Guía Micro Exp-Comprimido PDF

➔ Práctica 1. Bioseguridad en el laboratorio. Bioseguridad: Normas aplicadas en la investigación científica, o trabajo docente para prevenir riesgos o infecciones de agentes biológicos, químicos o físicos. Barreras primarias: Barreras personales (equipo de protección personal, envases de la muestra,...

➔ Práctica 1. Bioseguridad en el laboratorio. Bioseguridad: Normas aplicadas en la investigación científica, o trabajo docente para prevenir riesgos o infecciones de agentes biológicos, químicos o físicos. Barreras primarias: Barreras personales (equipo de protección personal, envases de la muestra, cabinas de bioseguridad y procedimientos que evitan aerosoles). Barreras secundarias: Dirección del flujo de aire, accesos restringidos y/o controlados, pisos, ventanas, paredes, flujo de material y personal de laboratorio, flujo de desechos, procedimientos administrativos, y RPBI (gestión integral del riesgo biológico). Niveles de bioseguridad. ➔ Grupo de riesgo 1: Nivel de seguridad 1. Básico. Investigación o enseñanza. No ocasionan enfermedades en adultos sanos. Mínimo riesgo para el personal o ambiente. Sin equipo de seguridad, y técnicas microbiológicas adecuadas. Ej. Bacillus subtilis, Naegleria gruberi, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli. ➔ Grupo de riesgo 2: Nivel de seguridad 2. Básico. Diagnóstico, investigación y atención primaria. Se utilizan las técnicas microbiológicas adecuadas, TMA, ropa protectora. Hay riesgo biológico. Cabinas CSB, además de mesa descubierta. Trabajo con agentes de riesgo moderable. Hay vacunas o tratamientos. Ej. virus de la rubéola, Salmonella spp, Toxoplasmo spp, hepatitis B, haemophilus influenzae. ➔ Grupo de riesgo 3: Nivel de seguridad 3. Contención. Diagnóstico especial e investigación. Prácticas con ropa especial, acceso controlado y ☠️ flujo direccional de aire. Cabinas CSB. Barreras primarias. Se trabaja con agentes infecciosos graves o letal por vía aérea. Ej. Mycobacterium tuberculosis, St. Louis encephalitis virus, Coxiella burnetii, Salmonella typhi. ➔ Grupo de riesgo 4: Nivel de bioseguridad 4. Contención máxima. Unidades de patógenos peligrosos. Prácticas de nivel 3 + cámara hermética. Ducha salida. Residuos eliminados, Cabina de bioseguridad nivel 2 y 3. Trajes presurizados (3312, tenemos un 3312). Autoclaves de dos puertas (tamalera), aire filtrado. Agentes peligrosos y exóticos. Transmisión aerosol o contacto. Riesgo letal. Ej. ébola, virus desconocido y virus de la fiebre del valle del Rift. Grupos de riesgo. ➔ Grupo 1: Riesgo poblacional o individual nulo. No causa enfermedades. ➔ Grupo 2: Riesgo individual moderado y poblacional bajo. Exposición provoca infección grave. Propagación limitada. ➔ Grupo 3: Riesgo individual elevado y riesgo poblacional bajo. Enfermedades graves, no contagiosas de uno a otro individuo. Medidas preventivas y terapéuticas. ➔ Grupo 4: Individual y poblacional elevado. Agentes patógenos elevados y de fácil transmisión, directa o indirectamente. No hay cura. Buenas prácticas de laboratorio (BPL): Sistema de garantía de calidad, relativo al modo de organización de los estudios de seguridad no clínicos, referentes a la salud y medio ambiente, en cómo se planifican, ejecutan, controlan, registran, archivan y difunden. Principios fundamentales de BPL: Instalaciones, equipo adecuado y calibrado, procedimientos normalizados, personal calificado. RPBI: De la NOM-087-ECOL-1995, la cual establece los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten atención médica. ➔ Práctica 2. Manejo del microscopio. El fundamento del microscopio se basa en la proyección de la luz blanca, gracias a ella, los componentes de la muestra se visualizan por las diferencias de contraste entre el objeto y el medio que lo rodea. *Es la forma más simple de la microscopia donde la luz pasa a través de la muestra o es reflejada por del espécimen Pinzas. Sirven para sujetar la muestra (portaobjetos). Platina: Sirve para colocar la muestra, que contiene a los tornillos para poder desplazar la muestra. Base o pie: Se encuentra en la parte inferior del microscopio y sobre la cual se montan el resto de elementos. Brazo: Sirve para sujetar al microscopio, es la columna del microscopio. Soporta al tubo óptico, a