaamconcentratie. Een vergelijkbaar immunoglobulinepatroon wordt gezien bij acuut of chronisch verlopende ziekteprocessen. Het verloop van het immunoglobulinepatroon kan derhalve van nut zijn om vast te stellen of het om een acuut of chronisch verloop van een infectie of ontsteking gaat. In geval van een acuut proces zal de relatieve toename in de IgM-concentratie 58 hoger zijn dan van de IgG-concentratie, bij een chronisch proces zal juist meer IgG gevormd worden. Het zijn de plasmacellen (=effectorcellen van de B-lymfocyten) die IgM en IgG uitscheiden in een primaire respons (=eerste contact met het antigeen) Het zijn de geheugencellen die IgM en IgG secreteren in een secundaire respons (=tweede contact met het antigeen) Kort samengevat kan je zeggen dat er in een eerste contact met een antigeen voornamelijk IgM gevormd wordt, terwijl bij een volgend contact voornamelijk IgG wordt aangemaakt (zie Figuur 28). Figuur 28: Primaire en secundaire antilichaamrespons. Tijdens een humorale immuunrespons die optreedt bij een eerste contact met een antigeen (primaire respons genoemd) worden na enkele dagen antilichamen gevormd van de IgM-klassen. Na ongeveer een week verschijnen in het bloed antilichamen van een andere klasse (IgG). Deze IgG-antilichamen hebben dezelfde specificiteit (d.w.z. Dat ze reageren met hetzelfde antigeen) maar zijn anders van grootte en kunnen daardoor op andere plaatsen in het lichaam terechtkomen. IgG’s zijn dan ook in staat om andere effectormechanismen te activeren (fagocytose, complementactivatie). B-lymfocyten die eenmaal zijn overgeschakeld van IgM naar IgG-productie kunnen niet meer terug. Wanneer alle antigeen verwijderd is, stopt de antilichaamproductie, maar de gevormde geheugen-B-lymfocyten blijven aanwezig. Bij hernieuwd contact treedt een secundaire antilichaamrespons op waarbij in kortere tijd grote hoeveelheden antilichamen worden gevormd, die nu vooral van de IgG-klasse zijn. Na elke booster: bloedafname van het proefdier. Van alle antisera wordt een verdunningsreeks gemaakt 42 Wanneer we antilichamen willen gebruiken als reagentia in immunobepalingen, volgen we een proces waarbij na elke stimulatie (= booster) bloed wordt afgenomen van het proefdier. Uit dit bloed wordt serum, ook wel antiserum genoemd, verkregen. Van het antiserum wordt een reeks verdunningen gemaakt, waardoor we de optimale concentratie van antilichamen voor een specifieke immunobepaling kunnen bepalen. Het is essentieel om de juiste verhouding tussen antilichamen en antigenen te hebben voor elke immunobepaling. Dit stelt ons in staat om nauwkeurige en effectieve metingen uit te voeren. 42 43 De titer is eigenlijk gewoon de omgekeerde waarde van de beste verdunning van het antiserum, wat betekent dat het aangeeft hoe sterk het antiserum verdund kan worden en nog steeds een positieve reactie geeft. Een hogere titer betekent dat het antiserum meer verdund kan worden, waardoor we minder bezorgd hoeven te zijn over mogelijke verstoringen veroorzaakt door andere stoffen in het bloedserum van het proefdier. 43 44 44 in 96-well microtiterplaat 45 Overzicht van de productie van monoklonale antilichamen. 45 64 De productie van monoklonale antilichamen In 1975 lukten Köhler en Milstein erin om versmelting tot stand te brengen tussen individuele B-cellen (miltcellen van muizen) en speciale in vitro groeiende tumorcellen van muizen (plasmacytoomcellen). Myelomas zijn tumoren van lymfoïde organen. Zij kunnen spontaan in het organisme ontstaan. Myelomas die zelf actief immuunglobulinen produceren worden plasmacytomas genoemd. Een aantal van deze plasmacytomas kunnen uitstekend in vitro gekweekt worden en lenen zich bijgevolg voor fusie met plasmacellen. Er zijn verschillende plasmacytoma cellijnen bekend voor muis, rat en mens. De kwaadaardige plasmacellen in multiple myeloom worden myeloomcellen genoemd. Soms groeien deze maligne plasmacellen vanuit het beenmerg in de weefsels of ze groeien buiten het beenmerg. Dit laatste worden dan plasmacytomen genoemd. De cellen hierin worden plasmacytoomcellen genoemd. Immunisatie Als ‘leverancier’ van antilichaamvormende plasmacellen gebruikt men een muis of een rat, omdat voor beide diersoorten plasmacytoomcellijnen beschikbaar zijn waarmee men dan in een later stadium antilichaamvormende plasmacellen kan fuseren. Het proefdier wordt met zuiver antigeen ingespoten zodat de immunisatie kan opgewekt worden. Drie dagen na de laatste boosterinjectie wordt de milt aseptisch verwijderd uit het dier, waaruit men een miltsuspensie bereid door de milt fijn te knippen en de cellen voorzichtig door een steriel nylongaasje te wrijven en ze op te vangen in een steriele fysiologische bufferoplossing. In deze miltsuspensie zijn granulocyten, erythrocyten, lymfocyten, bloedplaatjes en plasmacellen aanwezig. Onder deze laatste groep cellen zitten een aantal plasmacellen die het gewenste antilichaam produceren. Fusie De plasmacytoomcellijnen die geschikt zijn voor fusie