Cours 3 Biologie Moléculaire BIO1101 PDF

Biologie moléculaire BIO1101 Session automne 2024 Rim Marrakchi [email protected]  Chapitre 3: La réplication 3.1. Le Cycle cellulaire eucaryote 3.2. L’ouverture de la double hé...

Biologie moléculaire BIO1101 Session automne 2024 Rim Marrakchi [email protected]  Chapitre 3: La réplication 3.1. Le Cycle cellulaire eucaryote 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine 3.5. La réplication des extrémités de réplication et hélicase a) Chez les procaryotes a) Origine de réplication b) Chez les eucaryotes b) Chez les procaryotes c) Chez les eucaryotes 3.6. Le séquençage d) Hélicase et topoisomérases a) La méthode Sanger b) Banque génomique 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la c) Automatisation polymérase et ses particularités d) L’assemblage 3.4. La coordination des événements 3.7. PCR a) Le réplisome chez E. coli b) Chez les eucaryotes 3.1. Le Cycle cellulaire eucaryote Le cycle de division cellulaire (CDC) a 4 phases : o La phase S (réplication d’ADN) se situe entre 2 phases « gap », Interphase o Les phases G1 et G2. o La phase M (mitose + cytokinèse) Durant le CDC, le noyau subit des changements majeurs ainsi que l’ADN qu’il contient: la disparition-reconstruction du noyau, la réplication et la condensation d’ADN en chromosomes mitotiques, la séparation des chromatides sœurs. 3.1. Le Cycle cellulaire eucaryote Au microscope, les 5 phases de la mitose peuvent être distinguées. * Certains auteurs divisent la prophase en précoce et tardive. correspondance: prophase = p. précoce prométaphase = p. tardive 3.1. Le Cycle cellulaire eucaryote est-ce qu'on a assez d'énergie? L'environnement est-il favorable Est-ce que tout l'ADN est répliqué ? Tous les dommages à l'ADN sont-ils réparés ? Tous les chromosomes sont-ils correctement attachés au fuseau mitotique 3.1. Le Cycle cellulaire eucaryote Les signaux du cycle cellulaire: Cdk (cycline dependant kinase) et cyclines enzyme qui phosphoryle d'autres protéines se lie activé Phosphoryle (active) différentes protéines nécessaires à la réplication d’ADN. 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase La double hélice d’ADN sert de matrice pour sa propre réplication: les nucléotides d’un “nouveau” brin sont insérés selon la complémentarité des bases avec le “vieux” brin – brin matrice.  Il est nécessaire d’ouvrir la double hélice initiale pour rendre accessibles ses 2 brins à la réplication. L’ouverture doit se faire dans les régions spécifiques, appelées origines de réplication (ORI).  Un organisme peut avoir une seule ORI par chromosome (procaryote) ou plusieurs (eucaryote). 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase a) Origine de réplication o Chez certains organismes, comme la levure, les ORIs sont des séquences précises (toujours les mêmes) riches en AT. o D’autres organismes dont l’humain, ne possèdent pas de séquence consensus (tous les ORI sont différents). o Un chromosome peut avoir plusieurs ORIs ce qui réduit le temps nécessaire pour la réplication. o Durant la phase S, chaque ORI s’ouvre (séparation du double brin d’ADN) et donne naissance à 2 fourches de réplication où travaillent plusieurs protéines responsables de la réplication. Chromosome procaryote (circulaire) Chromosome eucaryote (linéaire) Molecular biology of the cell, 4th Éd. 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase a) Origine de réplication La protéine initiatrice est la seule protéine dans la réplication qui reconnait une séquence spécifique de bases pour se lier à l’ADN. Les autres utilisent plutôt des interactions protéine-protéine et la reconnaissance de la forme générale d’ADN. La protéine initiatrice a 3 fonctions: o trouver et lier l’ORI o recruter d’autres protéines nécessaires à la réplication (formation d’un complexe d’initiation, hélicases) o chez certains organismes (procaryotes) ouvrir la double hélice de l’ORI La protéine initiatrice recrute 2 hélicases (enzymes spécialisées dans l’ouverture d’ADN). 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase a) Origine de réplication Réplicateur : ensemble complet des séquences suffisantes pour permettre l’initiation de la réplication. Origine de réplication: le site spécifique où commencent la séparation des deux brins et la réplication (riche en A:T). L’ORI fait partie du réplicateur. 