FC12b Enzymologie Past Paper PDF

Enzymologie Professeur : GONZALO FC N°12b DATE : 26/09/2023 0 SOMMAIRE I. CONSTITUANTS DES REACTIONS ENZYMATIQUE (SUITE) ......................................................................................................... 1 1. CO-FACTEURS........................................................

Enzymologie Professeur : GONZALO FC N°12b DATE : 26/09/2023 0 SOMMAIRE I. CONSTITUANTS DES REACTIONS ENZYMATIQUE (SUITE) ......................................................................................................... 1 1. CO-FACTEURS......................................................................................................................................................................... 1 A. Les ions métalliques ....................................................................................................................................................... 1 B. Molécules complexes : les coenzymes ............................................................................................................................. 1 II. DESCRIPTIONS DES REACTIONS ENZYMATIQUES .................................................................................................................... 6 1. ÉQUILIBRE REACTIONNEL ........................................................................................................................................................... 6 2. NOTION DE VITESSE INITIALE ....................................................................................................................................................... 7 3. INFLUENCE DE LA CONCENTRATION DE L’ENZYME SUR LA VITESSE DE REACTION ........................................................................................ 9 4. NOTION D’ACTIVITE ENZYMATIQUE............................................................................................................................................. 10 5. INFLUENCE DE LA CONCENTRATION DU SUBSTRAT SUR LA VITESSE DE LA REACTION .................................................................................. 10 6. ÉVOLUTION DE VI EN FONCTION DE [E] ET DE [S] ........................................................................................................................... 11 III. ÉTUDE DES ENZYMES ........................................................................................................................................................... 12 1. LES LOIS ET EXPRESSIONS DES GRANDEURS THERMODYNAMIQUES ....................................................................................................... 12 A. Les 3 lois de la thermodynamique................................................................................................................................. 12 IV. ORIGINE DE L’ENERGIE EN CHIMIE ET BIOCHIMIE ................................................................................................................ 14 Contenu des cours d’enzymologie : • • • Des cours magistraux : généralités, thermodynamique : équilibre et catalyse, approche cinétique et inhibition, modalités de régulation Un enseignement dirigé : entraînement au concours avec correction d’annales et réalisation d’exercices types Un polycopié d’exercices corrigés I. Constituants des réactions enzymatique (suite) 1. Co-Facteurs • Un cofacteur n’est pas l’enzyme lui-même, mais est indispensable à l’accélération de la réaction par l’enzyme. COFACTEURS • Les cofacteurs se lient sur un site spécifique de l’enzyme caractérisé par : o Son affinité Site spécifique o Sa spécificité o Sa saturabilité o Les phénomènes de compétition Indispensable • Certains enzymes agissent seuls, alors que d’autres nécessitent la présence d’un cofacteur. Dans ce cas-là, le cofacteur est indispensable à l’activité et/ou à la structuration de l’enzyme. • Toutes ces propriétés permettent de définir la spécificité de l’enzyme. Apoenzyme = partie protéique de l’enzyme Holoenzyme = enzyme complet : apoenzyme + cofacteur A. Les ions métalliques • Ces composés peuvent être toxiques à haute dose. B. Molécules complexes : les coenzymes • Ces molécules sont souvent des dérivés de vitamines (thiamine pyrophosphate, FAD, NAD, phosphate de pyridoxal, coenzyme A, biotine...). Elles doivent être apportées par l’alimentation. Les réactions qui utilisent des coenzymes identiques ont des mécanismes réactionnels identiques • (Les déshydrogénases utilisent du NAD et du NADH et font des réactions de déshydrogénation avec des