COLTURE CELLULARI 2.pdf

LABORATORIO DI BIOTCNOLOGIE: MODELLI SPERIMENTALI DI MICROBIOLOGIA E COLTURE CELLULARI (prof CARDINALI e CONTI) Appunti integrati da slide e libro: BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI DEHO’ e GALLI Che cosa sono i microrganismi? Tutti gli organismi viventi sono costituiti da cellule, le unità strutturali a...

LABORATORIO DI BIOTCNOLOGIE: MODELLI SPERIMENTALI DI MICROBIOLOGIA E COLTURE CELLULARI (prof CARDINALI e CONTI) Appunti integrati da slide e libro: BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI DEHO’ e GALLI Che cosa sono i microrganismi? Tutti gli organismi viventi sono costituiti da cellule, le unità strutturali a cui attribuiamo le proprietà essenziali del vivente. Alcuni organismi sono unicellulari, altri pluricellulari, ma la maggior parte degli esseri viventi sulla terra sono unicellulari e insieme ad alcuni organismi pluricellulari costituiscono i MICRORGANISMI. I microrganismi sono organizzati in 3 diversi DOMINI: batteri, archea e eucarioti. Questi hanno tra di loro delle distanze filogenetiche, che sono state rilevate dal confronto delle sequenze nucleotidiche dell’RNA della subunità piccole del ribosoma. Quando sono stati scoperti? La microbiologia è una scienza relativamente giovane, perché si pensa che solo a partire dalla seconda metà del 19° secolo si ha avuto la possibilità di studiare i microrganismi in laboratorio; n realtà la microbiologia è una scienza che risale all’antichità. Nella metà del 1500, nel capo delle malattie e delle epidemie ci fu Girolamo Fracastoro, che pubblicò un lavoro sulle malattie contagiose e sul loro trattamento. L’avvento del microscopio nel 17° secolo fu una tappa fondamentale alla scoperta del mondo microbico. Robert Hooke, filosofo sperimentale inglese, pubblicò nel 1665 un libro contente l’esatta descrizione di un microscopio con una sola lente e disegni di corpi fruttiferi di funghi. Antoni van Leeuwenhoek, commerciante olandese, fu il primo a descrivere batteri, lieviti e protozoi. Egli si era appassionato ai microscopi che potevano raggiungere notevoli ingrandimenti. La sua fame gli è dovuta alla grande curiosità che egli aveva, perché nel 1676 scoprì il mondo dei “piccoli animali”, mentre studiava al microscopio alcuni infusi. Lo sviluppo del microscopio fu migliorato poi successivamente da Paul Ehrlich e Hans Christian Gram, che svilupparono un metodo di colorazione differenziale. Quello di Gram è ancora oggi utilizzato come tecnica di base per una caratterizzazione morfologica e tassonomica dei batteri (Gram positivi e Gram negativi). Teorie importanti furono: “la teoria cellulare” e “la teoria della biogenesi”. L’idea della generazione spontanea di organismi viventi è antica e non sembrava combaciare con le idee di spicco di quegli anni, infatti molti scienziati cercarono di suffragarla con esperimenti al quanto discutibili, come per esempio: la generazione di larve della carne lasciata all’aria senza protezioni. Questo dibattito fu chiuso definitivamente da Louis Pasteur, vero la metà dell’ottocento, mettendo le fondamenta su cui poggia ancora oggi tutta la 1 microbiologia. Egli dimostrò che il pulviscolo atmosferico è pieno di microrganismi e questi potevano appoggiarsi su materiali esposti e contaminarli. Con alcuni esperimenti, Pasteur demolì definitivamente la teoria della generazione spontanea; il più famoso esperimento è quello del pallone a collo di cigno. Alla teoria cellulare a questo punto di poteva così aggiungere la teoria della biogenesi: ogni cellula deriva da un’altra cellula, ogni organismo vivente è generato da un altro organismo vivente. Rober Koch si dedicò allo studio delle cause di molte malattie e diede origine alla microbiologia medica, isolando il primo microrganismo causa di malattia: Bacillus anthracis, agente eziologico del carbonchio. Un altro contributo fu la messa a punto di terreni di coltura solidi, su cui far crescere i microrganismi in colonie distinte. Inizialmente per solidificare i terreni fu usata la gelatina, ma non fu soddisfacente a causa dei suoi punti di fusione e congelamento. Walther Hesse ipotizzò di utilizzare l’agar, un polisaccaride complesso derivante dalle alghe rosse e questa fu la sostanza definitiva, utilizzata ancora oggi, in quanto presenta dei vantaggi molteplici: solidifica intorno a 40°C ma liquefa a temperature superiori a 85°C offrendo una buona stabilità termica anche per i microrganismi termofili; inoltre non viene degradata dai microrganismi. Dove si trovano i microrganismi? Essi si trovano in: alimenti, suolo, acque, aria, sul corpo, nel corpo e ovunque. Senza i microrganismi non esisterebbe la vita; spesso in molteplici situazioni non potrebbero esistere determinati microrganismi senza la presenza di altri. Quanti sono i microrganismi? Sono circa 2,5*10^30 cellule, che si trovano in tutto lo spazio, infatti si dicono OBIQUITARI. I microrganismi sono tutti diversi tra loro e si consociano in CONSOCIAZIONI, ovvero consorzi microbici di diverse specie che convivono in uno stesso habitat. Questo accade perché alcune specie non riescono a vivere solo in presenza di microrganismi appartenenti ad un’altra specie. LA CELLULA MICROBICA È una singola unità, che ha come caratteristica principale quella di avere la membrana plasmatica. Una popolazione è un insieme di cellule uguali, mentre una comunità è un insieme di popolazioni di cellule di specie diverse. La morfologia della cellula è studiata dalla MICROMORFOLOGIA, attraverso il microscopio. Questa scienza studia l’aspetto della cellula, dandoci un’idea già dalla prima osservazione, con che tipo cellulare abbiamo a che fare (esempio per i batteri: cocchi, bacilli o spirali). I lieviti sono dieci volte più grandi delle dimensioni dei batteri. Le forme più classiche sono: lieviti apiculati e lieviti ellittici. Al microscopio poi possiamo vedere come una cellula si sta replicando: gemmazione e sporulazione. Le muffe hanno struttura tubulari allungate che presentano un SETTO che separa due citoplasmi. La struttura base delle muffe è la ifa, separata appunto da un setto. Esistono poi le pseudoife che sono separate in modo incompleto, il setto è strozzato. I lieviti sono assumere la forma di pseudoifa per mancanza di separazione durante la divisione. Altri lieviti invece possono dividersi per scissione binaria (anomalia in quanto si dividono per gemmazione) andando a formare un setto trasversale. 2 Le alghe sono molto importanti all’interno delle biotecnologie in quanto fanno i biocarburanti. Ci sono sia alghe procariote che eucariote. La colorazione verde, data dai cloroplasti, ci permette di riconoscerle. Lo studio dei microrganismi in laboratorio: è impossibile riprodurre in laboratorio le condizioni complesse dell’ambiente naturale, infatti circa il 98% della biodiversità microbica NON è ad oggi coltivabile in laboratorio. Si ha la necessità di studiare i microrganismi in coltura pura, come “modello di studio”. Un modello di studio è una specie che viene portata in laboratorio ed isolata in colture pure, in cui viene studiata con tecniche molecolari di analisi. COLTURA PURA: è un insieme di cellule, derivanti dalla stessa cellula madre per esclusiva riproduzione vegetativa (o asessuata), senza l’intervento della ricombinazione genetica. Una cultura pura quindi presenta un insieme di cellule pressoché identiche, ovvero identiche a meni delle mutazioni spontanee. Questa però presenta dei limiti gravosi per lo studio dei microrganismi: 1. La cellula normale è abituata a confrontarsi con altre, sia in positivo che in negativo, in laboratorio però NON ci sono interazioni con altri tipi di cellule. 