Cours #1 Génome Structure Réplication PDF 2023-2024

10/09/2023 GÉNÉTIQUE, BIOLOGIE MOLÉCULAIRE 1 Cours #1: Génome: structure, réplication Sébastien Bloyer Fabrice Confalonieri Licence 2 2023-2024 V1_20141118 L'ADN support de l'information génétique Procaryotes : Bactéries : ADN double brin circulaire (Nucléoïde, plasmides) Eucaryotes : Noyau : ADN...

10/09/2023 GÉNÉTIQUE, BIOLOGIE MOLÉCULAIRE 1 Cours #1: Génome: structure, réplication Sébastien Bloyer Fabrice Confalonieri Licence 2 2023-2024 V1_20141118 L'ADN support de l'information génétique Procaryotes : Bactéries : ADN double brin circulaire (Nucléoïde, plasmides) Eucaryotes : Noyau : ADN double brin linéaire sous forme de chromosomes Mitochondrie : ADN double brin circulaire Chloroplaste : ADN double brin circulaire Virus, bactériophages : M13 : ADN simple brin circulaire SV40 : ADN double brin circulaire Parvovirus : ADN simple brin linéaire Adénovirus: ADN double brin linéaire 1 10/09/2023 Les plasmides - Molécule d’ADN double brins circulaire, ne possédant pas de capside et existant naturellement dans la bactérie. - Molécule indépendante du chromosome bactérien (extra chromosomique). - Se réplique dans la bactérie de manière autonome à partir de sa propre origine de réplication et en nombre de copies variable en fonction du type de plasmides. - Est porteur de gènes non essentiels à la bactérie hôte mais lui conférant une propriété particulière (exemple : la résistance à un antibiotique). - Est modifiable par des techniques de génie génétique. Les plasmides utilisés comme vecteurs ne sont pas «naturellement » transmissibles d’une bactérie à une autre. - Présente une structure tertiaire superenroulée. La mitose chez les eucaryotes Vue en TD: chaque cellule fille doit récupérer le patrimoine génétique de la cellule mère qu’il faut donc préalablement dupliquer 2 10/09/2023 Cycle cellulaire eucaryote et mitose Duplication de l’ADN Division Chez les Procaryotes: pas de mitose mais même principe chaque cellule doit récupérer un génome complet qu’il faut donc dupliquer 3 10/09/2023 • Organisation des génomes procaryotes et eucaryotes Procaryotes (Bactéries, Archées) Généralement un chromosome circulaire mais parfois - linéaire (Streptomyces) Eucaryotes Plusieurs chromosomes linéaires En une ou plusieurs copies (dépend du cycle de vie et de la ploïdie) - plusieurs réplicons (ex Deinococcus radiodurans : 4 réplicons ) Plusieurs copies du chromosome et des réplicons dans chaque cellule • La structure de l’ADN et ses conséquences 4 10/09/2023 Contexte: forme, taille, structure des génomes Taille Différentes formes d’ADN L S C Microscopie électronique de plasmides Comment répliquer l’ADN chez les procaryotes ? Etape 1: Initiation 5 10/09/2023 Origine de réplication chez les bactéries, virus et plasmides Incorporation in vivo d’un nucléotide radioactif et observation de l’origine de réplication au cours du temps par autoradiographie Réplication de l’ADN de ce virus double brin circulaire toujours au même endroit Même chose chez les bactéries et pour les plasmides Structure de l’origine de réplication bactérienne: OriC 245 pb L M R 1 2 3 4 13-mers, riches en A/T 9-mers ou « itérons » Structure conservée chez les bactéries Séquences divergentes 6 10/09/2023 DnaA protéine initiatrice chez les bactéries Fixation de la protéine DnaA Ouverture de la double hélice par une hélicase DnaB aidée de la protéine DnaC Protection et stabilisation de l’ADN simple brin par la protéine SSB (single-standed binding protein) Comment initier la réplication de l’ADN chez les eucaryotes ? Une seule origine également ? Non plusieurs ! 7 10/09/2023 Multiplicité des origines de réplication chez les eucaryotes Bactéries 106 pb Taille de l’ADN génomique Nombre d’origines de réplication Mammifères Un par chromosome ou plasmide 3.109 pb plusieurs milliers Notion de « Réplicon » = portion d’ADN dont la réplication dépend d’une origine de réplication donnée à un seul réplicon par chromosome ou plasmide chez les bactéries à plusieurs centaines à plusieurs milliers de réplicons chez les eucaryotes. Modalités du contrôle temporel des origines de réplication Chaque origine de réplication fonctionne au plus une fois par cycle cellulaire (phase S) Toutes les origines de réplication potentielles ne sont pas forcément activées Origine de réplication potentielle Origine de réplication effectivement active Origine de réplication répliquée passivement L’activation des origines de réplication est contrôlée de manière stochastique. 