mécanismes similaires) 1 On différencie deux genres de coenzymes différents : les coenzymes liés et les coenzymes libres. • Enzymes ont intérêt médical = réaction concertée qui vont vites et marchent facilement • Cas de carence vitaminique transaminases ne marchent pas car pas de vitamine 2 COENZYME LIÉE = Groupements prosthétiques • Subisse transformations au cours de la réaction mais reste non-modifié à la fin. o Nécessité d’un cycle réactionnel régénérant à la fin le coenzyme sous sa forme initiale. • Provient d’une vitamine (B6 ou adermine) Exemple : le phosphate de Pyridoxal o Le squelette de cette vitamine est un noyau Pyridoxamine (en bas à gauche sur l’image) avec un Azote ayant la particularité de former un ammonium ou d’avoir un doublet électronique on aura ainsi la capacité à réaliser une aromatisation. o D’où l’intérêt de ce cycle pyridine à pouvoir délocaliser des électrons et de réaliser des réactions concertées (Réactions vues dans les chapitres sur le métabolisme). o Ce sont les propriétés de mésoméries qui sont mises en avant dans les Transaminases • Très importantes dans le métabolisme car permettent la transformation des aminoacides en acides alpha-cétonique comme le pyruvate. Les Transaminases • Essentiel de notre alimentation au départ était basé sur cueillette et chasse qui nous permettent de produire des sucres ou des dérivés sucrés on a donc transformé le squelette de l’aminoacide au métabolisme énergétique pour permettre de produire de l’énergie en intermédiaire de ce métabolisme. • En prenant l’exemple de l’Alanine, en enlevant le groupement Azoté, on obtient du pyruvate qui peut être intégré au Cycle de Krebs par exemple. Le CoEnz de cette réaction est le phosphate de Pyridoxal et catalysée par la TGP ou ALAT. o ALAT est dosé en laboratoire car cette transaminase hépatique est un marqueur hépatique qui si elle se retrouve dans le sang dénote un trouble au niveau du foie o On peut donc convertir le phosphate de pyridoxal en phosphate de pyridoxamine qui est un CoEnz lié qui doit revenir à l’état de phosphate de pyridoxal en accueillant l’alpha-cétoglutarate qui est lui aussi un acide alpha-cétonique qui va récupérer l’amine du phosphate de pyridoxamine fabriquant ainsi du pyruvate. 3 • On les appelle réactions ping-pongs dû au 2 sens entre ces réactions qui transforment une première fois le CoEnz et qui le ramène à l’état initial à la fin de la seconde réaction. Ici on un sens dans lequel on fabrique de la glutamine au niveau des muscles et un sens dans lequel on refabrique de l’alphacétoglutarate au niveau du foie. Les Transaminases transforment les aminoacides en acides alpha-cétonique via des réactions concertées qui se font facilement COENZYME LIBRE • Détachés de l’enzyme à chaque cycle = Co-substrats • Régénération par d’autres réactions : ils s’attachent transitoirement (avec une faible affinité) et sortent du cycle réactionnel modifiés (ils ne sont pas régénérés, d’autres réactions vont les prendre en charge pour les régénérer) • Ex : NADH pour les réactions d’oxydo-réduction Exemple : le NAD(P)+ (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) • 2 sucres riboses reliés par une liaison phosphodiester, et sur un sucre l’adénine, sur l’autre la vitamine PP (la vitamine PP est la seule partie active de l’enzyme) • NAD = métabo (Désyhydrogénases) énergétique • Le NADP, lui, participe aux mécsa de E de molécules complexes (compléter) pas le métabo général énergétique car se lie pas sur les mêmes récépteurs • En haut à gauche : NAD+ = forme oxydée Exemple avec de l’Alcool Déshydrogénase (réaction d’oxydoréduction) • En haut à droite : l’alcool qui est une forme réduite. De façon naturelle il a tendance à devenir un aldéhyde (forme + oxydé) puis un acide carboxylique (forme encore + oxydé) • Mécanisme : o Le NAD+ réagit avec l’éthanol. Le NAD+ attrape le doublet électronique d’un des hydrogènes de l’éthanol. Il bascule donc à l’état réduit (car il a récupéré 2 électrons). L’arrangement donne naissance à du NADH qui a une stabilité plus importante car elle est aromatique. 4 • Pour l’alcool, l’éthanol a perdu son doublet électronique, il est donc oxydé et va subir un réarrangement pour donner naissance à un carbonyle puis un aldéhyde. 