2. Di solito le cellule si trovano in ambienti con scarso nutrimento, mentre l’eccesso di nutrimento nella coltura sembra essere correlato con la diminuzione della vita. 3. In laboratorio si favorisce lo sviluppo della forma planctonica, ovvero libere e non ancorate alla superficie, con terreni di coltura liquidi in cui le cellule raggiungo densità superiori a quelle che si trovano in natura. OGNI COLTURA PURA ORIGINA DA UNA COLONIA COLTURA MISTA: insieme di cellule in cui si ha più di un tipo cellulare a causa di un inquinamento o ricombinazione genetica (riproduzione sessuale). La colonia può essere mista anche a causa della mancata separazione di due o più linee pure durante l’isolamento. COLONIA: insieme di cellule DISCRETO o DISTINTO dallo spazio che derivano da un’unica cellula madre per riproduzione vegetativa o asessuale, senza l’intervento della ricombinazione genetica. la colonia è l’unità di base della microbiologia e può essere distinta per colore, tessitura (patina, muco, dura, rugosa ecc..), forma in sezione, spessore e margine. L’aspetto delle colonie viene studiato dalla MACROMORFOLOGIA, che ha proprio il compito di osservare le colonie che sono cresciute su un terreno di coltura. Possono essere distinte per: 1. Colore 2. Consistenza (pastosa, mucosa, dura, rugosa ecc.) 3. Forma 4. Spessore 5. Margine Aspetto che assumo alla luce (opaca, lucida) Domanda esame: PERCHÈ LA COLTURA PURA È CONSIDERATA UN LIMITE COME “MODELLO”? la coltura pura è un limite perché in natura abbiamo tante specie di microrganismie non turri posso essere rappresentati dal modello di studio S Lacoltura pura si otiene isolando una colonia. in natura noi ritroviamo ad avere delle colture miste in cui i microrganismi interagiscono tra loro. l'eccesso di nutrimento in coltura pura porta a una diminuzione della vitalità ma in coltura pura la densità celulare 3 emaggiore. Questi parametri ci permettono di vedere se ci troviamo in presenza di più specie. La stessa morfologia però può essere generata da specie diverse. Il limite di questa tecnica, ovvero isolando le specie per macromorfologie, è che possiamo escludere delle specie perché pensiamo che la stessa morfologia l’avevamo già classificata, ma in realtà la stessa morfologia poteva appartenere ad un’altra specie. La macromorfolgia può essere distinta anche in base al terreno differenziale (terreno colorabile): ci permettono di distinguere morfologie diverse in base a gli enzimi e alle loro reazioni biochimiche. Esistono terreni di questo tipo sia per i lieviti che per i batteri (sono spesso utilizzati in ambito ospedaliero, per esempio per riconoscere il patogeno “candida”). COLONIA MISTA: è una colonia in cui si ha più di un tipo cellulare a causa dell’inquinamento, della ricombinazione (riproduzione sessuale) e la mancata separazione di 2 o più linee pure durante l’isolamento. PATINA: è un insieme di colonie che sono a confluenza (si sono mischiate tra di loro) → non DISCRIMINABILI Il motivo per cui noi ricreiamo un ambiente diverso, da quello naturale dei microrganismi, è perché abbiamo bisogno di CONTROLLO e UNIFORMITA’ → per controllare al meglio tutti i microrganismi abbiamo bisogno che siano tutti uguali e che crescano con le stesse condizioni. MACROMORFOLOGIA E MICROMORFOLOGIA: IL MICROSCOPIO: è uno strumento che ci permette di creare un’immagine ingrandita degli oggetti che dobbiamo visualizzare, in quanto si parla di pochi micron. È composto da una sorgente luminosa o un fascio di elettroni e una combinazione di lenti (lenti ottiche o elettromagneti). Più è piccola la lunghezza d’onda più è maggiore la capacità di ingrandimento. Perché il microscopio ingrandisce l’immagine? 1. Con la combinazione di lenti sposta il fuoco creando un’immagine ingrandita 2. Aumenta la risoluzione → la distanza minima per cui due oggetti sono percepiti come distinti. La va ad aumentare ricostruendo l’immagine sotto un angolo più grande. Questi oggetti piccoli producono diffrazione, ovvero l’interferenza prodotta da un oggetto posta su un cammino d’onda, per cui l’immagine riesce ad allargarsi. L’obbiettivo del microscopio è diminuire la grandezza della figura di diffrazione (d) → d = 0,612 λ /n*sin α. Si può diminuire la diffrazione: 1. Aumentando alfa o 2. Diminuendo di lamda Aumentando l’apertura numerica (lo vediamo scritto negli obbiettivi), aumentiamo i raggi di luce che arrivano nel microscopio. L’apertura numerica è un parametro legato alla risoluzione del microscopio. 4 peraumentare la risoluzione si può cambiare l'indice di rifrazione del mezzo. aumentare la risoluzione significa diminuire la dimensione della figura di diffrazione L’olio posto tra l’obbiettivo e il vetrino fa di che aumenti la diffrazione, aumenta così anche l’apertura che fa aumentare la risoluzione del microscopio. LE TECNICHE DI BASE: 1. PRELIEVO: è una delle operazioni più difficili perché se si sbaglia questa prima fase, anche le successive saranno sbagliate, in quanto mi porto a presso l’errore iniziale. La significatività è la prima cosa che teniamo in conto, come “probabile” errore che sto commettendo. Essa dipende dall’uniformità del campione e dal numero di campioni prelevati. Il campione rappresentativo mi consente di fare inferenze statistiche a livello di un’intera popolazione → faccio dei prelievi in diversi punti e questa serie di prelievi è adatta a calcolare tutto quello che vi è dentro, il problema è che io posso avere solo un’idea di quello che vi si può trovare, ma non posso mai saperlo con esattezza. La rappresentatività è fondamentale per evitare errori di SOVRA o SOTTOSTIMA → prima di prelevare un campione devo fare un disegno sperimentale e poi l’analisi statistica. La rappresentatività è massima al momento che nel campione ho tutti gli elementi che mi aspettavo di trovare, caso impossibile, ma per aumentarla si campiona in diversi punti e i vari campioni verranno isolati di nuovo. Se ci fossero degli inquinanti andrebbero rimossi e se ci fosse solamente un campione, questo non sarebbe rappresentativo, perché non potrei capire se questi vi sono con certezza o meno, invece se ho più campioni e presi in punti diversi, posso capire se vi sono o meno una volta isolati. Esistono varie tipologie di prelievi, dato che i microrganismi si trovano ovunque e in qualsiasi substrato; va considerata quindi la tipologia di quest’ultimo: - Substrato frazionabile: questi sono divisibili, come per esempio il suolo, l’aria o il fiume. - Substrato non frazionabile: questi non sono divisibili, come per esempio una parete, il pavimento o l’oceano. Oltre a queste due categorie abbiamo un ulteriore suddivisione che si basa sulla quantità di microrganismi che ci aspettiamo di trovare e dalla tipologia del microrganismo con cui abbiamo a che fare (in quanto in un terreno non ci sono gli stessi organismi): - Bassa carica: in questo caso è necessario andare a campionare molta superficie - Alta carica Esiste uno strumento che può essere utilizzato quando ci troviamo davanti a terreni frazionabili a bassa carica (esempio: aria o fiume), ovvero l’imbuto buchner → dove c’è il filtro si fa passare l’acqua o l’aria che passa per differenza di pressione tra i due recipienti, ma i microrganismi verranno intrappolati all’interno del filtro, che verrà poi messo in una piastra con un terreno di coltura e analizzato. Questo è detto campionamento attivo sia per aria che acqua. 5  Il campionamento passivo, per l’aria, consiste nel lasciare una piastra, con terreno solidificabile, aperta almeno per 4 ore in una stanza. Quando facciamo questi tipi di campionamenti dobbiamo sperare che all’interno non vi siano troppe colonie, altrimenti supereremmo il limite imposto di 300 colonie e non potremmo dare un risultato affidabile. Quando il substrato è frazionabile e solido → Carica alta: si va a prelevare con spatole o cucchiai. Carica bassa → si può usare gli stessi metodi ma con il prelievo di più superficie. Quando il substrato NON è frazionabile e solido si usa la tecnica del tampone cotton fioc. Queste tecniche vanno bene per l’isolamento, ma le conte potrebbero essere sottostimate, perché potrebbe essere che i primi microrganismi prelevati possano rimanere intrappolati all’interno del cotto fioc. Se la carica del substrato solido NON frazionabile è molto basse (esempio: parete) si usa la piastra Rodac: è composta da terreno solidificabile che ha la caratteristica di avere nella piastra una griglia in cui ogni quadratino ha un’area di 1 cm2. Il terreno assume una forma convessa quindi rivolta verso l’esterno e quindi risulta più facile riuscire a prelevare una superficie. Dopo il prelievo il campione deve essere OMOGENIZZATO, ovvero deve subire dei lavaggi con delle soluzioni saline che alterano le interazioni idrostatiche tra le cellule e la matrice stessa, in modo da favorire il distacco. 