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase b) Chez les procaryotes protéine initiatrice o DnaA lie spécifiquement les sites 9-mère. o Lorsque DnaA est liée à l’ATP, la protéine interagit aussi avec un site 13-mère, et ainsi permet la séparation de la double hélice et la libération de l’ADNsb. o Par la suite, DnaA aide à positionner l’hélicase qui poursuivra la séparation du db d’ADN. Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson  3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase c) Chez les eucaryotes o Le complexe de reconnaissance de l’origine de réplication (ORC), un complexe de six protéines o La liaison d’ORC au réplicateur n’aboutit pas à la dénaturation de l’ADN adjacent ( contrairement au DnaA) comprendre que tout ca arrive avec la phosphorylation Complexe Pré-réplicatif Complexe réplicatif Le passage de la phase G1 vers la phase S est marqué par l’activation des kinases dépendantes de cycline (Cdk).  Niveau élevé jusqu’à la fin de la division cellulaire, qui assure le passage du complexe pré-réplicatifs (pré-RC) vers un complexe actif et empêche la formation de nouveau pré-RC au niveau des réplicateurs. 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase c) Chez les eucaryotes La reconnaissance de l’origine de réplication chez les eucaryotes ne passe pas nécessairement par une séquence spécifiquement reconnue, mais plutôt par des motifs structurels impliquant :  Des séquences riches en AT ou en ilots CpG,  Une structure d’ADN particulière,  Des régions libres de nucléosomes,  Des régions impliquées dans l’initiation de la transcription. Les ORI ne sont pas déclenchées en même temps : Complexification en fonction du développement et des stress. Méchali (2010) Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10.1038/nrm2976 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase d) Hélicase et topoisomérases hélicase structure quaternaire, 6 sous unité ≡ enzyme hexamèrique en forme d’anneau qui entoure l’ADN simple brin et se déplace rapidement (1000 nt/sec) le long de la chaîne.  Son déplacement nécessite l’hydrolyse d’ATP et entraîne la séparation des brins.  Sa forme lui donne une haute processivité o Chaque sous-unité possède une boucle capable d’agripper la charpente d’un nucléotide (sucre-P). o Ces boucles fonctionnent comme 6 mains tirant sur une corde main par-dessus main et obligeant l’ADN à passer dans le pore central. o Ce pore est étroit et ne laisse passer qu’un brin d’ADN : force la séparation du double brin. 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase d) Hélicase et topoisomérases Lorsque l’hélicase ouvre la double hélice, les protéines SSB (Single-Strand Binding proteins) s’attachent sur l’ADN monocaténaire tout en formant des liens entre elles (« cooperative binding » = consolidation). o stabilisent les 2 brins séparés de l’ADN matriciel jusqu’à la synthèse des nouveaux brins complémentaires. o empêchent la formation d’épingles par appariement de nucléotides complémentaires dans le même brin d’ADN. La formation d’épingles bloquerait la réplication. 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase d) Hélicase et topoisomérases L’hélice d’ADN fait un tour chaque 10 pb. Lorsque l’hélicase travaille, un surenroulement de l’ADN intervient: o L’enroulement supplémentaire d’ADN (“supercoils”) est une source de tension. o Les topoisomérases coupent et ressoudent le double brin pour enlever les supertours.  3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase d) Hélicase et topoisomérases o Topoisomérase I : coupe et ressoude un des brins d’ADN o Topoisomérase II : coupe et ressoude les deux brins d’ADN Koster et al. (2010) Cell 142,4, p519–530 Pommier (2006) Nature Reviews Cancer 6, 789-802 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase d) Hélicase et topoisomérases À chaque ORI il y a formation d’un “oeil” de réplication par des hélicases qui ouvrent la double hélice d’ADN (devant l’hélicase, se placent les topoisomérases et derrière l’hélicase, se fixent les SSB).  