5 II. Descriptions des réactions enzymatiques 1. Équilibre réactionnel • Dans le modèle simplifié, on a un substrat (S) et un produit (P). L’enzyme est capable de transformer aussi bien S en P que P en S. L’équilibre thermodynamique (Keq) est obtenu quand, à l’état final, un substrat S est en équilibre avec un produit P. Keq= [P]finale / [S]finale Avec [P]finale la concentration finale en produit Et [S]finale la concentration finale en substrat • Si [P]/[S] ≠ Keq il y a une évolution. • Les réactions peuvent être : o Déplacé Keq ≠ 1 : Vitesse d’évolution constante et mesurable à tout moment. Équilibre thermodynamique • Équilibré Keq = 1 : Beaucoup plus complexe, leur vitesse va varier au cours du temps. • Dans les réactions réversibles, on parle d’un équilibre dynamique où il y a autant de transformation du substrat en produit que du produit en substrat (le produit peut donc devenir substrat), • Cet équilibre va être atteint en un temps variable (pour certaines réactions extrêmement lentes la demi-vie peut atteindre des millions d’années). o La Keq elle nous dit simplement ce qui se passera quand l’équilibre sera atteint. • Ce qui nous intéresse ici c’est la vitesse à laquelle on atteint les équilibres car en réalité la catalyse correspond à l’accélération des vitesses de réaction. Quand on atteint Keq, la réaction n’évolue alors plus. L’équilibre thermodynamique ne dépend pas de la vitesse de réaction, mais seulement du rapport de concentration. • Simplification : choix de conditions où : P → S = 0 (utilisé dans la réaction de Michaelis-Menten, pas de réversibilité). Description d’une réaction • Pour ne pouvoir mesurer que cette transformation, soit : o La réaction très déplacée sur le plan thermodynamique favorable à la transformation de P ([P] ne modifie pas la vitesse de réaction). o La réaction est équilibrée mais mesurée en absence de P et pendant un temps bref : [P]f/[S]i < 5% à l’état final = condition de vitesse initiale. 6 2. Notion de vitesse initiale • On suit la transformation S → P au cours du temps. • V est maximale et constante • Vi caractérise un système avec [E] et [S] données • Domaine de mesure de la vitesse initiale = phase stationnaire 4 PHASES DE REACTION • La réaction est un peu lente, elle ne commence pas à sa vitesse d’équilibre : Équilibre cinétique. • On n’obtient pas tout de suite la vitesse la plus élevée. 1° Phase : Pré-stationnaire • Moment qui correspond à l’activation de l’enzyme. • Existe pour certains enzymes et pas pour d’autres pour se protéger contre une dégradation possible des co-enzymes (TransAminases parfois 1 min de phase pré-stationnaire) ➔ [ES] augmente • La vitesse de formation du P est constante. 2° Phase : Stationnaire • On peut mesurer la pente de la courbe pour obtenir Vi (Vitesse initiale) qui apparait après la phase pré-stationnaire. ➔ [ES] est constante • [EP] et le P apparaissent dans le milieu. • La concentration en S et [ES] diminuent car l’enzyme retransforme P S. 3° Phase : Ralentissement • Donc la vitesse de transformation de S P ralentie. • On ne peut plus mesurer la vitesse car elle est inconstante. ➔ [ES] et [S] augmentent ➔ [EP] apparait 4° Phase : Équilibre • Il se forme et se détruit autant de P que de S : c’est l’équilibre dynamique, on à autant de transformation S → P que P → S, la vitesse apparente est alors nul. ➔ [P]/[S] = Keq 7 MESURE DES VITESSES DE REACTION • On suit la disparition du substrat ou l’apparition du produit (celui qui est le plus facile à mesurer. Mesure directe des vitesses de réaction • VI (vitesse initiale) : vitesse que on peut mesurer en début de réaction quand il y a uniquement la transformation S → P. • Elle dépend de la concentration du complexe Enzyme/Substrat et est proportionnelle à l’activité de l’enzyme.  Utilisation de réactions secondaires si, ni S, ni P ne peuvent être caractérisés • Exemple de la créatine kinase (on ne peut pas suivre chimiquement la créatine kinase et l’ATP) o Rx 1 principale : Créatine phosphate + ADP → Créatine + ATP → par la créatine kinase o Rx 2 auxiliaire : ATP + Glucose → ADP + G6P → par l’hexokinase o Rx 3 indicatrice : G6P + NADP+ → D-Gluconolactone-6P + NADPH,H+ → par la G6P-déshydrogénase o Enfin on mesure l’apparition du NADPH,H+ à 340 nm Mesure indirecte des vitesses de réactions • NAD+ : forme oxydée • NADH : forme réduite • Il existe une aromaticité et une conjugaison des doubles liaisons dans le NADH qui entraine une absorption spécifique à 340 nm (qui n’existe pas dans la forme oxydée) 8 3. Influence de la concentration de l’enzyme sur la vitesse de réaction On garde le substrat fixe et on fait varier les différentes concentrations d’enzymes. • Sur le schéma de gauche : pour E2 on a 2 fois plus d’enzymes et on mesure la vitesse V2 plus grande. • On observe toujours le même profil avec les 4 phases (pré-stationnaire, stationnaire, de ralentissement et d’équilibre). • On mesure la pente de la courbe pour déterminer les Vi pendant la phase stationnaire. Analyse du graphique • Pour savoir si on a une relation de proportionnalité on trace la vitesse en fonction de la concentration d’enzyme. La vitesse est proportionnelle à la concentration en enzyme. • Quelle que soit la concentration en enzyme on obtient toujours la même concentration en produit. • On en déduit que plus il y a d’enzymes plus la constante d’équilibre thermodynamique est atteinte rapidement. Exemple avec ASAT • 1° réaction principale : Par ASAT o Asp + 2-oxoglutarate → oxaloacétate + Glu • 2° réaction indicatrice : permet de suivre la réaction par MDH o Oxaloacétate + NADH, H+→ L-malate +NAD+ o on suit la baisse d’absorbance a 340 nm 9 4. Notion d’activité enzymatique • On observe une proportionnalité entre activité de transformation de l’enzyme et la concentration : o On peut donc définir une activité enzymatique. • Le problème de ces observations c’est qu’on ne connaît pas la concentration d’enzyme. Définition de l’activité enzymatique o On sait qu’il y en a 2 ou 3 fois plus donc on a une concentration relative mais non absolue. o Les enzymes sont en très faible quantité donc impossible à quantifier. • On parle donc d’activité de transformation= activité enzymatique. Son unité est le katal. 1 katal est la quantité d’enzyme catalysant la transformation de 1 mole de substrat en 1 sec. Unité et conversion • En pratique on utilise des nanokatal/mL ou l’ex-unité usuelle (U : Correspond à la quantité d’enzyme catalysant la transformation d’une micromole de substrat en une minute) • Conversion : 1U = (1/60) x 1000 nkatal = 16,666 nkatal o LDH = 1 nkatal/mL : 1mL de sérum contient une quantité d’enzyme pouvant transformer 1nmol de pyruvate en 1nmol de lactate en 1 seconde. 5. Influence de la concentration du substrat sur la vitesse de la réaction • Cette fois on garde la quantité d’enzyme fixe et on étudie la variation de la quantité de substrat en fonction de la vitesse. • On mesure la phase 2, c’est-à-dire en phase stationnaire, où la vitesse est proportionnelle au temps mesuré. • On rapporte les pentes sur le graphe 2. Il n’y a pas de relation de proportionnalité entre la concentration et le substrat. • Avec beaucoup de substrat, la vitesse n’augmente plus et tend vers une Vmax. • Au-delà d’une certaine quantité de substrats, on sature le pouvoir catalytique de l’enzyme. 10 • C’est une fonction hyperbolique qui est modélisé par l’équation de Michaelis et Menten. • Lorsque la vitesse d’interaction statistique augmente on obtient donc la vitesse d’interaction • Maximum : la vitesse de la réaction dépend de la vitesse de la transformation au sein de l’enzyme, c’est ce que l’on appelle la constante de vitesse catalytique. 6. Évolution de Vi en fonction de [E] et de [S] S ½ = concentration de substrat pour obtenir la moitié de la vitesse maximale. • Cette fois on veut observer spécifiquement l’évolution de la Vmax en fonction de la concentration d’enzyme. • On observe que plus on met d’enzyme plus vite on atteint Vmax (schéma de gauche). Puis on modélise une équation de Vmax en fonction de la concentration en enzyme et on observe une relation de proportionnalité (schéma de droite). • Pour ces expériences on a utilisé des concentrations saturantes en substrat pour mesurer des vitesses dans le but de calculer des concentrations enzymatiques. • L’avantage est qu’on a très peu d’incertitude liée à la concentration du substrat : on a assez de substrat pour calculer la vitesse initiale. Lorsque [S] > 10[S]1/2 la vitesse est proche de Vmax : on est en conditions saturantes. 11 III. Étude des enzymes • Les enzymes accélèrent la vitesse des réactions. Cependant, elles ne modifient pas les équilibres des réactions. Cela signifie que Keq ne change pas avec l’ajout d’enzyme, l’équilibre est seulement atteint plus rapidement. Ce sont des catalyseurs biologiques. La thermodynamique à atteint son point d’achèvement il y a maintenant plus d’un siècle. 1. Les lois et expressions des grandeurs thermodynamiques • Pour expliquer le fonctionnement des enzymes on utilise la thermodynamique, elle permet d’expliquer : o L’origine et le sens des équilibres réactionnels (c’est le deuxième principe de thermodynamique) o Le rôle de la catalyse (notion d’état de transition et d’énergie d’activation) o Le rôle des remaniements de conformation des enzymes (cycle catalytique) = mécanisme par lequel les enzymes réalisent la catalyse. Les enzymes réalisent cela grâce à une flexibilité interne due au fait qu’elles sont des macromolécules. o Le concept de liaison riche en énergie (découvert à partir du coenzyme A) A. Les 3 lois de la thermodynamique 3 LOIS DE LA THERMODYNAMIQUE • Traite de l’équivalence des formes d’énergie (chimique, thermique, lumineuse, mécanique). Représente la possibilité de transformer les énergies sous différentes formes. 