2. CONSERVAZIONE: prima che un campione venga isolato può passare un po’ di tempo (comunque poco) ma questo deve rimanere sterile e a temperatura controllata (deve mantenere la sua omeostasi). Tipicamente la temperatura è normale quando escludiamo il rischio dell’eccessiva proliferazione o della crescita selettivamente differente. Altrimenti adottiamo il refrigeramento o al congelamento quando temiamo la variazione di quantità e composizione dei microrganismi in tempi brevi. La conservazione in STORING BUFFER è utilizzata principalmente in caso di analisi metagenomiche di campioni fecali, per mantenere inalterata la distribuzione della comunità presente. 3. TERRENI DI COLTURA: I terreni di coltura sono dei substrati liquidi, solidi o solidificabili, su cui i faccio l’analisi della mia coltura, che contengono i nutrienti necessari per la crescita dei microrganismi. Va scelto in base a gli studi che si devono effettuare e al tipo di microrganismo, infatti non esiste un terreno di coltura univoco. 6  Il contenuto del terreno di coltura è tipicamente: carbonio, ossigeno, azoto, idrogeno, fosforo, zolfo ecc. (il contenuto è quasi simile ogni volta in quanto tutti i microrganismi derivano da un ancestrale comune, LUCA). Ogni cellula necessita dei micro e dei macro nutrienti; la composizione varia in base all’utilizzo. Dalla crescita ci si aspetta che le cellule per lo meno duplichino e che solo alcune categorie crescono più sufficientemente di altre, perché vorrebbe dire che ho costruito il terreno adatto per gli aspetti fisiologici di quel microrganismo. per aumentare la popolazione che è mio oggetto di studio, posso inoltre arricchire il mio terreno di coltura con le componenti di cui necessita, senza però svalutare le altre. Il terreno deve rispondere ai cambiamenti di pH, di temperatura e al livello di ossigeno molecolare. COMPOSIZIONE E STATO FISICO DEI TERRENI DI COLTURA: NATURALE: liquido, solido (mela, patata) o solidificabile con agar-agar per esempio, una sostanza che deriva dalle alghe rosse, che negli anni è andata a sostituire la comune gelatina che veniva prima utilizzata. La gelatina aveva il difetto che poteva essere degradata dalle proteasi e quindi il terreno non risultava più efficace e soprattutto fondeva alla stessa temperatura a cui tornava solida, mentre l’agar-agar non può essere degradata da queste proteine. Inoltre l’agar-agar in acqua non si scioglie, ma rimane in sospensione; alla temperatura di circa 80 gradi liquefa, ma non torna solido alla stessa temperatura a cui si scioglie, perché torna solido alla temperatura di 40 gradi (questo è il vantaggio per cui può essere usato con quasi tutti i microrganismi, anche i termofili). SINTETICO COMPLESSO: tipicamente sono in polvere e solubili in acqua, possono essere liquidi o solidificabili. Hanno lo svantaggio di non essere chimicamente definiti (non conosco la composizione chimica alla quale sono stati messi nel terreno). SINTETICO DEFINITO: sono chimicamente definiti, ovvero ogni componente che è stato aggiunto è noto. FUNZIONI DEI TERRENI DI COLTURA: TERRENO MINIMO: consente la crescita dei microrganismi PROTROTOFI, ovvero dei microrganismi che non hanno particolari richieste nutrizionali → terreni naturali. TERRENO ADDIZIONATO: consente la crescita dei microrganismi AUXOTROFI, ovvero che necessitano di specifiche composizioni per porter crescere. Terreno di arricchimento: è un terreno addizionato con determinati nutrienti che vanno a favorire la presenza o l’assenza di alcune cellule (servono appunto per verificare la densità di alcune cellule). Vado ad arricchire la conta delle specie non prevalenti, infatti la conta dopo l’arricchimento non ha senso. Questo può essere solo liquido. Terreno selettivo: sono terreni addizionati con nutrienti per favorire la crescita di un particolare microrganismo (creo delle condizioni per le quali altri microrganismi non riescono a crescere). Può essere liquido o solidificabile. Terreno differenziale: è un terreno addizionato in cui vengono messe delle colorazioni che individuano la crescita della colonia microbica. I terreni di coltura possono essere suddivisi anche in base al tipo di microrganismo che dobbiamo far crescere: - Crescita dei batteri: questi sono gli LB (terreno completo) o R2A (utilizzato per i prelievi dell’acqua di fiume). - Crescita eucarioti: terreni contenenti destrosio o il terreno WL (adatto per la crescita dei lieviti in campo enologico, che hanno pH acidi che favoriscono la fermentazione). - Crescita alghe: ASN-III è un terreno minimo che ricalca le condizioni marine delle alghe. 7 La crescita microbica all’interno dei terreni di coltura: - Terreni liquidi: si hanno le cellule in sospensione - Terreni solidi: in questo caso si possono avere: 1. Per spandimento in cui la sospensione batterica diluita viene messa sulla piastra che ha già il terreno di coltura agarizzato → le cellule cresceranno sulla superficie. 2. Per disseminazione in cui la sospensione diluita viene messa all’interno della piastra contemporaneamente con l’agar-agar che deve ancora solidificare, quindi le cellule cresceranno sia sulle superficie sia all’interno dell’agar-agar. - Crescita in anaerobiosi: candle jar, gas pack anaerobic system, cabine per anaerobiosis e CO2 packet. arte mu I terreni di coltura possono essere suddivisi anche in base al tipo di microrganismo che dobbiamo Esempi: far crescere: - Crescita dei batteri: questi sono gli LB (terreno completo) o R2A (utilizzato per i prelievi dell’acqua di fiume). - Crescita eucarioti: terreni contenenti destrosio o il terreno WL (adatto per la crescita dei lieviti in campo enologico). - Crescita alghe: ASN-III è un terreno minimo che ricalca le condizioni marine delle alghe. 4. ISOLAMENTO: isolare è quell’operazione che permette di separare i vari titpi di microrganismi di un substrato in colonie, la colonia è una coltura pura, ovvero un insieme di cellule che derivano dalla stessa cellula madre per esclusiva riproduzione vegetativa, senza l’intervento della ricombinazione genetica e che sono distinte e discrete nello spazio. L’isolamento è una tecnica QUALITATIVA. Le tecniche per l’isolamento sono: spread-plate metod Spandimento variante 1: consente l’isolamento di singole colonie utilizzando 3 piastre Petri. Il principio del metodo è che l’isolamento risulta dalla progressiva diminuzione della carica microbica portata dalla spatola da una piastra all’altra a seguito di ogni passaggio. 1. Depositare un’aliquota di sospensione sulla superficie del terreno. 2. Distribuire le cellule con movimenti circolari della spatola sull’intera superficie della piastra. Pulire la spatola distribuendo la carica microbica sulle altre 2 piastre 3. Analizzare le colonie dopo incubazione per 24/48h. 8  Streak-plate metod Spandimento variante 2: viene utilizzata una sola piastra Petri e l’isolamento risulta dalla separazione delle cellule mediante un numero programmato di strisciamenti dell’ago sulla superficie del terreno agarizzato. La progressiva diminuzione della quantità di cellule è dovuta alla sterilizzazione dell’ago dopo ogni passaggio. 1. Spargere una goccia di sospensione microbica in una piccola area vicino ad uno dei bordi della piastra 2. Separare le cellule attraverso un numero programmato di strisciamenti dell’ago sulla superficie del terreno. 3. Analizzare le colonie dopo 24/48h di incubazione. Disseminazione: l’isolamento risulta dalla diluizione progressiva della sospensione microbica. 1. Diluire l’aliquota in una serie di tubi contenenti terreno agarizzato fuso, mantenuto ad una temperatura tale che gli consenta di rimanere liquido, senza danneggiare le cellule. 2. Versare il contenuto dei tubi in altrettante piastre Petri vuote (3). 3. Analizzare le colonie dopo 24/48h di incubazione. Filtrazione: è l’isolamento da substrati a bassa carica microbica e risulta dalla concentrazione della sospensione a seguito della filtrazione 1. Filtrare la sospensione 2. Trasferire il filtro sulla superficie di un apposito terreno di coltura agarizzato 3. Analizzare le colonie dopo l’incubazione di 24/48h 9  Monocitogenetico: serve per l’isolamento delle spore per lo studio dei prodotti a ricombinazione genetica. vi si osserva la coltura al microscopio, prelevo le singole spore con l’ago e le trasferisco sulla singola piastra e aspetto la crescita delle colture monosporali. REISOLAMENTO: per avere la certezza di lavorare con una coltura pura è necessario procedere al reisolamento delle colonie ottenute. 5. CONTE: la conta è una procedura quantitativa e riesce a rispondere con precisione alla domanda “quanti microrganismi ci sono nel campione?”