Une fourche de réplication à chaque extrémité d’un œil de réplication est le siège de l’élongation des nouveaux brins d’ADN. o Chez Escherichia coli, la vitesse de réplication aux deux fourches de réplication est d’environ 60 kb/min, ce qui permet de répliquer complètement le génome en moins de 30 minutes. o Le génome humain est ≈700 fois plus grand que celui d’E.coli, mais la vitesse aux fourches de réplication est ≈20 fois plus lente (2-3kb/min) 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités La synthèse de l’ADN est catalysée par une enzyme appelée ADN polymérase.  Elle a besoin d’une amorce présentant un 3’-OH libre commencer la synthèse d’un brin de novo La primase (ARN polymérase) est responsable de la synthèse de l’amorce : o Elle ajoute de courtes séquences d’ARN (env. 10 nt) sur le brin matrice. o Ces séquences seront ensuite utilisées comme référence par l’ADN polymérase pour synthétiser le reste du fragment. o Les ribonucléotides de l’amorce seront ensuite remplacés par des désoxyribonucléotides. 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités (+) Primase Hélicase Jacob E Corn, Jeffrey G Pelton & James M Berger Nature Structural & Molecular Biology 15, 163 - 169 (2008)  3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités Chaque amorce ARN créée est ensuite reconnue par le « sliding clamp loader » (chargeur de pince glissante) qui y installe un anneau coulissant et une ADN polymérase.  En présence d’ATP, le chargeur se lie à l’anneau et l’ouvre pour qu’il puisse le charger sur l’ADN. Après l’hydrolyse de l’ATP, il se dissocie du complexe. Enfin, l’ADN polymérase se lie à l’anneau et commence la réplication chargeur se lie, puis hydrolyser, se détache et laisse l'ADN se lie Le « sliding clamp loader » et l’ADN polymérase sont en compétition pour le site de liaison : une fois lié à la polymérase, l’anneau ne peut pas être lié de nouveau par le « sliding clamp loader » (2006) Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 751-761| doi:10.1038/nrm2022 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités Les clamps sont composés de plusieurs sous-unités identiques assemblées en forme d’anneau. Le trou central est suffisamment grand pour encercler la double hélice sans y toucher.  lie l’ADN au niveau de l’amorce, s’associe ensuite avec la polymérase et glisse avec elle.  permet de maintenir l’ADN polymérase sur le brin matrice Absence d’anneau ADN pol. se détache au bout de coulissant. 20 à 100 pb et s’éloigne ADN pol. se détache encore, Présence d’anneau mais son association avec coulissant l’anneau coulissant l’empêche de s’éloigner. La processivité de la polymérase augmente. 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités L’ADN polymérase synthétise le nouveau brin en ajoutant des desoxynucleosides-3-P complémentaires au brin matrice (dNTP). Ils sont toujours ajoutés à l’extrémité 3’ (OH) d’un nucléotide déjà en place (formation du lien phosphodiester).  L’ADN pol a donc besoin d’une amorce. une fois un nucléotide ajouté = irréversible Besoin d’énergie pour ajouter des nucléotides : o La rupture du lien avec le premier P pour former le lien phosphodiester avec la chaîne naissante o La rupture du lien dans le pyrophosphate libéré par la pyrophosphatase.  Il s’agit d’un processus couplé et le total de l’énergie émise permet une réaction irréversible! 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités Les ADN polymérases distinguent rNTP et dNTP: Bien que les rNTPs soient présents dans les cellules à des concentrations environ dix fois plus élevées que celles des dNTPs, ils sont incorporés à un taux plus de 1 000 fois plus bas.  Cette discrimination est due à l’exclusion stérique des rNTPs du site actif de l’ADN polymérase groupement 2’-OH qui n’a pas de place à l’intérieur de l’ADN pol. Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités Sélectivité cinétique: n’importe quel nouveau nt peut entrer dans l’ADN pol, mais seulement le nt qui arrive à faire un bon appariement avec le nt de la matrice est dans une bonne position pour permettre la catalyse de son P est alors adjacent à 3’-OH. Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités La forme de l’ADN pol ressemble à une main qui tient l’ADN avec 3 domaines : o la paume: site catalytique et vérification de l’appariement via le sillon mineur (ralentissement si erreur) o les doigts: plient l’ADN matrice pour exposer 1 nt à la fois et referment la main en cas du “bon” nt dans la paume o le pouce: aide à tout retenir ensemble en s’attachant à la charpente sucre-P (cela joue un rôle dans la processivité de l’enzyme) 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités Le site catalytique de la paume est formé d’ions métalliques (Mg2+ et Zn2+) qui permettent: o de favoriser l’interaction entre l’amorce et le nouveau nt en préparant l’O à « l’attaque » o de stabiliser le pyrophosphate produit en neutralisant les charges négatives Nouveau nt Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités La haute processivité de l’ADN pol  Cette enzyme ajoute 1000 nt/sec. Le nombre total des nt ajoutés avant qu’elle ne se détache (sa processivité) varie de quelques nt à 50 000 selon le type de la polymérase. perte de temps et d'énergie a force de s'attacher, se détacher puis se réattacher L’étape limitante est l’attachement de la pol sur l’ADN et donc pour accélérer le processus il faut la retenir!  Le complexe Clamp aide à maintenir la polymérase sur le brin matrice. Le Clamp est mis sur l’ADN par la protéine de chargement « Clamp loader ». 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités Taux d’erreurs bas de l’ADN pol :  Les erreurs dans l’appariement de nt sont rares (1/100 000), mais elles existent! L’activité exonucléase permet à l’ADN polymérase d’éditer les séquences d’ADN. Lorsqu’un nucléotide incorrect est ajouté : o la «paume» ralentit la catalyse (une moins bonne interaction avec le sillon mineur), o la polymérase clive le nouveau lien et retire ce nucléotide.  Grâce à cela le taux d’erreurs passe de 1/100 000 à 1/10 000 000!  Le taux d’erreurs final est encore moindre (1/ 10 000 000 000) via la réparation de l’ADN post réplicative. Exonucléases: nucléases qui ne peuvent dégrader l’ADN qu’à partir d’une extrémité Endonucléases: nucléases qui peuvent couper l’ADN en cours de chaîne. 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités Un brin continu et discontinu par fourche: la conséquence d’un besoin en 3’-OH Brin continu (directeur, brin de tête, précoce, avancé, leading strand) : Brin qui peut être synthétisé en continu par l’ADN polymérase avec 1 amorce. L’ADN pol avance en même temps et dans la même direction que la fourche de réplication. Brin discontinu (brin de queue, tardif, retardé, en retard, lagging strand) La polymérase se déplace sur le brin matrice 3’ → 5’, s’éloigne de la fourche en synthétisant un court fragment d’ADN = fragment d’Okazaki. Au fur et à mesure que l’oeil de réplication s’agrandit, la synthèse d’un nouveau fragment démarre: plusieurs amorces. Fragments d’Okazaki. Procaryotes : longueur de 1000 à 2000 nucléotides Eucaryotes : longueur de 100 à 200 nucléotides 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités Remplacement de l’amorce d’ARN par l’ADN o La RNase H dégrade les hybrides ARN/ADN : Elle retire tous les nucléotides de l’amorce, sauf le dernier (car elle ne peut couper que le lien entre 2 ribonucléotides) o Une exonucléase 5’ retire le dernier nucléotide o L’ADN polymérase peut combler la brèche o L’ADN ligase peut attacher ensemble deux fragments d’ADN en reformant une liaison phosphodiester entre deux nucléotides adjacents. Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités Procaryotes ADN polymérase I Substitution des amorces (ADN pol I) ARN, réparation de l’ADN. Fonction exonucléase 5’ ADN polymérase III Réplication du chromosome (ADN pol III) Eucaryotes ADN pol δ Synthèse du brin discontinu de l’ADN ; réparation par excision de nucléotides (NER) et réparation par excision de base (BER) ADN pol ε Synthèse du brin continu de l’ADN, NER et BER ADN Pol α Synthèse des amorces pendant la (primase) réplication de l’ADN Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson 3.4. La coordination des événements Holoenzyme: terme général décrivant un complexe multiprotéique dans lequel une enzyme « noyau » est associée à des partenaires qui renforcent son activité. Les ADN polymérases travaillant sur chacun des brins à polymériser sont associées entre elles via le complexe de réplication ou réplisome.  