1ère loi Loi de Carnot • En Chimie cela nous explique ou est l’énergie : elle se situe dans les liaisons, dans les électrons. Les formes isolées sont plus instables que les formes réunis par des liaisons. • Ne donne aucune information sur la vitesse de transformation ni sa direction ni la capacité à stocker ou à utiliser les énergies échangées. Besoin de la 2ème loi pour ça. • Exemple du micro sur la table : le micro est posé sur la table, je fais un certain travail pour soulever celui-ci, une certaine énergie est donc mobilisée (énergie potentielle) je laisse retomber mon micro, il retombe sur la table, l’énergie est alors récupérée lors qu’il rencontre à nouveau la table. • Caractérise les réactions favorables ou non sur le plan thermodynamique. • Une réaction évolue toujours vers le plus petit potentiel d’énergie (=état le plu stable), appelé le sens « spontané » → permet donc de prédire le sens des réactions 2nde loi Loi de Gibbs • Utilisation de l’énergie libre de Gibb, symbolisé G. Comparaison de l’état final à l’état initial : ΔG=Gf-Gi →Si G est négatif la réaction est favorable = exergonique →Si G est positif la réaction est défavorable = endergonique • Illustration schématique : 12 • Exemple : piste de ski. Si évolution libre d’une bille = retrouvée au point le plus bas, là où l’énergie potentielle est la plus basse. o Possibilité que la bille se retrouve dans une crevasse. Correspond à un état mal plié mais stable pour la protéine. Pour continuer à avancer obligation de lui redonner de l’énergie. Soit : continue jusqu’en bas. Soit : retombe dans la crevasse (se replie mal). • L’enzyme peut donc redonner de l’énergie à la protéine (la faire sortir de la crevasse) mais en aucun cas ne sera un guide pour trouver la bonne conformation. La Valeur Moyenne de l’Oscillation à 37°C est de 1 Kcal/mol • Définit le 0 kelvin : le zéro absolu o « Quand un corps est parfaitement ordonné, il est à son niveau d’énergie le plus bas, il est à 0 Kelvin ». 3ème loi • Donc pas capable de donner de l’énergie à un autre corps • RAPPEL : 0°K = -273,16°C (valeur déterminée expérimentalement) • L’amplitude identique au °C : 100°C = 373,16 K 13 IV. Origine de l’énergie en Chimie et Biochimie ENERGIE ASSOCIEE AUX LIAISONS INTERATOMIQUES Stabilité d’un composé • Déterminée par ses liaisons covalentes. Si on veut casser une liaison il faut apporter de l’énergie. L’énergie des liaisons fortes est d’environ 100 Kcal/mol. • D’autre part on a les liaisons faibles. • Les liaisons faibles, et en particulier les liaisons ioniques, peuvent avoir un gros potentiel d’énergie, autant que les liaisons covalentes. (liaison fortes) Attention • Ce qui caractérise une liaison faible n’est donc pas son énergie mais sa capacité à être facilement remplacée. • Une liaison corresponde à une stabilisation par rapport à un atome isolé. • Une transformation chimique s’explique par la création et la destruction de nombreuses liaisons fortes. • Exemple de la glycolyse : Glucose + Oxygène. On détruit des liaisons pour en recréer d’autres. Transformation chimique et énergie • Quelques valeurs d’énergies de liaison en kcal/mol : o O-H = 99 O = O =119 C=O = 192 • L’oxydation du glucose a un ΔG0= -686 kcal/mol : C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O • C’est l’énergie des liaisons qui alimente le système. Le ΔG0 est négatif donc favorable sur le plan thermodynamique. Pourtant quand on met de l’oxygène avec du glucose on n’observe rien. Elle est favorable mais pas observable (attention ambiguïté). Cela s’explique par le fait qu’on a une barrière énergétique à franchir. • La Prédiction de l’évolution de la réaction pour [S] et [P] quelconques 𝑃1 × 𝑃2 × 𝑃3 … ∆𝐺 = −2,3 × 𝑅𝑇 × 𝑙𝑜𝑔𝐾𝑒𝑞 + 2,3 × 𝑅𝑇 × log 𝑆1 × 𝑆2 × 𝑆3 … Nous permet de visualiser l’évolution de ∆𝐺 au cours de la réaction jusqu’à ce qu’on atteigne Keq soit le moment ou ∆𝐺 = 0. Pour que la réaction ait lieu il faut être le plus loin possible de l’équilibre La valeur de ΔG0 sert à comparer la force relative des réactions, la variation d’énergie libre standard est normalisée pour [S] et [P] = 1M 𝚫𝑮𝟎 = − 𝟐, 𝟑 × 𝑹𝑻 × 𝒍𝒐𝒈𝑲𝒆𝒒 14