. CONTE VITALI: quantificano le cellule vitali presenti nel campione, ovvero quelle che hanno la capacità di riprodursi e formare colonie. CONTE TOTALI: quantificano tutte le cellule presenti nel campione, ovvero le cellule vive, vitali e morte. I risultati delle conte vanno sempre riferiti ad una frazione predeterminata del campione (unità di volume, peso o superficie) opportunamente scelta e che si ritiene rappresentativa del campione, in tutto. Esempio: 10^3 cellule/ml o 10^5 cellule/gr. Questo vuol dire contare per densità (conto i microrganismi in un determinato spazio). Ogni conta è un isolamento, ma l’isolamento non è una conta. 10  CONTE VITALI Concetto di COLONY FORMING UNIT (CFU): la cellula è ala base della colonia, che possono essere 1 o più di una, ovvero da una cellula può derivare una sola colonia o da 2/3 cellule può derivare una sola colonia (colonie spurie). Posso trarre la relazione che 1 cellula madre = una colonia (se una piastra ci sono 60 colonie posso dire che queste sono derivate da 60 cellule). Ovviamente ci sono dei limiti di conta, che permettono di evitare la sottostima e la sovrastima: MINIMO 30 COLONI E MASSIMO 300 COLONIE A PIASTRA. - Conta vitale per spandimento: la procedura si basa su tre passaggi 1. Preparare la sospensione cellulare 2. Preparare le diluizioni scalari in base 10 3. Trasferire la sospensione dai tubi di diluizione alle piastre con terreno agarizzato. 11  Quando si tratta di questa conta devono sempre mettere, quando faccio il calcolo, il fattore di conversione 10, in quanto all’inizio vado a prendere 0,1 ml di campione. - Conta vita per disseminazione: in questo metodo quando vado a fare il calcolo non importa mettere il fattore di conversione 10, in quanto si prende direttamente 1 ml di campione. 1. Preparare delle diluizioni scalari del campione 2. Depositare una quantità nota di campione sul fondo della piastra vuota 3. Aggiungere una quantità necessaria di terreno agarizzato sterile fuso, ad una temperatura non superiore a 50 gradi 4. Mescolare 5. Lasciare solidificare 6. Porre in termostato per l’incubazione (piastra rovesciata) 7. Contare le colonie. - Conta su filtro: FORMULE DI CALCOLO DELLA DENSITA’ CELLULARE IN CONTA VITALE: 12 LE DILUIZIONI: Le conte microbiche presentano sempre la necessità di operare apposite diluizioni della sospensione di partenza. Ogni diluizione è definita in maniera da spiegare quanta parte della sospensione di partenza vada diluita in quante parti del solvente, normalmente rappresentato da acqua o soluzione fisiologica, talvolta da terreno liquido o solidificabile allo stato fuso. Un caso molto comune è la diluizione 1:10 ovvero un volume di sospensione iniziale in 10 volumi finali → metto 1 parte del mio campione in 9 parti di solvente, per avere un totale di 10 volumi. Le diluizioni possono essere semplici o sequenziali. Nel primo caso si effettua una sola diluizione, nell'altro se ne effettuano diverse in sequenza. La diluizione sequenziale si effettua diluendo un volume di sospensione iniziale in FD-1 volumi di solvente in un primo tubo, si mescola, si riprende un volume da questo tubo e lo si aggiunge a FD-1 volumi nel secondo e così via. Il fattore di diluizione di una diluizione semplice viene indicato sinteticamente come base (b) della diluizione, mentre la lettera D indica il numero di diluizioni. Il fattore di diluizione finale è il prodotto del fattore di diluizione semplice moltiplicato per sé stesso D volte. Dal punto di vista numerico se diluisco con b=10 per 3 volte, ottengo che il fattore di diluizione è 10^3=1000 → prima diluizione 10 = 10 volte, seconda diluizione 10*10=100 volte e terza diluizione 10*10*10=1000 volte. Il concetto fondamentale è che vi è una basa di diluizione che viene ripetuta nelle diluizioni successiva, perché ogni diluizione è la diluizione della sospensione precedente → ogni diluizione successiva è una diluizione più forte. ESERCIZI SUL CALCOLO DELLA CONTA VITALE PER SPANDIMENTO E DISSEMINAZIONE: esercizio numero 1 Conta per spandimento con diluizione decimale Dalla 3 diluizione effetmano spandimenti o si su 3 piastre ottenendo + 230 260 270 colonie Carcola la densità cemulare. , media delle colonie - 250 0, 1 mi aliquota Diluizione piastra-1 10. DC = 250. 103. 10 = 250. 10" = 2 5 ,. 106 13  esercizio numero 2 Conta per disseminazione con diluizione decimale Dalla l diluizione si effetua disseminazione su spiastre - 80 95 65 colonie. , Calcola densità cellulare , étroppo distaccato escudo il 65 media - > 87, 5 1m Aliquota DC = 87, 5. 10" = 0. 875. 106 esercizio numero 3 conta per spandimento dalla 4 o diluizione - 350 330, 290 colonie , - Non la considero perché sopra 300 dalla 5 diluizione o - 40 , 35 , 36 Colonie media > 37 0. 1 mi Aliquota DC = 37. 105 10. = 37. 106 esercizio numero 4 conta per disseminazione - 15 grammi di Yogurt e sospensione di 60 ml Dalla 4o diluizione - 40, 38 42 colonie , media - 40 I mi aliquota CFU/m) = 40. 10" = 0. 4. 106 CFu/gr 0. 4 106 6 1.6 10 =.. =. esercizio numeros Conta per disseminazione 30 - grammi in 120 mi Dalla quarta diluizione - 40 , 38 , 42 media - 40 1 mi Aliquota CFU/m) = 40. 10" = 0. 4. 106 CFulgr = 0. 4. 106. 120 = 16. 106 30 esercizio numero 6 Conta per disseminazione Diluizione PENTESIMALE dalla 4o media - 100 Iml Aliquota DC = 100 54. = 0, 0625. 106 CONTE TOTALI - Conta totale diretta: viene fatta con la CAMERA CONTAGLOBULI → THOMA-ZEISS Il vetrino porta oggetti presenta una zona centrale più bassa di 0,1 mm, rispetto alla superficie principale; se questa area è inciso un reticolo quadrettato di cui è nota l’area di ogni riquadro. (ci sono 25 quadrati grandi, ovvero 5x5, ciascuno al loro interno diviso in 25 quadratini elementari → il lato di ogni quadratino è di 50 micrometri e la loro area è pari a 2.500 micrometri^2 → 50x50. Il volume di ogni quadratino invece è pari a 250.000 micrometri^3, in quanto lo spessore della camera è di 100 micrometri → 50*50*100). La diluizione rispetto ad un quadratino è di 1/4 * 10^6, quindi il fattore di diluizione è 4*10^6. ↓ 1M1 = 1012 mm3 = 4. 1 14  CALCOLO PER LA CONTA TOTALE AL THOMA-ZEISS → CELLULE/ML = MEDIA*FATTORE DILUIZIONE *4*10^6 Il risultato va espresso sempre come “1 milione di cellule a millilitro” quindi è per questo che alla fine mettiamo per 10 alla sesta. Per facilitare la conta vi sono dei metodi appositi, il più famoso è la regola della L: tutto quello che mi cade sulla linea della L lo conto e quello che vi è all’interno. Questo è un metodo per evitare errori di duplicazione o omissione. Per avere la misura della vitalità bisogna calcolare → (numero delle cellule morte – le cellule totali) / numero delle cellule totali; in questo modo otteniamo la percentuale di vitalità. Possiamo ricavare da questa il numero delle cellule vive, moltiplicando la % di vitalità per la densità cellulare totale. - Conta totale indiretta: sono appunto delle misure indirette della densità cellulare; permettono di stimare il numero di cellule presenti in un campione attraverso la determinazione di componenti o caratteristiche ad esso correlati: 1. Misura della torbidità: Turbidometria: Io posso filtrare la mia sospensione e pesare il filtro umido, successivamente metterlo sopra una bilancia che ha una temperatura costante e quando il peso non varierà più, vuol dire che avrò il mio peso secco, in quanto tutta l’acqua è evaporata. Nefelometria: si misura con la spettroscopia con la formula di Lambert-Beer. La cellula funge da specchio e il fotone arriva sulla cellula che lo diffrange; il raggio che non incontra nessuna cellula arriva alla fotocellula, mentre il raggio che la incontra no. Questa tecnica funziona molto sulle sospensioni diluite, mentre su quelle concentrate c’è il rischio di non riuscire a contarle tutte in quanto una cellula potrebbe ombreggiarne un’altra e quindi faccio più errore. Il minimo di lettura dello spettrofotometro 0,05 nm mentre il massimo 0,5 nm. 15  2. Analisi chimica di un costituente cellulare: quantità di proteina, DNA o di moli. STERILIZZAZIONE Il concetto di sterilità vuol dire l’assenza assoluta di organismi viventi e virus infettivi. In un laboratorio di microbiologia deve essere assoluta. Nelle industrie alimentari, questo concetto è un concetto statistico (tempo di riduzione decimale). Un virus non può essere ucciso, ma solo disattivato e quindi incapace di replicarsi. Le modalità di lavorare in sterilità sono: - ANTISEPSI: vi è un ripristino continuo delle condizioni di sterilità, attraversi una serie