Le réplisome avance dans le sens de la fourche de réplication, malgré le caractère antiparallèle de l’ADN. La coordination des événements chez E. coli (la mieux étudiée) : 2 ADN polymérases sont liées entre elles et forment un large complexe protéique nommé ADN pol III holoenzyme. Le brin discontinu est plié en boucle pour respecter la lecture de 3’ vers 5’ et la synthèse de 5’ vers 3’. L’holoenzyme + les autres protéines essentielles à la machinerie de réplication = réplisome debut 3.4. La coordination des événements a) Le réplisome chez E. coli o Les 2 polymérases sont maintenues ensemble par le clamp-loader et ce réplisome dernier leur fournit les clamps au fur et à mesure. o L’holoenzyme a des légères interactions avec l’hélicase : donne plus d’efficacité à l’hélicase (10x vitesse) et l’empêche de s’éloigner trop loin. o L’hélicase à son tour a des interactions avec la primase : Ces interaction déterminent la taille des fragments d’Okazaki: si les interactions sont fortes  la primase fait les amorces souvent et les fragments d’Okazaki sont plus courts (et vice versa). Finalement, une fois qu’un Okazaki a été complété par la polymérase, elle se détache de son Clamp et le clamp libre accueille la Rnase H (elle enlève l’amorce) et les enzymes suivantes.  Une fois l’Okazaki a été ressoudé, le clamp-loader enlève le clamp de l’ADN. 3.4. La coordination des événements a) Le réplisome chez E. coli image de ce qu'elle a dit précédemment DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2006.05.034 3.4. La coordination des événements a) Le réplisome chez E. coli Chez E. coli, action coordonnée de 2 ou 3 polymérases (selon les modèles) sur le brin continu et le brin discontinu Généralités sur les modèles: o Le brin discontinu forme une boucle d’ADNsb (recouverte par les SSB). o Les polymérases peuvent donc travailler de manière coordonnée sur les deux brins antiparallèles. o Quand l’ADN polymérase du brin discontinu termine la synthèse d’un fragment d’Okazaki (elle touche l’amorce du fragment précédent), elle se détache de sa matrice. o Elle reste toutefois toujours associée au réplisome et peut débuter la synthèse d’un nouveau fragment rapidement. Bruce Alberts (2003) Nature 421, 431-435 3.4. La coordination des événements b) Chez les eucaryotes o Les mêmes fonctions sont remplies par une plus grande variété de protéines et de complexes. o Les modifications post-traductionnelles (Cdk) dépendantes du cycle cellulaire assurent l’assemblage du réplisome. 3 polymérases distinctes Pol α, Pol δ, Pol ε Complexe protéique distinct du clamp loader assurant le maintien du réplisome. Clamp loader éjecté du complexe suite à l’association de l’anneau et de l’ADN. Zhang,D. & O'Donnell,M.,The Eukaryotic Replication Machine.The Enzymes,2016  les anciens sont recruter entre les nouveaux et l'ancien brin 3.4. La coordination des événements b) Chez les eucaryotes Les nucléosomes se réassemblent (les anciens) et s’assemblent (les nouveaux) aussitôt que la réplication produit des nouveaux brins. o Les «anciens» nucléosomes sont partagés entre 2 nouveaux brins («distributive inheritence»). o Les «nouveaux» nucléosomes sont recrutés par le clamp (indique un nouvel ADN) et s’assemblent entre les «vieux» à partir des intermédiaires solubles. La conservation des “anciens” nucléosomes permet de maintenir l’identité de la cellule. 3.4. La coordination des événements b) Chez les eucaryotes H2A-H2B quitte complétement des nucl.osomes et ensuite reviennent pour compétition. Le passage de la machinerie de réplication nécessite un désassemblage partiel des nucléosomes. o Les H3-H4 tétramères restent attachés et transfèrent sur un nouvel ADN après la réplication. Ils sont distribués de manière aléatoire entre les deux chromatides sœurs (mais une distribution conservative a été observée également). H3-H4 restent sur l'ancien brin et peut de la etre transferer au nouveau brin H3-H4: elles vont dans des séquences spécifiquent o Les dimères H2A-H2B quittent et se réassemblent après la réplication. Ils sont en compétition avec les “nouveaux”. 