worden gekweekt in weefselkweekmedium bij 37 64 °C in een zeer vochtige atmosfeer met 5 - 7 % CO2. Om de fusie van tumor- en miltcellen te bekomen worden deze in een verhouding van 1 tot 10 miltcellen per tumorcel in een proefbuis samengebracht. Daarna worden de cellen afgecentrifugeerd en de celpellet geïncubeerd in weefselkweekmedium waaraan polyethyleenglycol (PEG) is toegevoegd. Na ongeveer 2 incubatie ziet men kleine klontertjes van geplakte milt- en tumorcellen in de buis zweven. Het PEG wordt daarna weer verwijderd. Eén fusie kan een groot aantal hybride cellen opleveren. Men wil deze cellen zoveel mogelijk gescheiden houden om geen mengsel van verschillende monoklonale antilichamen te krijgen. Vandaar dat het fusiemengsel verdeeld zal worden over een groot aantal microtiterplaten. Elk van de kuipjes (‘wells’) heeft een inhoud van 0,25 mL en is te beschouwen als een individuele minicultuur. Om monoklonale antilichamen te produceren, worden individuele B-cellen van muizen gevoegd bij speciale tumorcellen (plasmacytomen) in een laboratorium. Deze tumorcellen kunnen goed groeien in een kweek. Myeloomcellen, die kwaadaardige plasmacellen zijn, worden soms uit het beenmerg gehaald en kunnen buiten het beenmerg groeien, wat plasmacytomen worden genoemd. Hier is een stapsgewijze uitleg van het proces: 1. **Immunisatie:** Een muis of rat wordt geïmmuniseerd door herhaaldelijk zuiver antigeen in te spuiten om een immuunrespons op te wekken. Na de laatste injectie wordt de milt uit het dier verwijderd. 2. **Miltsuspensie:** De milt wordt fijngeknipt, de cellen worden door een zeef gewreven en opgevangen in een bufferoplossing. Deze suspensie bevat verschillende soorten cellen, waaronder plasmacellen die het gewenste antilichaam produceren. 3. **Fusie:** De geschikte plasmacytoomcellen worden gekweekt in een kweekmedium. Vervolgens worden de miltcellen en tumorcellen in een buis samengebracht, afgecentrifugeerd en geïncubeerd in aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG). Dit bevordert de fusie van de twee celtypen, wat resulteert in hybride cellen. 4. **Verdeling over microtiterplaten:** De fusiemix wordt verdeeld over veel microtiterplaten, elk met kleine compartimenten (wells). Hier kunnen de hybride cellen groeien als individuele culturen. Dit proces leidt tot de productie van hybride cellen die monoklonale antilichamen produceren. Elk compartiment van de microtiterplaten vertegenwoordigt een unieke hybride cel die een specifiek antilichaam produceert. 66 Selectie Na het fusieproces moet men de gewenste hybride cellen selecteren. De meerderheid van de cellen in de cultuur zal een combinatie zijn van ongefuseerde tumor- en miltcellen. Om de gewenste hybride cellen te isoleren, wordt een methode genaamd HAT-selectie gebruikt. HAT staat voor hypoxanthine-aminopterine-thymidine. Aminopterine remt de productie van DNA-basen. Als je normale cellen blootstelt aan HAT-medium, wordt eerst de DNA-synthese verstoord. Echter, vervolgens wordt een "reddingsenzym" genaamd hypoxanthine-guanidine-fosforibosyltransferase (HGPRT-ase) gevormd, dat in staat is om met hypoxanthine als substraat de benodigde purinebasen voor het DNA te maken. In de monoklonale antilichaamtechniek worden plasmacytoomcellen gebruikt die het chromosoom HGPRT-ase missen (HGPRT-). Deze cellen kunnen niet overleven in een HAT-medium. Na fusie met normale miltcellen (HGPRT+), worden de hybride cellen in een HAT-medium geplaatst. Alleen de hybride cellen die HGPRT+ zijn, kunnen groeien. Veel van deze hybride cellen zullen immuunglobulinen in het supernatant afscheiden, maar slechts enkele zullen het antilichaam met de gewenste specificiteit produceren. Eenvoudiger: Na het fusieproces, waarbij tumor- en miltcellen worden samengevoegd tot hybride cellen, is het nodig om specifieke hybride cellen te selecteren. De meerderheid van de cellen in deze gemengde cultuur zal een combinatie zijn van ongefuseerde tumor- en miltcellen. Om de gewenste hybride cellen te isoleren, wordt een methode genaamd HAT-selectie toegepast. HAT staat voor hypoxanthine-aminopterine-thymidine. Aminopterine remt de productie van DNA-basen. Als normale cellen worden blootgesteld aan een HAT-medium, wordt eerst de DNA-synthese verstoord. Echter, daarna wordt een "reddingsenzym" genaamd 66 hypoxanthine-guanidine-fosforibosyltransferase (HGPRT-ase) gevormd. Dit enzym kan, met hypoxanthine als substraat, de benodigde purinebasen voor DNA-synthese produceren. In de monoklonale antilichaamtechniek worden plasmacytoomcellen gebruikt die het chromosoom HGPRT-ase missen (HGPRT-). Deze cellen kunnen niet overleven in een HAT-medium. Na fusie met normale miltcellen (HGPRT+), worden de hybride cellen in een HAT-medium geplaatst. Alleen de hybride cellen die HGPRT+ zijn, kunnen overleven en groeien. Veel van deze hybride cellen zullen immuunglobulinen in het supernatant afscheiden, maar slechts enkele zullen het antilichaam met de gewenste specificiteit produceren.