di procedure atte a prevenire l’accesso di microrganismi ad un substrato. - ASEPSI: è un mantenimento delle condizioni di sterilità (si prepara un ambiente sterile, nel quale si immette solo materiale sterile), questo attraverso l’impedimento della contaminazione da parte di microrganismi di substrati precedentemente sterilizzati. La cinetica di morte microbica: - Tempo di riduzione decimale (D) → la popolazione microbica decresce della stessa frazione ad intervalli di tempo costanti. Il valore di tempo decimale (D) è il tempo necessario per ridurre di 10 volte una popolazione microbica esposta ad un agente letale. - Intensità della dose sterilizzante (Z) → questo valore corrisponde all’aumento di temperatura che deve essere realizzato per ridurre il valore D di tempo di riduzione decimale, di un fattore di 10 (10 volte). Sono inversamente proporzionali 16 Parametri per l’intensità della sterilizzazione: METODI DI STERILIZZAZIONE: - Chimici: consiste nell’annullare la potenziale infettività di un materiale o tessuto mediante l’azione di agenti chimici. Si possono utilizzare agenti antisettici per inibire la crescita dei microrganismi (impediscono la crescita); questi sono poco tossici per gli organismi superiori. Altrimenti si utilizzano i disinfettanti, che portano alla morte della cellula, infatti sono tossici per gli organismi superiori. 17  - Fisici: 1. Filtrazione: è il metodo principale per la sterilizzazione selettiva di fluidi che contengono sostanze termolabili (enzimi, vitamine, antibiotici ecc.). È basata sulla capacità dei filtri di trattenere le cellule microbiche. I filtri sono delle membrane filtranti tipicamente in acetato di cellulosa o policarbonati; le dimensioni dei pori variano dai 0,1 a 0,5 micrometri. 2. Radiazioni: possono essere ionizzanti → producono tipicamente elettroni e ognuna delle molecole è in grado di alterare e distruggere biopolimeri. Sono in grado di penetrare in profondità negli oggetti (sterilizzazione di composti o sostanze dopo il confezionamento), quindi è tipica degli alimenti. Oppure possono essere ultraviolette → non hanno l’energia sufficiente per indurre modificazioni o rotture del DNA; non sono in grado di penetrare le superfici solide opache, perché queste assorbono la luce nello spettro del visibile. È efficace per sterilizzare superfici, aria o acqua (utilizzo limitato alle superfici esposte). 3. Termica: si può trasmettere calore sottoforma di 3 modalità, ovvero diretto, umido o secco. Il calore diretto può essere quello di una fiamma ossidante ovvero quella azzurra; questa è una tecnica asettica. Tyndallizzazione È un metodo di sterilizzazione in cui il primo trattamento Autoclave uccide tutte le forme Si ha un contenitore pieno di vegetative, poi si acqua e del nostro materiale da sottopone il campione sterilizzare e si mette a bollire. ad un periodo di Questo contenitore alla sua incubazione di 24 ore, estremità più alta ha una in cui germinano le valvola, che quando l’acqua spore. Il giorno inizia a bollire (quindi circa 100 seguente si sottopone il gradi) viene chiusa. Il vapore materiale per 30 minuti che si forma all’interno del alla temperatura di contenitore adesso chiuso porta 60-100 gradi, al fine di a raggiungere una temperatura uccidere tutte le forme di 121 gradi. vegetative che si sono Questo metodo è usato per le formate della spore. sostanze NON termolabili Tale processo è I eseguito per 2 o 3 volte Il calore umido è vincolato dall’acqua (vapore). Questa sterilizzazione può essere semplice o- & frazionata (riscaldamento in modo discontinuo a temperature variabili tra 60 e 100 gradi - per 30 minuti). È usata per sterilizzare i terreni di coltura: quella semplice viene utilizzata per terreni che non contengono composti termolabili, mentre quella frazionata per terreni che contengono latte, vitamine o antibiotici. 18  Il calore secco è utilizzato per la sterilizzazione di vetreria, pipette e tutti i materiali termostabili (all’interno di una stufetta). Le temperature e i tempi sono più elevati per quelli utilizzati per la sterilizzazione a calore umido, perché la conduzione del calore in aria secca è meno efficiente rispetto al calore umido. ESPERIMENTO PER INIZIARE: sviluppo di consorzi microbici degradanti la plastica mediante selezione indotta in microcosmi. L’idea di questo esperimento è che l’utilizzo di consorzi microbici potrebbe contribuire a migliorare le prestazioni di biodegradazione della plastica. Questo lavoro va ad occuparsi della selezione e caratterizzazione di consorzi microbici che degradano la plastica, utilizzando una tecnica di arricchimento sequenziale e indotto da microcosmi, che sono stati contaminati artificialmente. Fase 1: creare un ambiente selettivo LLDPE è stato messo in un contenitore da 500 ml con 300 grammi di terreno agricolo del sud-est della spagna. Questi contenitori sono stati poi incubati per 3 mesi a 30° al buio. Fase 2: arricchire il consorzio mi microrganismi selezionati A 5 grammi del microcosmo contaminato artificialmente sono stati aggiunti 50 ml di soluzione salina minima (MSM), in due flaconi da 250 ml. OBBIETTIVO: studiare la comunità microbica presente in ciascuna coltura di arricchimento, al fine di favorire lo sviluppo selettivo di quei microrganismi, che hanno la capacità di degradare la plastica. Si sono considerati dei microrganismi capaci di degradare la lignina e che possiedono buone probabilità di avere enzimi capaci anche di degradare la plastica; quindi è stato effettuato uno screening dei lignocellulosolitici in un colorante chimico (RBBR). MIGLIORAMENTO GENETICO: consiste in tutte quelle strategia e tecniche volte ad aumentare la variabilità genetica di una popolazione, in modo da selezionare le combinazioni ritenute più utili. VARIABILITA’ GENETICA Una mutazione è un cambiamento ereditabile nella sequenza nucleotidica. Le mutazioni possono insorgere per errori di duplicazione e riparazione del danno infedele. La mutazione è fonte di variabilità genetica su cui agisce la selezione. Le mutazioni possono essere: - Silenti e neutrali: diverso genotipo e uguale fenotipo - Letali: non consentono la replicazione dell’individuo - Modificanti: alterano le caratteristiche non essenziali ma ne consentono la riproduzione (GENOTIPO: sequenza nucleotidica del genoma. FENOTIPO: insieme delle proprietà osservabili). Un MUTANTE è un ceppo cellulare che reca la variazione della sequenza nucleotidica; può essere: - Mutanti morfologici: diversa micro e macro morfologia - Mutanti resistenti: crescono in presenza di agenti che inibiscono la crescita (antibiotici, agenti tossici e virus) - Mutanti nutrizionali: hanno perso la capacità di utilizzare e sintetizzare nutrienti - Mutanti catabolici: mancato utilizzo di fonti di carbonio - Mutanti auxotrofi: perdita delle capacità di sintetizzare dei fattori di crescita LA SELEZIONE 19 È intesa come terreno selettivo, ovvero un sistema per selezionare determinati microrganismi rispetto ad altri. Se io faccio un prelievo da un ambiente, ottengo una quantità enorme di cellule e tipi cellulari (ma non sto parlando di specie). Questi potrebbero essere la stessa specie, lo stesso genere e lo stesso ceppo, ovvero derivare dalla stessa cellula madre che ha proliferato due tipi di cellule diverse. Si parla infatti di tipi macromorfologici: li posso vedere direttamente ad occhio nudo. La selezione può essere: Selezione positiva: rileva delle cellule o colonie perché crescono o mostrano un fenotipo diverso. Selezione negativa: rileva delle cellule o colonie mutanti perché non crescono Una mutazione può essere selezionata se conferisce al ceppo un evidente vantaggio in determinate condizioni; un mutante può essere identificato e selezionato in appropriate condizioni colturali. Per parlare di selezione è necessario definire alcuni parametri importanti. La selezione può agire su un numero di colonie che stanno in una piastra o un numero di cellule che stanno su una piastra. Sulla piastra devo andare a mettere un numero di cellule che possono darmi delle colonie discrete e distinte; non vado mai a mettere una quantità troppo elevata o troppo concentrata altrimenti non ottengo delle colonie distinte e discrete, ma solo una patina. Considerando che il numero massimo di colonie su una piastra Petri è di 300 è necessario distinguere le tecniche di selezione: - Tecniche di selezione che si basano sulla scelta delle colonie