3.4. La coordination des événements b) Chez les eucaryotes L’ “ancien” H3-H4 tétramère reste attaché au réplisome et non à l’ADN directement. o Les protéines chaperonnes d’histones (Asf1, FACT) s’associent à l’hélicase (MCM). Elles gardent les histones lorsque la machinerie de la réplication passe et ensuite, elles les transfèrent sur le nouvel ADN db. o Le H3-H4 tétramère garde sa place initiale (se retrouve sur la même séquence d’ADN qu’avant la réplication), alors que le H2A-H2B se retrouve déplacé légèrement (dans les nucléosomes voisins). Il s’agit des hypothèses actuelles, le mécanisme complet n’est pas encore connu (les ‘?’ sur les schémas).  3.5. La réplication des extrémités a) Chez les procaryotes Séparation des chromosomes circulaires Quand la réplication d’un chromosome circulaire est terminée, les deux molécules filles restent liées comme deux maillons d’une chaîne. caténanes La séparation est assurée par une ADN topoisomérase de type II. Cette enzyme a la capacité de couper l’ADN db et de passer une deuxième molécule d’ADN db à travers cette coupure.  Cette réaction permet de séparer les deux chromosomes et de rendre leur ségrégation possible. Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène 3.5. La réplication des extrémités b) Chez les eucaryotes Les topoisomérases sont aussi nécessaires chez les eucaryotes : o Les topoisomérases I et II sont utilisées pour réduire la tension formée par l’avancée des fourches de réplication. o La convergence des fourches de réplication forme des caténanes qui doivent être résolues. Nature Reviews Molecular Cell Biology 18, 507–516 (2017)  3.5. La réplication des extrémités b) Chez les eucaryotes Les bouts des chromosomes linéaires Comme les ADN polymérases ont besoin d’une amorce, l’extrémité 3’ d’un chromosome linéaire ne peut pas être répliqué.  La dernière amorce sur le brin discontinu est excisée et la polymérase n’a pas de 3’OH nécessaire pour combler le vide.  Il en résulterait un raccourcissement progressif du chromosome à chaque génération cellulaire.  La solution réside dans les enzymes télomérases. Elles sont actives dans les cellules souches et dans les cellules germinales. Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson 3.5. La réplication des extrémités b) Chez les eucaryotes La télomérase ≡ une polymérase qui contient un ARN. Elle utilise sa partie ARN comme matrice pour allonger l’extrémité 3’ des chromosomes. Elle ajoute des nucléotides en 3’ d’un brin en formation. Elle fait des séquences répétitives (télomères) complémentaires à sa propre matrice.  Les télomères rallongent le bout 3’ et cet espace sert à faire un autre fragment Okazaki sur le brin 5’.  Le bout 3’ qui dépasse est protégé par une protéine ou il fait une boucle pour se « cacher ». 3.5. La réplication des extrémités b) Chez les eucaryotes La télomérase Boucle de rétrocontrôle négatif: plus le télomère est long, moins la télomérase est active  3.5. La réplication des extrémités b) Chez les eucaryotes La télomérase o Les télomères humains sont composés d’environ 10-15kb de la répétition TTAGGG. o Une portion de 50 à 300 nucléotides est laissée simple brin sur le brin riche en G. o La séquence répétée en double brin est reconnue par la protéine TRF2 qui assure le positionnement du complexe shelterin (protéines TIN2, TRF1, RAP1, TPP1). o La protéine protectrice des télomères (POT1) peut alors lier la séquence simple brin et assure, en partie, la formation de la T-loop. Permet de faire la différence avec un bris d’ADN et évite la réparation. 3.5. La réplication des extrémités b) Chez les eucaryotes La télomérase elle meme a une amorce Sans l’action de télomérases, on assiste à un raccourcissement progressif du chromosome à chaque génération cellulaire (vieillissement cellulaire).  Les télomérases sont actives dans les cellules souches et dans les cellules germinales.  