Cours de Microbiologie Moléculaire (2024-2025) - PDF

# Génétique fondamentale et appliquée ## COURS de Microbiologie moléculaire ## M1 Génétique fondamentale et appliquée (2024-2025) ### Génomes bactériens: ### Mécanismes de réplication ### (Partie 1) (LBCM-FSB-USTHB) - Le génome est le support physique de l'information qui définit tout organisme...

# Génétique fondamentale et appliquée ## COURS de Microbiologie moléculaire ## M1 Génétique fondamentale et appliquée (2024-2025) ### Génomes bactériens: ### Mécanismes de réplication ### (Partie 1) (LBCM-FSB-USTHB) - Le génome est le support physique de l'information qui définit tout organisme vivant dont les bactéries - C'est l'ensemble du matériel génétique, composé de molécule(s) d'acide désoxyribonucléique (ADN). - L'information qu'il code est nécessaire au développement et au fonctionnement cellulaire, elle s'exprime dans la synthèse d'acide ribonucléique (ARN) et de protéines par l'intermédiaire du code génétique. - L'information codée par le génome permet sa propre reproduction (divisions asexuées) assurant ainsi sa conservation à travers le temps et les générations. - Le génome évolue par sa capacité à être modifié, ce qui permet l'adaptation d'une population bactérienne aux environnements changeants. - Même les souches d'une même espèce bactérienne ne possèdent pas la même architecture génomique - Le génome bactérien est constitué de réplicons - le réplicon est l'unité réplicative du génome: c'est l'élément génétique défini entre une origine et un site de terminaison de la réplication. - La structure typique des génomes bactériens est donc : - un unique chromosome (réplicon essentiel à la survie des cellules), - coexistant éventuellement avec des plasmides (des réplicons non essentiels). - La taille des chromosomes est variable, elle est généralement supérieure à celle des plasmides - Les chromosomes bactériens sont haploïdes par opposition aux plasmides qui peuvent être polyploïdes. - des exceptions : multiplicité du chromosome et présence de plasmides à unique copie/cellule (cas des mégaplasmides) - Les plasmides se caractérisent par: - leur spectre d'hôtes: capacité à exister dans divers hôtes bactériens - leur mode de réplication: plus ou moins autonome vis-à-vis du génome de l'espèce hôte - leur capacité de mobilité inter-hôte - et par leurs mécanismes d'incompatibilité inter-plasmidique. - Un plasmide est un réplicon extra-chromosomique n'exprimant à priori pas de fonctions essentielles à la bactérie. - Cependant ! les plasmides peuvent conférer à leur hôte des aptitudes qui dans certains cas lui donnent un avantage sélectif. - résistance à un antibiotique, - possibilité d'utiliser une nouvelle voie métabolique, - dégradation des produits chimiques comme les polluants toxiques, etc.), - les plasmides diffèrent aussi par: - les mécanismes de leur réplication - les mécanismes de contrôle de leur nombre de copies - les mécanismes de ségrégation équitable de leurs copies entre les deux bactéries filles lors de la division cellulaire - La réplication chez les bactéries, comme chez les eucaryotes, débute avec la fixation au niveau d'une région spécifique de l'ADN (origine) de la protéine initiatrice de réplication, ce qui provoque l'ouverture de la molécule double- brin et l'établissement d'un complexe de réplication. - Pour les chromosomes: - La réplication doit s'effectuer une seule fois durant le cycle cellulaire - La réplication est suivie de la ségrégation du matériel génomique dans les deux cellules filles, chacune récupérant un complément génomique - ces deux étapes sont sous le contrôle de différents mécanismes coordonnant leurs déclenchement et inhibition en rapport avec le cycle cellulaire. - Les plasmides sont aussi soumis à des mécanismes de régulation de leur réplication et de la ségrégation de leurs copies dans les cellules filles après division - La réplication des chromosomes bactériens suit globalement le modèle décrit chez E. coli : réplication bidirectionnelle de type thêta - Dans le cas des plasmides, on distingue divers types de réplication dont (pour les plasmides circulaires): - le type thêta, similaire à la réplication de l'ADN chromosomique - le type cercle roulant « Rolling circle » (RC) ## Origine de réplication - l'initiation de la réplication correspond à l'ouverture de l'ADN en un point précis appelée l'origine de réplication - L'origine de réplication d'un chromosome bactérien typique est une courte séquence nucléotidique (250 pb chez E.coli): - La région riche en bases A et T (DNA Unwinding Element ; DUE) est le site d'ouverture proprement dit. - La plus importante interaction est avec DraA, au niveau des boîtes DnaA - les sites de liaison des protéines régulatrices de l'initiation de la réplication (Fis et IHF) - et des motifs GATC: participent à la régulation de l'initiation de la réplication (voir plus loin). ## Ori plasmidiques - ori des plasmides à réplication thêta - Organisation similaire/ori chromosome: DUE + sites de liaison à des protéines : - Les ori plasmidiques peuvent posséder des motifs spécifiques organisés en tandem, les itérons, qui permettent la fixation des protéines Rep (codés par le plasmide, équivalent de DnaA) et ainsi l'ouverture d'ori. - De nombreuses origines plasmidiques comportent des boîtes DnaA: existence d'une interaction forte entre des régulateurs de l'hôte et la réplication plasmidique. - ori des plasmides à réplication RC « rolling circle » - L'origine de réplication est un peu particulière : en fait il y'a deux origines: - dso (double strand origin): lieu d'ouverture de l'ADN double brin par la protéine Rep: C'est à son niveau que s'amorce la réplication d'un des deux brins. - sso (single strand origin): lieu où est initiée la réplication de l'autre brin ## Organisation des ori des chromosomes d'autres bactéries - présentent de nombreuses similarités avec l'ori d'E.coli : respectent la structure DUE + motifs spécifiques (boîtes DnaA, site de méthylation de Dam, etc) ## Initiation de la réplication au niveau de Oric - Oric, origine de réplication du chromosome d'E. coli, est la mieux caractérisée. Elle contient deux types de séquences répétées : - séquence de 9pb (9mers): répétée 4 fois, contient une séquence consensus 5'-TTAT C/A CAC/AA-3' qui reconnaît le facteur d'initiation de la réplication de 52 kDa (DnaA) - séquence de 13 pb (13mers) : répétée 3 fois, riche en AT ## La 1ère étape dans la réplication : ## liaison de DnaA aux séquences 9mers - augmentation de l'instabilité des régions riches en AT - une région de 45 pb est alors dénaturée (complexe fermé → complexe ouvert) - recrutement d'autres protéines impliquées dans la réplication ## 2ème étape: Formation du complexe de préamorçage - élargissement de l'ouverture de l'ADN duplex - recrutement de la primase ## **3ème étape: formation du réplisome** - Cette étape correspond à la formation au niveau des fourches de réplication d'un complexe protéique « le réplisome » composé principalement de: - une hélicase : faisant passer l'ADN du stade double-brin au stade mono-brin, - des primases synthétisant des amorces ARN, - des polymérases synthétisant l'ADN, - des ligases liant les différents fragments synthétisés. ## Les principales ADN polymérases impliquées sont la I et la III - ne peuvent initier la synthèse d'une chaîne d'ADN, elles permettent de la rallonger d'où le besoin d'une amorce « primer » (extrémité 3'0H libre) pour l'extension de l'ADN. - Les amorces sont de courts segments d'ARN de 10 à 15pb synthétisés par la primase ## Les ADN polymérases fonctionnent dans le sens 5+3' - Un brin (le brin avancé ou « leading strand ») est synthétisé de façon continue: ADN polymérase III - L'autre brin (le brin retardé ou « lagging strand ») est synthétisé de façon discontinue: ADN polymérase III et I - Pour chaque fourche de réplication, deux cores catalytiques de l'ADN polymérase sont nécessaires - Les deux cores de l'ADN polymérase fonctionnent dans le même sens que la fourche de réplication - liaison du dimère B₂ à l'ADN (en présence d'ATP) - association du core enzyme de l'ADN polymérase au dimère B2 (Polymerase processive): réplication d'ADN avec une vitesse de 6 x 10ʻpb/min, ce qui achève la réplication d'un chromosome bactérien de taille 4.8 mégabases en 40 min ## Superenroulements créées dans l'ADN lors de la réplication et ## par l'action des hélicases. ## Protéines intervenant dans la réplication de l'ADN