mutanti tra tutte le cellule cresciute: SELEZIONE A LIVELLO DI COLONIA. - Tecniche di selezione che si basano sulla crescita delle sole colonie mutanti: SELEZIONE A LIVELLO DI CELLULA. L’efficienza delle differenti tecniche di selezione dipende dal numero di cellule piastrabili (CP). Infatti per le selezioni che avvengono a livello di colonia, il valore di CP è circa 10^2, ovvero il numero massimo di cellule che vive accomodabile in una piastra da 90mm di diametro, per avere delle colonie distinte e discrete. In questo caso i tipi di selezione sono: SELEZIONE A VISTA: esistono alcuni caratteri, ovvero le informazioni genetiche, che hanno una loro evidenza a livello del fenotipo, ovvero un colore o altri aspetti macromorfologici. Si ha quindi la selezione di un genotipo attraverso l’osservazione del fenotipo. Questo è un esame visivo di tutte le colonie, ed è una selezione positiva. Esempio: SCREENING BIANCO-BLU. Valutare se un batterio abbia acquisito il plasmide contenente il gene da clonare. Quando i batteri contengono il gene rimangono di colore bianco, in quanto il clone si inserisce nella sequenza del gene e non permette la scissione della molecola organica e la successiva ossidazione che avrebbe portato alla colorazione blu 20  → l’enzima non viene sintetizzato. Quando invece i batteri non hanno il gene, l’enzima beta- galattosidasi scinde la molecola organica e parte di essa viene ossidata, producendo la colorazione blu. SELEZIONE INDIRETTA: il mutante in questo caso non cresce in terreno selettivo. Vado a selezionare ciò che non cresce, quindi ho una selezione negativa. Questo tipo di tecnica è la più efficace delle forme selettive. È spesso utilizzato per selezionare i microrganismi auxtrofi, in quanto sono degli organismi che non sono in grado di crescere se non sono io a dargli i nutrienti necessari, loro sono incapaci di sintetizzare autonomamente un composto a partire da componenti inorganici di base. Esempio: ho delle cellule di un ceppo e voglio vedere quali sono i microrganismi auxtrofi, quindi prima prendo la piastra verde, in cui le piastro in un terreno di coltura permissivo e poi un secondo piastramento sulla piastra gialla, in cui ho messo un terreno in condizioni selettive. Per fare il piastramento utilizzo un tampone, dal diametro uguale o inferiore alla piastra, andandomi a segnare la posizione e la direzione del tampone con una X, in modo da ricordarmi l’esatto punto identico per entrambe le piastre. Il procedimento prevede che prima avvenga il piastramento con il tampone sul terreno selettivo (giallo) e poi sul terreno permissivo (verde): 1. Evito di trasferire gli elementi del permissivo nel selettivo, che altrimenti non sarebbe più tale. 2. Nella prima tamponata trasferisco più cellule, che gran parte moriranno nel terreno selettivo, ciò mi da una maggiore sicurezza per ciò che cresce o meno. La colonia che nel selettivo non crescerà è la colonia che stavo cercando. 21 Nel caso delle selezioni che agiscono a livello di cellula, il valore di CP è di 10^7-10^8, ovvero il numero massimo di cellule che vive accomodabile in una piastra, considerando che solo poche daranno vita alle colonie che rappresentano il risultato stesso della selezione. In questo caso i tipi di selezione sono: SELEZIONE DIRETTA: in questa tecnica impongo delle condizioni selettive tali da far crescere solo i microrganismi di mio interesse. Vado ad utilizzare dei terreni di coltura selettivi con antibiotici. Esempio: terreno selettivo con ampicillina. Vado a valutare se il batterio ha acquisito il plasmide contenente il gene da clonare. Nel terreno selettivo in cui è presente l’ampicillina come agente di selezione, vanno a crescere solo i batteri che hanno acquisito quel determinato gene, ovvero chi ha il plasmide. Questo tipo di selezione è positiva, perché vado a cercare chi cresce. SELEZIONE INDIRETTA-INVERSA: in questa selezione si fanno crescere solo le cellule d’interesse imponendo delle condizioni selettive differenziali. Esempio: i prototrofi, grazie a URA3 sono in grado di ricavare la fluoro-uracile a partire dall’acido fluoro-orotico (perché URA3 codifica per l’orotidina fosfato decarbosssilasi). Il fluoro che viene liberato nell’ambiente è tossico, quindi le cellule che fanno questa reazione muoiono, visto che hanno URA3 funzionante. Vado a selezionare i micorganismi auxotrofi, che sono mutanti per URA3 e quindi non compiono tale processo → vado a selezionare le colonie che crescono in determinate condizioni. Questa tecnica è di uso strettamente genetico: alcune sostanze possono avvelenare le cellule e favorire la crescita di auxtrofi, come ad esempio l’acido fluoro-orotico che uccide le cellule in grado di produrre uracile. PIANIFICAZIONE DI UN ESPERIMENTO DI SELEZIONE È possibile andare a calcolare il numero di piastre necessarie (P) per un dato tipo di selezione, avendo a disposizione una determinata frequenza (f) del carattere di selezione, ovvero la frequenza di mutazione, e l’efficienza della selezione (E). 22  Calcolo del numero di piastre necessarie (P) e dell’efficienza della selezione (E) in ciascuna tecnica di selezione: selezione sucellule selezione su colonie ESERCIZI SULLA SELEZIONE: - - Metodo a Vista lecenule piastrabili sono 102 , considerando la selezione a vista. cemme da esaminare per vedere almeno un mutante - 107 gialle e 107 rosse K NP. =. 1072 10. NP = N. metodo direMo cemule piastrabili 107, avendo scelto il metodo diretto ceme da esaminare per vedere almeno un mutante - 108 amoxicillina K 108 tretraciclina ↑ N P.. = 3. 1083 1030. 100 penicillina G k 1 = metodo diretto cemme piastrabili - 107 cemme da esaminare per vedere almeno un mutante - 105 Los per simultaneità. NP. = t 105. 105 = 1000 = 1. 103 23 metodo indiremo cemule piastrabili + 102 da esaminare cemme per vedere almeno un mutante - 105 D N.. = 105 = 4000 = 4. 10 metodo indiremo inverso celue piastrabili - 107 cemme da esaminare per vedere almeno un mutante - 108 N P.. =. 108 = 10 07 CURVA DI CRESCITA Una curva di crescita descrive l’andamento della popolazione ideale nel tempo. Le fasi non sono riferite a singole cellule, ma è la comunità microbica ad essere rilevante da un punto di vista ecologico. La curva di crescita è un grafico ottenuto dalla misura della densità cellulare in funzione del tempo, in un sistema chiuso detto Batch. FASE DI LATENZA (LAG) L’energia metabolica è utilizzata per adattarsi alle condizioni o recuperare da uno stato di quiescenza. Le cellule in piena attività metabolica (ovvero in fase esponenziale) che sono inoculate nello stesso terreno con uguali condizioni ambientali, avranno una fase Lag molto breve o addirittura assente. In questa fase le cellule non si dividono, quindi non si ha l’aumento della densità cellulare. FASE ESPONENZIALE Durante questa fase vengono prodotti i METABOLITI PRIMARI, ovvero sostanze essenziali per lo sviluppo delle cellule, come per esempio amminoacidi, nucleotidi, proteine, acidi nucleici, glucidi e lipidi. Tutti questi metaboliti primari sono comuni nelle vie biosintetiche della maggior parte dei microrganismi. L’utilizzo delle risorse nutrizionali è finalizzato solo alla crescita dei microrganismi e in questa fase la velocità di crescita è massima. Questa velocità è influenzata dalle condizioni ambientali (temperatura, pH e 24 disponibilità dei nutrienti) e dalle caratteristiche del microrganismo → nei procarioti la velocità di crescita è maggiore rispetto a gli eucarioti. Questa conseguenza è data anche dalla diversa complessità della cellula e perché nei procarioti la trascrizione e la traduzione avvengono contemporaneamente, mentre nelle cellule eucariote no. In questa fase è massima la sensibilità delle cellule a gli stress. Il numero delle cellule in fase esponenziale RADDOPPIA durante un intervallo di tempo costante: L’aumento delle cellule in fase esponenziale è approssimato ad una progressione geometrica in base 2: tempo crescita (t) n= - tempo generazione (g) Il fattore n rappresenta il numero di generazioni, ovvero quante divisioni si sono verificate nel periodo di crescita, che viene calcolato come: tempo di crescita (t)/tempo di generazione (g). Esempio: se una cellula si duplica ogni 30 minuti, quante divisioni si sono verificate in 4 ore (240 minuti)? → 240/30 = 8 generazioni (n). Vi è una relazione tra il numero di cellule prima e dopo la fase esponenziale data da: N = N0 * 2n in cui N rappresenta il numero di cellule finali ed N0 è il numero di cellule iniziali. Formule da ricordare: 25  tempo di generazione Unità di tempo Velocità di divisione b =Is -10g10(N) 10g10 (No regola logalbl - = - logaritmo a= 2 + log10 2 = 0. 