Leur « activité » est programmée et change au fur et à mesure du développement. Ainsi, les cellules souches ont une limite de multiplication, au-delà de laquelle, les télomérases sont désactivées. ©2009 The Nobel Committee for Physiology or Medicine / Annika Röhl (Ausschnitt)  3.6. Le séquençage STOP Utilisation des principes (et les enzymes!) de la réplication pour séquencer le génome. Les défis du séquençage: o Savoir « comment » (la méthode Sanger et al., 1977) o Obtenir l’ADN sous forme manipulable, en petits morceaux (banques génomiques) o Capacité de grande échelle (automatisation) o Assembler et annoter les données (bio-informatique) Génome complet de E. coli K12 Blattner et al., 1997, Science 277:1453 3.6. Le séquençage a) La méthode de Sanger 1- Besoin de séquencer seulement 1 brin: dénaturation de l’ADN et le brin gardé devient le brin matrice. (L’ADN est extrait de plusieurs cellules, vous avez donc beaucoup de brins matrices) 2- Production d’1 amorce connue et radiomarquée (on en produit beaucoup) qui va être utilisée tout le long de l’expérience. 3- À partir de la jonction amorce-matrice l’ADN polymérase réplique l’ADN. 4- La réplication est arrêtée avec 1 ddNTP spécifique connu. 5- On recommence les étapes 3 et 4 plusieurs fois, toujours à partir de la même amorce et en arrêtant la réaction avec différents ddNTP. 3.6. Le séquençage a) La méthode de Sanger Même ADN brin matrice et même amorces Les étapes 3 à 5: o Séparation de l’échantillon en 4 tubes selon quel ddNTP est utilisé pour arrêter la réaction: ddATP, ddTTP, ddCTP ou ddGTP.  Dans chaque tube, on ajoute l’ADN polymérase et des dNTP normaux pour un court laps de temps. o Arrête la réaction avec ddNTP selon le tube. o Dénaturation et séparation par électrophorèse (la migration des fragments sur un gel grâce au courant électrique, comme dans le Southern). o Pour pouvoir observer les fragments, des amorces radiomarquées ou des ddNTP fluorescents peuvent être utilisés. 3.6. Le séquençage a) La méthode de Sanger Chaque position est lue et transcrit à la main... Chaque tube L’électrophorèse sur les 4 tubes nous permet de reconstituer la séquence (le brin complémentaire à la matrice) : (la séquence de l’amorce utilisée se situe avant le 5’)  3.6. Le séquençage b) Banque génomique La procédure décrite prend énormément du temps :  En 2 jours de travail, un chercheur peut séquencer environ 500 pb (sur 3x109 du génome humain).  Il faut segmenter l’ADN en multiples petits fragments exploitables. Construction d’une banque génomique: o L’ADN est isolé et fragmenté (coupé par des enzymes de restriction). o Les fragments sont insérés dans un vecteur plasmidique. o Les vecteurs sont transformés dans des bactéries (pour les multiplier de façon indépendante, clones). 3.6. Le séquençage c) Automatisation ici Deux améliorations de la technique ont permis la construction de Séquenceurs (Sequenator): o séparation des fragments d’ADN par une chromatographie sur colonne (dans un mince capillaire: les fragments les plus petits se déplacent plus rapidement et passent au détecteur en premier, toujours 1 fragment à la fois) au lieu d’électrophorèse. o Les ddNTP sont remplacés par ddNTP fluorescents. Résultat: les fragments polymérisés sortent de la colonne commençant par le plus petit et chaque fragment émet une couleur différente selon ddNTP-fluo (le détecteur transmet l’amplitude de chaque fluorochrome). 3.6. Le séquençage d) L’assemblage Une fois les fragments du génome ont été séquencés (et on s’assure que tout est là en séquençant 10X plus d’ADN que le génome contient: construction de 10 banques génomiques en utilisant des enzymes de restriction différentes), l’étape suivante est l’assemblage. Durant l’assemblage les séquences superposées permettent de déterminer l’ordre dans lequel les fragments doivent être placés car ca ne donne pas d'information sur l'ordre  La présence de régions répétées dans le génome rend le processus difficile. 3.6. Le séquençage d) L’assemblage elle a skip Le résultat final est annoté selon la présence des séquences dont on connait déjà la fonction dans cet organisme ou qui ressemblent à des gènes connus dans d’autres organismes. Séquence complète du chromosome 22 Dunham et al., 1999, Nature 402:489 3.7. PCR La PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne) est utilisée pour produire une grande quantité de copies d’une séquence d’ADN précise, à l’aide d’une ADN polymérase.  