8 10/09/2023 Conclusion 1: Comment initier la réplication de l’ADN ? - Une origine unique chez les bactéries, virus et plasmides; plusieurs chez les eucaryotes. Chez les bactéries : - Une protéine se fixe à cette origine (DnaA) et permet la déstabilisation de l’ADN double brin à l’origine. - une hélicase (DnaB) couplée à une autre protéine (DnaC) va ouvrir l’ADN double brin en ADN simple brin de chaque coté de l’origine. - la forme simple brin est stabilisée par la protéine SSB qui protège également chaque brin d’ADN de la dégradation - Des protéines dont le rôle est similaire sont également présentes chez les eucaryotes (non décrites dans ce cours), le principe général est respecté Comment répliquer l’ADN chez les procaryotes ? Etape 2: Synthèse d’ADN 9 10/09/2023 La réplication est semi-conservative (Meselson et Stahl, 1958) H: Heavy (lourd) L: Light (léger) La réplication est semi-conservative (Meselson et Stahl, 1958) H: Heavy (lourd) L: Light (léger) 10 10/09/2023 Donc chez les eucaryotes après la phase S chaque chromatide est composée d’un brin d’ADN parental et d’un brin d’ADN néo-synthétisé Chez les Procaryotes: même chose ! chaque chromosome contient un brin parental et un brin d’ADN néosynthétisé 11 10/09/2023 Comment répliquer l’ADN chez les procaryotes ? Qui réplique l’ADN ? Une ADN polymérase ADN-dépendante Principales propriétés de l’ADN polymérase III bactérienne Une enzyme « multifonctionnelle » ADN Pol III Molécules par cellule 10 Activité polymérase 5’à3’ oui Vitesse de polymérisation 1000 nt.sec-1 50 nt Processivité Vu dans le Cours #2 Activité exonucléase 3’à5’ oui Un complexe « multienzymatique » a q e « core-enzyme » Pol III 12 10/09/2023 ADN polymérases III : du « core-enzyme » à « l’holoenzyme ». « holo-enzyme » (dimère asymétrique) « core-enzyme » anneau b q b a a q e q d y e t e t dy g b g a àprocessivité : 50 nt àprocessivité : 5. 105 nt à synthèse d’un brin à synthèse simultanée de deux brins L’ADN polymérase ne peut pas répliquer l’ADN sans amorce Expérience 1 Polymérase III + 4 dNTP + tampon (Mg2+) Aucune synthèse 5’ 3’ Expérience 2 Polymérase III + 4 dNTP + tampon (Mg2+)+ Amorce ADN ou ARN 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Synthèse d’ADN 13 10/09/2023 Les ADN polymérases 1 : les ADN polymérases nécessitent une extrémité 3'OH pour commencer 2 : le sens de la polymérisation (de déplacement) est toujours 5' vers 3' quelque soit l'enzyme 3 : les nucléotides sont ajoutés par complémentarité 5ʼ-ATGCTGCCCTGCAAGCTTCGATGTCGTTGA-3ʼOH 3ʼ-TACGACGGGACGTTCGAAGCTACAGCAACT-5ʼ 14 10/09/2023 Orientation de l’ADN La Polymérisation se fait toujours dans le sens 5’ 3’ 15 10/09/2023 Le magnésium aide à positionner dans l’enzyme le nucléotide afin que la coupure ait lieu entre le phosphate a et le phosphate b aa aa aa La réplication est bi-directionnelle Incorporation in vivo d’un nucléotide radioactif et autoradiographie Réplication dans les deux sens à partir de l’origine 16 10/09/2023 Conclusion 2: Etape de synthèse de l’ADN - La réplication est semi-conservative: chaque brin parental sert à fabriquer un brin néosynthétisé - La réplication est bidirectionnelle. La progression de l’hélicase (DnaB) de part et d’autre de l’origine créée deux fourches de réplication Chez les bactéries : - la primase (DnaG) crée sur chaque brin parental de courts fragments d’ARN. - la polymérase III (DnaE) se fixe à l’extrémité du fragment d’ARN et crée les brins néosynthétisés en ajoutant les nucléotides par complémentarité dans le sens 5’ vers 3’ . - les deux brins d’une fourche sont répliqués en même temps - Des protéines dont le rôle est similaire sont également présentes chez les eucaryotes (non décrites dans ce cours), le principe général est respecté Rappel de la structure de l’ADN double brin 17 10/09/2023 Comment concilier les différents paramètres ? - Sens de polymérisation 5’ 3’ - Réplication bidirectionnelle - Les deux brins d’une même fourche sont répliqués en même