301 C = 10 Per ottenere questi parametri in modo più facile, è oppirturo passare da una curva esponenziale ad una scala semi-logaritmica, in cui nell’asse delle X troviamo il tempo in scala aritmetica e nell’asse delle Y troviamo il numero delle cellule in scala logaritmica (log 10^n). La funzione esponenziale: È descritta dall’equazione differenziale → dN/dt = k*N. il tasso di crescita N al tempo “t” è proporzionale al valore della popolazione in quel determinato tempo N(t). integrando questa equazione esponenziale ottengo → N = N0 * e∆t da cui otteniamo ln N = ln N0 + k * ∆t. La funzione semi-logaritmica: 26 questa è descritta dall’equazione della retta → y = mx + q. esempio: se la popolazione raddoppia in 20 minuti abbiamo che k = (ln N – ln N0) / ∆t → se g è uguale a ∆t allora abbiamo → N = 2*N0 e k è uguale a → k = ln2 / g - > k 2 ,3 =. NogN se trasformiamo il logaritmo naturale in log allora otteniamo che k è la velocità specifica di crescita che equivale alla pendenza della retta m che infatti è uguale a → m = dy/dx FASE STAZIONARIA Durante la fase stazionaria si ha la produzione dei METABOLITI SECONDARI, sintetizzati da intermedi o da prodotti del metabolismo primario. La loro sintesi è legata alla diminuzione dei nutrienti disponibili ed è caratteristica di alcuni gruppi tassonomici come per esempio i funghi e i batteri, soprattutto quelli sporigeni. In generale, se prima la produzione di metaboliti primari era comune a tutti i microrganismi, la produzione dei metaboliti secondari è specifica per ogni microrganismo. In questa fase la crescita delle cellule rallenta, fino a bloccarsi, infatti non si ha l’aumento della densità cellulare. Questo arresto è dovuto da vari fattori, tutti collegati alla morte delle cellule (la divisione è in confronto alla morte cellulare, quindi la densità cellulare non aumenta perché le cellule che muoiono sono uguali alle cellule che si dividono): - Esaurimento dei nutrienti - Accumulo delle sostanze di rifiuto - Elevata densità cellulare Nella fase stazionaria si ha un importante cambiamento dell’espressione genica delle cellule, le quali hanno sviluppato una maggiore resistenza a gli stress (la mancanza dei nutrienti induce nei microrganismi degli atteggiamenti di difesa che sono molto utili contro gli stress). Le cellule sono morfologicamente più piccole, in quanto si ha il compattamento del nucleo e la riduzione in termini di volume del citoplasma. FASE DI MORTE In questa fase le cellule si rompono per lisi e il metabolismo si interrompe, in quanto non vi è più il meccanismo di replicazione cellulare. Le cellule che muoiono sono di più delle cellule vive, quindi si ha una diminuzione della densità cellulare. CURVA DIAUXICA Questa curva è caratterizzata dalla presenza di due fasi esponenziali, che sono separate da una fase stazionaria per la prima fase esponenziale, mentre per la seconda fase esponenziale questa rappresenta la fase di latenza. 27 Nella fase di latenza vi è un cambio enzimatico: vengono sintetizzati dalla cellula tutti gli enzimi che vi sono necessari per elaborare il secondo substrato. Tutto ciò è dato dal fatto che si ha la crescita del microrganismo su due substrati diversi: quando finisce il primo substrato (il favorito dal microrganismo, ovvero il glucosio), le cellule sono ancora in grado di replicarsi per scissione binaria quindi sintetizzano tutti gli enzimi per elaborare il secondo substrato, che da loro non è il favorito ma non essendoci più il primo utilizzano questo per accrescere. Di solito il secondo substrato può essere il lattosio; questo la cellula riesce ad usarlo come nutriente, ma solo dopo la sintesi degli enzimi adeguati, che non sempre possiede (i microrganismi possiedono sempre, solo gli enzimi in grado di elaborare il glucosio, perché è lo zucchero maggiormente utilizzato). 1 sola fase di latenza effettiva Quello che differenzia la fase Lag dalla fase stazionaria è la MORTALITÀ, che vediamo nella stazionaria e non nella fase Lag MISURAZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA: a. Metodi turbidimetrici: è una misura indiretta della massa cellulare, mediante determinazione della torbidità. Il fenomeno della torbidità è dovuto alla diffusione della luce da parte di cellule che la riflettono e la disperdono. Questa misura viene fatta con lo spettrofotometro. È uno strumento composto da una sorgente ad una determinata lunghezza d’onda (che possiamo decidere noi) che attraversa il campione contenuto della cuvetta, con un cammino ottico noto; successivamente la luce trasmessa colpisce il detector che ci dà la nostra misurazione. Il numero che ci dà la misurazione è chiamato OD (densità ottica). La densità ottica spesso non è mai quella effettiva (OD600), in quanto il nostro strumento ha un limite di lettura pari a 0,8 per quella determinata lunghezza d’onda, ovvero 600 nm; spesso quindi le soluzioni vengono diluite e quindi per calcolare poi la densità cellulare effettiva bisogna riportare la densità ottica al suo valore effettivo, moltiplicandola per i fattori di diluizione. b. Conte totali: è una conta diretta fatta al microscopio, utilizzando le camere di conta. 28  LE DUE CURVE DI CRESCITA: conta vitale e conta totale Quello che differenzia la fase Lag dalla fase stazionaria è la Le cellule nella conta vitale MORTALITÀ, che vediamo nella sono quelle coltivabili, stazionaria e non nella fase Lag mentre nella conta totale si considerano tutte le cellule presenti (che numericamente parlando sono di più). Quindi il punto di partenza nella conta totale sarà più alto. Nel fase di morte vi è un altra grande differenza: nella conta totale non vi è una vera fase di morte fin quando la cellula non si lisa e si passa alla fase di lisi. Mentre nella conta vitale la fase di lisi non esiste, ma esiste solo la fase di morte Per riuscire ad unire i due metodi (metodo turbidometrico e conte) bisogna costruire una RETTA DI TARATURA. Andare a tarare uno strumento vuol dire trovare la corrispondenza tra la misura che un certo strumento fa e la misura reale. solo in base alla diluizione varia indipendente >La densità cambia, cambia ottica in basedel in funzione rappresenta al valore valore di la di OD. variabile La densità cellulare è il valore che non cambia (io ho una colturamentre la densità con quel cellulare determinato rappresenta numero quellailche di cellule) mentre DC. La densità ottica è la cosa più veloce che possiamo ricavare, ma quello che a valore di OD noi interessa è trovare la misura di densità cellulare. Quest’ultima DIPENDE dalla sospensione che andiamo ad analizzare, ovvero dal microrganismo. Le sospensioni che hanno lo stesso OD non hanno la stessa densità cellulare, se si tratta di analizzare due microrganismi diversi. La retta di taratura ci permette di legare la densità ottica di quella popolazione con la densità cellulare. Questa relazione la possiamo studiare per ogni microrganismo: la retta di taratura la facciamo avendo delle sospensioni di cui noi contiamo le cellule con il metodo Thoma-Zeiss e di queste misuriamo la densità ottica, ovvero la luce diffusa. Se noi abbiamo i valori di Y e X possiamo calcolare matematicamente il valore di q e m (dato che l’equazione della retta è y=mx+q). Di solito vengono calcolate con delle funzioni excel, ma se non le avessimo si calcolerebbe m come il rapporto tra la differenza di delta y e delta x. Il delta y è la differenza di densità cellulare della sospensione A e della sospensione B. Mentre il delta x è dato dalla differenza della densità ottica tra la sospensione A e B. il valore di q è uguale a → q=y-mx. 29 La y rappresenta la densità cellulare mentre la x rappresenta la densità ottica; entrambi i valori li si possono ricavare in laboratorio. In excel andiamo a costruire un grafico a dispersione mettendo sull’asse delle X appunto la densità ottica, mentre sull’asse delle Y le cellule derivanti dalla conta al Thoma-Zeiss, ovvero la densità cellulare (cellule a ml). Nella funzione excel ciò che ci indica se la nostra retta va bene o meno è il valore di R2. Questo è un valore compreso tra 0 e 1: più questo valore è vicino a zero e più la nostra retta è sbagliata, in quanto i valori di y e x sono molto distanti, quindi il nostro obbiettivo è avere un R2 quanto più vicino a 1. Ciò che facciamo è un INTERPOLAZIONE, ovvero individuare nuovi punti del piano cartesiano a partire da un insieme finito di punti dati, nell’ipotesi che tutti i punti si possano riferire ad una funzione in cui f(OD)=DC. R quadro ci sta ad indicare quanto la relazione tra il nostro valore x e y sono distaccati dalla retta ideale. Se noi abbiamo calcolato male un punto, questo non starà sulla retta e quindi R quadro si abbasserà. ESERCIZI CURVE DI CRESCITA:. 