Cette séquence est délimitée par les amorces utilisées. Une version simplifiée de la réplication naturelle de l’ADN: o Le db est ouvert au complet par la dénaturation à une haute température 1 o Les amorces (synthétisées d’avance) sont hybridées à l’ADN à une température plus basse 2 o L’ADN pol utilisée est résistante aux hautes températures et son optimum se situe au-dessus de la température d’hybridation et en-dessous de celle de la dénaturation 3 (Taq polymérase: isolée de la bactérie Thermus aquaticus).  Il faut ajouter les dNTP dans le mélange.  Les variations de température sont contrôlées par un thermocycleur. 3.7. PCR Le choix des amorces est déterminant! Il faut concevoir deux amorces complémentaires à chaque bout 3’ de la séquence visée. Réaction en chaine Le nombre de cycles est programmé d’avance selon la quantité de copies d’ADN désirée.  Chaque cycle double la quantité initiale de molécules d’ADN. 3.7. PCR Les brins d’ADN nouvellement formés deviennent à leur tour ADN matrice et permettent l’augmentation exponentielle du nombre de produits (amplicons)  La majorité des produits ont cette forme (déterminée 3.7. PCR par les amorces), il s’agit de la séquence amplifiée. Résultats à la fin du cycle 5: 3.7. PCR 11 ; savoir le thermo... Le terme “produits” du PCR fait référence aux molécules finales délimitées par les amorces.  À partir de 5 cycles d’amplification, elles représentent la majorité des molécules synthétisées. Le nombre de produits dépend : o du nombre de cycles (n), o du nombre de molécules initiales d’ADN servant de matrice (x) o de la quantité de réactifs (dNTP, amorces, enzymes).  Dans les conditions optimales: (2n -2n)x. 1 molécule d’ADN amplifiée durant 3 cycles:  (23 -2*3)1 = 2 produits 1 molécule d’ADN amplifiée durant 5 cycles:  (25 -2*5)1 = 22 produits 3.7. PCR Applications PCR : Production des sondes pour les Southern et Northern (dans ce cas les dNTP utilisés durant la polymérisation peuvent être radiomarqués ou fluorescents) PCR + séquençage o Identification de polymorphismes (allèles): il existe plusieurs variantes d’un même gène dans une population d’individus. En amplifiant le gène d’intérêt et en le séquençant, il est possible d’identifier quelle allèle particulière porte un individu donné. Les polymorphismes sont utilisés pour identifier les criminels en comparant la séquence trouvée sur la scène du crime et la séquence homologue provenant d’un suspect. Les tests de paternité reposent sur le même principe. o Diagnostique d’infections: l’ADN trouvé dans un échantillon provenant d’un malade est amplifié avec des amorces spécifiques pour des gènes viraux ou bactériens. Cette amplification permet de détecter la présence du parasite. Par la suite, il est possible de l’identifier via le séquençage. o Diagnostiques anténataux: un échantillon d’ADN du fœtus est prélevé, les séquences clés sont amplifiées et analysées (détection des maladies héréditaires ou des anomalies chromosomiques). PCR + hybridation avec une sonde marquée : Recherche de séquences spécifiques dans les échantillons ayant peu d’ADN (non détectable sans PCR) 3.7. PCR Applications Expression génique: RT + PCR + électrophorèse ou marquage: Les ARNm d’un organisme sont isolés et ensuite rétrotranscrits en ADN à l’aide d’une rétrotranscriptase (RT). o RT-PCR: Qualitatif. Permet de détecter l’expression de gènes dans différents tissus. Les produits de la PCR sont visualisés par électrophorèse et cela permet de déduire grossièrement le niveau d’expression du gène en comparaison à un contrôle (plus d’ARNm = plus de matrices pour la PCR = plus de produits PCR = bandes plus grosses dans l’électrophorèse). o qPCR : Quantitatif. Utilisation d’un marqueur fluorescent permettant de suivre le niveau d’amplification de l’ADN en temps réel de manière beaucoup plus précise. L’obtention de la courbe d’amplification de la réaction de polymérisation permet d’obtenir une quantification absolue de la quantité initiale d’ADN. Aussi nommée PCR en temps réel. PCR + mutagénèse ou transgénèse o Le matériel amplifié est soumis aux agents mutagènes, cloné dans des vecteurs plasmidiques et réintroduit dans un organisme. o Les amorces sont porteuses de mutation(s) («site directed mutagenesis»)! o Une séquence d’un organisme est amplifiée, clonée dans des vecteurs et le plasmide est introduit dans un autre organisme (OGM).