la platina y al revolver. Tornillo macrométrico: Sirve para acercar o alejar la platina. Tornillo micrométrico: Sirve para dar definición a la imagen. Tornillo X y Y: Sirve para mover el objetivo a lo largo de la muestra. Objetivos: Sirve para aumentar lo que se busca observar. Revólver: Cremallera, que permite mover los objetivos para la visualización de la muestra. Oculares: Aquellos que se utilizan para visualizar la imagen. Diafragma: Ayuda a controlar la cantidad de luz que entra al microscopio. Condensador: Se encarga de concentrar los rayos de luz provenientes del foco. Foco: Se encarga de iluminar la muestra para poder ser observada. OBJETIVO. Aumento. Capacidad que posee un objetivo de ampliar la imagen del objeto observado. Se le define como la relación entre el tamaño de la imagen y el objeto, en valores lineales (largo y ancho). Poder de resolución. Capacidad de un dispositivo óptico de distinguir dos puntos muy cercanos entre sí como imágenes separadas. D= longitud de onda/ AN. Menor D, mayor resolución. Límite de resolución. Distancia mínima que debe de haber entre dos puntos para percibirlos como independientes. microscopio 0.2um. Apertura numérica: Medida que indica la capacidad que tiene el objetivo de captar los rayos refractados por estructuras finas que constituyen a la muestra. Es un número adimensional que caracteriza el rango de ángulos para los cuales el sistema acepta luz. A mayor cantidad de haces de luz capturados mejora la resolución = mayor AN. AN= n x sen ∝, donde n es el índice de refracción de la interfase que separa el cubreobjeto de la muestra examinada, y ∝ es la mitad del ángulo de apertura. Relación de objetivos que se muestran referente al aumento del microscopio. Índice de refracción: Relación existente entre la velocidad de la luz en el aire y su velocidad en el medio transparente utilizado. Sustancia y su Índice de refracción Aire: 1 Aceite de inmersión: 1.516 Glicerina: 1.48 Agua: 1.3300 Longitud de onda de la radiación electromagnética utilizada: a menor longitud de onda, mayor resolución. y a mayor AN= mayor resolución. Longitud de onda. 390-800 nanómetros o milimicrometros. Ángulo de apertura: Capacidad de un objetivo de captar los rayos luminosos refractados cuando éstos atraviesan un medio transparente. Cuanto mayor sea este ángulo, la lente frontal del objetivo aceptará una mayor cantidad de rayos. Profundidad de campo. La profundidad de campo es el espesor del espécimen que se encuentra aceptablemente nítido a un nivel de foco dado.  ➔ Práctica 3. Preparaciones microbiológicas. Zona aséptica. Zona comprendida dentro de una área limpia, diseñada y construida para minimizar la contaminación por partículas viables y no viables. Técnica aséptica: Conjunto de procedimientos para evitar contaminación durante el manejo de cultivos microbianos, para lo cual requerimos de una zona aséptica donde podamos manipular el material estéril-. 1.Lavar manos. 2.Organizar material y etiquetar. 3.Crear zona aséptica con mechero (radio 12 cm). 4.Esterilizar asa y usar material estéril. 5.Uso correcto de material estéril y medios de cultivo. Preparaciones. Preparación en fresco: Observar a un microorganismo vivo, con motilidad Preparación fija: Observar la estructura de los microorganismos, en el proceso de fijación de la muestra (aplicación de calor) se detienen los procesos vitales de las células. Existen 2 tipos de Fijadores. Físicos. Desecación, calor seco, calor húmedo, calor húmedo, ultrasonido y microondas. Químicos. ya que son líquidos con potencial alto de difusión intracelular y detienen procesos enzimáticos que provocan autolisis. Los procesos de fijación químicos se pueden clasificar como oxidantes y reductores, de acuerdo con sus propiedades químicas. Entre los agentes químicos oxidantes se encuentran: óxido crómico, ácido acético, ácido pícrico, acetona, dicromato de potasio. Los agentes químicos reductores son: formaldehído, glutaraldehído, etanol, metanol, paraldehído, etcétera. Los reactivos poseen la capacidad de interactuar con biomoléculas como proteínas, glicoproteínas, peptidoglicanos, lípidos, glicolípidos, lipoproteínas, pigmentos, ácidos pécticos y nucleicos. El metanol 99% es el reactivo que se encuentra al alcance de todos los laboratorios; es un