temps MAIS Les deux brins sont antiparallèles et doivent le rester ! Brin parental Brin néosynthétisé 5’ La réplication est semi-discontinue 3’ 5’ A B C 3’ t1 5’ 5’ 3’ discontinue 5’ 3’ 3’ Sens de progression de la fourche A 5’ 3’ fragments d’Okasaki 5’ C B t2>t1 3’ 5 continue 3’ ’ discontinue 5’ 3’ t3>t2 continue A 5’ 3’ B 5’ 3’ 5’ fragments d’Okasaki 5’ 3’ 3 ’5’ C 3’ 5’ 3’ 18 10/09/2023 L’autre fourche: même principe 5’ F E 3’ 5 ’ 3 ’ D Brin parental Brin néosynthétisé t1 3’ Sens de progression de la fourche 3’ 5’ F 3 ’ 5’ 3’ 5 continue ’ 3 ’ E t2>t1 fragments d’Okasaki 3’ 5 ’ E 5’ 5 ’ D D 3 ’ 5 ’ 3’ continue 5 ’ 3’ F 3 discontinue ’ 5’ t3>t2 3’ 5 ’ 3 5 ’ ’ 3 5 ’ ’ 3 ’ 5’ discontinue fragments d’Okasaki Réplication bi-directionnelle continue E 5’ F OriC D 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ discontinue A B 5’ 3’ 5’ 3’ C 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ discontinue 3’ continue Amorce ARN 19 10/09/2023 Les holoenzymes ADN polymérases III : permettant de coordonner la synthèse du brin précoce et du brin retardé SSB Holo Pol III brin retardé amorce ARN brin précoce Voir https://www.youtube.com/watch?v=D91QfkZEN_M Plus compliqué https://www.youtube.com/watch?v=4jtmOZaIvS0 20 10/09/2023 Réplication bi-directionnelle OriC continue E 5’ F D 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ discontinue A B 5’ 3’ 5’ C 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ discontinue 3’ continue Amorce ARN Est-ce terminé ?..... Non ! Comment éliminer les ARN synthétisés par la primase et combler les brèches dans l’ADN néosynthétisé ? 21 10/09/2023 Principales propriétés des ADN polymérase I et III Des enzymes « multifonctionnelle » ADN Pol I ADN Pol III A C T I V I T E S Vu dans le Cours #2 Molécules par cellule 300 Activité polymérase 5’à3’ oui Vitesse de polymérisation 600 nt.sec 10 oui 1000 nt.sec-1 -1 RELECTURE Activité exonucléase 3’à5’ oui oui Activité exonucléase 5’à3’ oui non L’ADN Pol I est responsable chez les bactéries du remplacement des amorces 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ Fixation de l’ADN Pol I 5’ 5’ 3’ 5’3’ Dégradation de l’amorce 5’ 3’ Synthèse d’ADN Fermeture de la brèche 5’3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Pol III 3’ Pol I 3’ 5’ 5’ 5’ Ligase 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 22 10/09/2023 Bilan général Chez les bactéries DnaA : protéine de reconnaissance de ORiC. DnaB: ADN-hélicase ,ouverture de la double-hélice. DnaC stimule DnaB protéines de liaison de l’ADN monocaténaire (SSB /RPA) pour maintenir l’ADN sous forme simple brin. DnaG Primase : ARN polymérase ADN-dépendante responsable de la synthèse des amorces, sur le brin précoce comme sur le brin tardif Polymérase III: ADN polymérase ADN dépendante responsable de la synthèse d’ADN Polymérase I: ADN polymérase ADN dépendante responsable de la suppression des amorces ARN et du remplissage des brèches ADN-ligase : ATPase, rétablissement de la continuité des brins Topoisomérases : gestion des contraintes topologiques générées par la progression de la fourche de réplication sur l’ADN. Comment ont été découvertes ces protéines ? 1- Purification de protéines par chromatographie à partir d’extraits bruts et test d’activité - Fixation à l’ADN - Synthèse d’ADN - Activité de ligation - Activité exonucléase… 2- Approches génétiques -mutants thermosensibles 23 10/09/2023 Mutants conditionnels Pourquoi les chats siamois naissent-ils blancs et pourquoi les adultes ont-ils ce pelage • • • • le chaton siamois naît blanc en milieu chaud, le siamois a une robe claire, en milieu froid, le siamois a une robe foncée, avec l'âge, la robe du siamois devient de plus en plus foncée, 24 10/09/2023 Parce que le gène codant la tyrosinase, enzyme intervenant dans la voie de biosynthèse de la mélanine, est touché par une mutation thermosensible Chez le chat, les extrémités ont une température inférieure à 35°C , alors que celle du corps est de 38°C. Les mutants thermosensibles Gène sauvage Gène muté Condition 1 30 Protéine active à toutes les conditions C Condition 2 37 C • Conformation normale • Protéine active • Conformation erronée • Protéine inactive Fonction assurée Fonction nulle 25 10/09/2023 Applications TD3 26