bactérien et leurs fonctions | Protéine | Fonction dans la formation du brin directeur et du brin discontinu | |---|---| | Hélicase | Déroule la double hélice parentale aux fourches de réplication. | | Protéines fixatrices d'ADN monocaténaire | Se lie à l'ADN monocaténaire et le stabilise jusqu'à qu'il puisse servir de matrice. | | Topoisomérase | Corrige les surenroulements en amont des fourches de réplication en coupant et en recollant les brins d'ADN après avoir permis au brin clivé de se dérouler. | | --- | --- | | | Fonction dans la formation du brin directeur | Fonction dans la formation du brin discontinu | | --- | --- | --- | | Primase | Synthétise une seule amorce d'ARN à l'extrémité 5' du brin directeur. | Synthétise une amorce d'ARN à l'extrémité 5' de chaque fragment d'Okazaki. | | ADN pol III | Synthétise de façon continue le brin directeur, par addition sur l'amorce. | Allonge chaque fragment d'Okazaki par addition sur son amorce. | | ADN pol I | Enlève l'amorce de l'extrémité 5' du brin directeur et la remplace par de l'ADN par addition à l'extrémité 3' adjacente. | Enlève l'amorce de l'extrémité 5' de chaque fragment et la remplace par de l'ADN par addition à l'extrémité 3' du fragment adjacent. | | ADN ligase | Lie l'extrémité 3' de l'ADN qui remplace l'amorce au reste du brin directeur. | Réunit les fragments d'Okazaki. | ## Régulation de l'initiation de la réplication - Des mécanismes de régulation sont mis en jeu pour éviter une deuxième initiation sur la même origine de réplication - Les modèles classiques de régulation de l'initation de la réplication ciblent - l'origine de réplication - ou les protéines initiatrices DnaA. ## Mécanismes de séquestration de l'ori - Font intervenir les motifs GATC (E.coli) et GANTC (B. subtilis) et les protéines Dam qui méthylent ces sites au niveau de leur adénine. - Avant initiation de la réplication: les sites GATC de l'ori sont doublement méthylés sur les deux brins. - Juste après l'initiation: les sites GATC se retrouvent hémiméthylés (le brin néo-synthétisé n'a pas encore été soumis à l'action de Dam) et cette hémiméthylation conduit à la fixation de Seqa, ce qui empêche la fixation de DnaA au niveau de la nouvelle origine ## Mécanisme de séquestration des protéines DnaA - c'est la séquestration de ces protéines au niveau d'une séquence caractéristique, le locus data: avec pour effet de réduire le nombre de DnaA actives disponibles. - permet le passage de la forme active de DnaA, DnaA-ATP, à la forme inactive, DnaA-ADP ## Mécanisme d'auto-régulation négative de DnaA (son expression ## s'arrête) - DnaA a aussi un rôle de facteur de transcription en se fixant sur les promoteurs de certains gènes dont son propre gène: auto-inhibition de sa synthèse - La réplication doit s'effectuer une seule fois durant le cycle cellulaire - La réplication est suivie de la ségrégation du matériel génomique dans les deux cellules filles, chacune récupérant un complément génomique ## Composants de la fourche de réplication - The dimeric DNA polymerase binds by a "sliding clamp." It adds single nucleotides to the 3' end of the leading strand... - Newly synthesized leading strand - Dimeric replicative. DNA polymerase III - Sliding clamp - DNA gyrase and helicase unwind the DNA duplex. - SSB - Leading strand template - DNA gyrase - ...and Okazaki fragments to the RNA primers of the lagging strand. - Okazaki fragment - Polymerase 1 DNA ligase - RNA primer - Single-stranded DNA binding protein coats the single strands. - Primase adds RNA primers for the leading and lagging strands. - RNA primer - DNA polymerase I and DNA ligase act downstream to remove RNA primers, replacing them with the appropriate DNA segment. - Lagging strand - Primase synthesizes an RNA primer for each new single strand of DNA, for the leading and lagging strands. - RNA primer for leading strand - RNA primer for lagging strand - The DNA polymerase III holoenzyme dimeric complex binds to each replication fork. One half of the dimer elongates the leading strand, the other elongates the lagging strand. - Dimeric DNA polymerase III holoenzyme - Replication of chromosome - The last DNA tetramer is removed as the replication fork moves beyond oriC.