reactivo reductor, deshidratador, y es clasificado como fijador coagulante, de tal manera, coagula proteínas y las hace insolubles, pero sin desnaturalizarlas. Frotis. Extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos. Calor seco. Consiste en exponer directamente la laminilla a la flama del mechero, con esto se logra detener los procesos vitales de las células y los microorganismos. la sobreexposición, o la exposición en una zona incorrecta de la flama (zona fría, zona caliente y zona de fusión) repercutirá en el efecto deseado; es muy común provocar alteraciones morfológicas y destrucción celular. Colorante: Sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etc. Está constituido por un cromóforo (capacidad que tiene la molécula para que sus electrones absorben energía o luz visible, se exciten y emitan diversos colores de acuerdo con la longitud de emitida como resultado del cambio en el nivel energético, proporciona color en la tinción) y un auxocromo (grupos funcionales o radicales que constituyen una molécula y poseen carga parcial positiva; tienen la función de intensificar la formación de color mediante la acción de grupos de átomos no saturados; su función es desplazar a los cromóforos hacia longitudes de ondas largas para aumentar +la intensidad, da la característica iónica apropiada del colorante). Colorantes ácidos: Son aniónicos, solubles en agua y están constituidos por un catión incoloro unido a un anión coloreado.El cromóforo es el anión, afinidad por estructuras cargadas positivamente. Ej. Eosina, fucsina ácida, Rojo congo. Colorante básico: Son catiónicos, solubles en agua y están constituidos por un catión colorado unido a un anión incoloro. Cromoforo es el catión, tienen afinidad por estructuras celulares con carga negativa. Ej. Cristal Violeta, Safranina, azul de metileno, Fucsina básica fenicada. El proceso de tinción supone una reacción de intercambio iónico entre el colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la célula. Mordente. Sustancia o metodología que permite reforzar la unión del colorante-sustrato. TINCIONES. Tinción vital: Emplea un colorante en un organismo vivo. Tinción no vital: Emplean colorantes sobre células muertas. Tinción supravital: Emplean colorantes en células vivas aisladas de su contexto biológico. Tinción simple. Se adiciona un solo colorante informa morfología y agrupación de los microorganismos. Tinción selectiva: Tinción de Schaeffer: Ayudan en la identificación de las endosporas, las cuales son estructuras ovaladas o esféricas con el material necesario para la supervivencia de la bacteria, puesto que corresponden a estructuras muy resistentes gracias a su cubierta exterior constituida por queratina, su estado deshidratado, así como las proteínas protectoras de DNA. La ubicación de la endospora dentro de la bacteria ayuda a la diferenciación, ya que se puede encontrar en la zona terminal (en un extremo), en la zona subterminal (cerca de un extremo) y en la zona central (en el medio). Su proceso de maduración está precedido por la lisis de la pared celular, lo que genera la muerte de la célula y la liberación de la endospora. Por todas estas características, estas estructuras son muy complicadas de teñir, por lo que se debe de calentar la preparación con la muestra para permeabilizarlas. El colorante utilizado en esta tinción es el verde de malaquita, el cual se introduce a la endospora a partir de la emisión de vapores de la preparación (siendo este el paso más importante en la preparación de la tinción), tiñendo a las endosporas de color verde. Después de la exposición a los vapores, se realiza un lavado y se agrega un colorante de contraste, en este caso safranina, el cual tiñe a las células de rosa. 1. Calentar muestra 10min vapores y no dejar que seque el colorante porque se cristaliza, verde de malaquita. 2. Lavar. 3. Colorante safranina, 4. lavar. 5. secar y observar. Tinción diferencial: Tinción de Gram: Fue desarrollada por Hans Christian Gram en 1884. Está fundamentada a partir de la pared celular de las bacterias, donde las bacterias catalogadas como Gram negativas poseen una capa gruesa de peptidoglicano y una membrana externa, mientras que las Gram positivas solamente poseen la capa de peptidoglicano, sin la membrana externa. Al realizar este tipo de tinciones, lo primero que se debe de realizar después del frotis es agregar el colorante primario cristal violeta, el cual posee una gran afinidad al PG, después de dejarlo reposar y de realizar un lavado, se agrega un mordente llamado lugol, el cual evita la salida del colorante, gracias a la formación de un complejo cristal violeta-yodo, el cual será retenido con más fuerza en las bacterias de tipo Gram positivas (tiñéndose de color violeta), por la cantidad de PG que contienen en su pared celular. El paso siguiente al lavado del lugol es agregar una mezcla de alcohol-acetona, la cual destruye la membrana externa de las Gram negativas, puesto que es soluble a disolventes orgánicos. Finalmente, después de lavar la mezcla de alcohol-acetona, se agrega la safranina, que se encarga de teñir las bacterias que no retienen el complejo cristal violeta-yodo, es decir, las bacterias Gram negativas (tiñéndose de color rojo). Punto crítico. Decoloración: Alcohol-acetona deshidrata la pared celular de G+, reduciendo su permeabilidad e impidiendo la salida de cristal violeta. en bacterias G- disuelve lípidos de la membrana y la capa delgada de PG no retiene el complejo y la célula se decolora. 1. Frotis. 2. Cristal violeta 1 min. 3. Lavado con agua. 4. Lugol 1 min.  5. Alcohol acetona. 10-15 s 6. Safranina. 45 s. Nombre Gram - /+ Agrupación y Microscopio tamaño. Klebsiella Gram - Bacilos cortos pneumoniae. Sin agrupación. 1 µm de longitud por 0.35 µm de ancho Escherichia coli Gram - Bacilos largos En pequeños grupos o solas. Pseudomonas Gram - Bacilo recto o aeruginosa. ligeramente curvado. Individual o pares Bacillus subtilis Gram + Forma esporas. Bacilos Tamaño entre 0.7 y 0.8 µm Staphylococcus Gram + Forma de cocos aureus Agrupación en racimos Tamaño entre 0.8 y 1.5 µm de diametro. Lactococcus lactis Gram + Cocos agrupados en pares y cadenas cortas. longitud de 0.5 a 1.5 um. Tinción diferencial: Ziehl-Neelsen. Permite distinguir entre dos tipos de bacterias, aquellas que pueden resistir a la decoloración alcohol ácido (los Bacilos Ácido Alcohol Resistentes, BAAR) y las que no. Esta tinción se basa en colocar fucsina en la muestra, calentar ligeramente la preparación para solubilizar los lípidos y ácidos grasos de la pared celular para que se permita el paso libre del colorante, el cual posee una gran afinidad por los ácidos micólicos de la pared. Al enfriar con agua, estos componentes se solidifican, resistiendo la acción del alcohol-ácido, y usando el azul de metileno para la contratinción. Una tinción de tipo positivo se aquella en la que se observan los BAAR de color fucsia. Las bacterias no BAAR se presentan de color azul. 1. Frotis. 2. Poner las láminas en el soporte de coloración. 3. Fucsina de Ziehl 4. Calentar las láminas por 5 minutos, permitiendo la salida de vapores y evitando la ebullición de la fucsina. 5. Escurrir y lavar láminas con agua. 6. Decolorar láminas con solución de alcohol ácido hasta que sea completamente clara. 7. Lavar con agua 8. Colorar con azul de metileno 1 min 9. Lavar con agua 10.Secar Nombre BAAR +/- Agrupación y Microscopio tamaño. Staphylococcus BAAR - Cocos aureus Agrupación en racimos Tamaño entre 0.8 y 1.5 µm de diámetro. Mycobacterium sp. BAAR + Bacilos ej. M. leprae. ligeramente M. tuberculosis. curvados M. avium. Tamaño de entre M. Kansassi. 0.2 y 0.7 µm Nocardia sp. BAAR + Bacilos Tinción negativa: Se utiliza en la identificación y evaluación de estructuras individuales, como lo puede ser la cápsula bacteriana. Para realizar esta tinción se debe de colocar una gota de la muestra en un portaobjetos, después se agrega el colorante, y se observará sin necesidad de fijación. Entre los colorantes utilizados se encuentra la tinta china, la cual tiñe el fondo de la muestra de un color oscuro que permite observar el contorno de la cápsula de las bacterias observadas. Entre las dificultades que tiene esta técnica se encuentra la falta de nitidez y detalle en las imágenes de los componentes de las estructuras, además de que ciertos microorganismos tienden a contraerse durante el periodo de secado. Asimismo, si no se realiza una tinción del campo con el colorante utilizado de manera correcta, no se podrá observar de manera adecuada la imagen.