1 Obreale = 0.25 10 2 = S.. DC = 22 , 5. 10 %. (OD600-2) 106. DC = , 5 100 (5-2) 12. ·. 100 = 60 5 106... 2 y mx + q + = DC = m OD + - q È questi valori di o non vientrano nel range m( quindi non li considero _ = (2 D(1) = - COD2- OD1) DC (D(1) q = -. OD = CODC-OD1) = 15 - (16 1). = - 1. 3 N No =. 2 At1g N = 5. 106. 2240130 = 5. 106 28. = 128 106. No = 5. 10s cellule/m) g = 30 minuti At = 4h = 240 minuti 30 4 - 2 A49 N = No. -No = te No =10-10-161 Df = 512. 10° = 29 10. : celue/m) 9 = 180 minuti At = 24h-4. 30h-4 30h. = 24h-gh = 15h = 900 minuti o 5 + /9 2 N = No > - At 109 AtN-log - = · 9 0 , 301 DF 108 = Di = 0. 5. 106 At = 2. 1092 = C 7. 64. = 15 9 = 2h 108 logo s 106 At = 2 100./ - ,. = 2 7, 64. = 15 28 , 0. 301 15, 28 = 15 + (0, 28 60). = 15. 17h e 6 No 2 At19 At 10gg = N = At. - = · logN-logNo DF 192 109 =. g-2801 4. = 05h Di = 0 ,75 106 109192 10° 1090 106. ,75. -. At = 20h & +totale-tlatenza g = 0 5h. = 30 min = 20-16 = 4h STATISTICA Per valutare che un dato sia affidabile dobbiamo affidarci alla statistica. Questa ci serve per descrivere una serie di dati (numeri, valori). Quello che dobbiamo tener conto sono 3 proprietà: - Posizione: moda, mediana e media - Dispersione o variabilità: scarto quadratico medio, varianza e range - Forma: asimmetria e curtosi MODA: quando abbiamo a che fare con una frequenza (il valore più frequente). MEDIANA: è il valore al di sotto del quale cadono la metà dei valori campionati. MEDIA: mostra i valori centrali dei dati. Esempio di distribuzione dei dati: 1 1 2 1 3 4 12 6 15 La prima cosa da fare è ordinare i valori in modo crescente: 1 1 1 2 3 4 6 12 15. Questi numeri occupano ognuno una posizione. La mediana è la posizione in cui cadono la metà (50%) dei numeri: se noi abbiamo 9 numeri prendo il numero che sta nella 5° posizione, ovvero in questo caso il 3. La media è la somma dei valori diviso il numero di posizioni della serie, per capire come si posizionano i numeri; qual è il loro valore centrale. La moda è il valore che ha una frequenza più alta, ovvero in questo caso l’1. INDICI DI VARIABILITA’ 31 A volte capita di avere distribuzioni che hanno la stessa media ma forma diverse. Allora l’indice di posizione non ci descrive a pieno la distribuzione. La variazione dei dati rispetto alle media cambia, ciò va considerato. Se io considero una variazione avanti di 10 e una variazione di -10 indietro, alla fine lo scarto è 0. - Devianza è la misura di quanto ogni dato si discosta dalla media. È la somma dei quadrati delle deviazioni della media → scarto quadratico. - Varianza (scostamento dal valore centrale) è una stima della variazione, è la media dello scarto quadratico. È la somma dei quadrati delle deviazioni della media diviso la somma del numero di osservazioni → scarto quadratico medio - Deviazione standard è la radice quadrata della varianza. È usata per avere un valore reale rispetto alla media, che la varianza non può esprimere perché verrebbe un valore più alto della media, ma facendo il suo quadrato otteniamo un valore reale. - Coefficiente di variazione è il rapporto tra la deviazione standard e la media. Ci descrive quando si discostano i nostri valori da gli altri. Deve essere minore del 10% questo perché è un sistema biologico e i microrganismi non sempre si replicano allo stesso modo. Utilizziamo excel per gestire i dati raccolti. Si tratta di conta VITALE, in cui abbiamo dei valori da seguire che vengono gestiti direttamente da excel che ci dice se questi valori sono dentro o fuori dal range: SE(E(CELLA>30;CELLA - il biosaggio si efferma partendo da diverse concentrazioni di principio attivo Il biosaggio è un saggio biologico che ha il fine di stimare la concentrazione di determinati principi attivi, mediante la misura dell’attività del principio attivo stesso, su un sistema biologico. Non si va a determinare la componente chimica, né la concentrazione, ma l’EFFETTO DEL PRINCIPIO ATTIVO che provoca su un determinato organismo. Il principio attivo può essere: - Un elemento nutritivo - Una sostanza tossica - Un farmaco - Un fertilizzante - Una miscela di questi composti (formata da due o più di loro) Per individuare la presenza di questi principi attivi ciò che andiamo ad utilizzare sono i BIOINDICATORI, che sono degli ORGANISMI che rivelano la presenza del principio attivo attraverso: la loro presenza più o meno abbondante, la loro assenza, il cambiamento della loro struttura (fisiologica o comportamentale) o l’alterazione dell’ambiente in cui vivono. Le caratteristiche da considerare prima di scegliere un bioindicatore sono: - Che sia un organismo facilmente identificabile - Deve avere stretti intervalli di tollerabilità - Deve essere ampiamente distribuito - Deve possedere una limitata mobilità e un ciclo vitale sufficientemente lungo. In laboratorio per esempio abbiamo osservato che diverse concentrazioni di etanolo avevano effetti diversi su due microrganismi che avevamo preso come bioindicatori. La crescita o meno dei bioindicatori ci riconduceva alla concentrazione di etanolo. Noi in laboratorio avevamo il Saccaromyces cerevisiae e Hanseniaspora Uvarum, che avevano due capacità diverse di resistere alle concentrazioni etanolo. Avere degli intervalli di tollerabilità ristretti significa avere la capacità di alterare la vitalità delle cellule o delle loro condizioni metaboliche in funzione dei cambiamenti della concentrazione del principio attivo, che siano cambiamenti piccoli o grandi. Prendendo sempre in esempio quei due bioindicatori vedevamo che Hanseniaspora ad una concentrazione del 5% di etanolo cresceva, mentre ad una concentrazione del 10% cessava di crescere. Più è breve l’intervallo di cambiamento di una concentrazione e più è sensibile il biosaggio. Degli esempi di bioindicatori sono: l’alga pseudokircheneriella subcapitata, che è un organismo unicellulare con cui viene valutata l’inibizione della crescita attraverso un test cronico. La risposta finale viene valutata attraverso l’inibizione della crescita di quest’alga in presenza di sostanze tossiche. Il batterio vibrio fischeri, che è un organismo unicellulare con cui viene valutata l’inibizione della bioluminescenza attraverso un test acuto. La risposta finale viene valutata attraverso una riduzione di bioluminescenza in presenza di sostanze inibenti per l’organismo. 33 Un altro esempio è il crostaceo daphnia magna, un organismo pluricellulare, con cui si valuta l’immobilizzazione dell’individuo attraverso un test acuto. È un biosaggio sensibile all’inquinamento dato da metalli pesanti. (TEST CRONICO: 72 ORE. TEST ACUTO: 15 MINUTI). BIOSAGGI APPLICATI AL BIOMONITORAGGIO - Indice diatomico di eutrofizzazione/polluzione: si basa sulla sensibilità della DIATOMEE ai nutrienti, alla sostanza organica e al grado di mineralizzazione del corpo idrico. Queste diatomee sono delle microalghe che sono idonee per il monitoraggio delle acque correnti perché presentano un elevato numero di specie a differente valenza ecologica. Presentano inoltre una diversa sensibilità all’inquinamento da sostanze organiche e dalle variazioni di salinità. Hanno una particolare risposta al cloro e all’eutrofizzazione. Questo è un processo degenerativo delle acque, indotto da eccessivi apporti di sostanze con effetto fertilizzante, che vengono trasportati al mare dai fiumi e dagli insediamenti costieri. - Indice di purezza atmosferica: esprime un indice della purezza dell’aria in base al numero, alla frequenza e alla tolleranza dei LICHENI EPITIFI. Ogni specie lichenica presenza delle esigenze, ovvero l’acidità del substrato e la disponibilità di nutrienti o acqua o luce. L’insieme delle specie presenti si dà informazioni sulle caratteristiche ambientali chimico-fisiche. - Test Microtox: utilizza il batterio marico vibrio fischeri, che come detto prima produce bioluminescenza, che va ad inibirsi quando siamo in presenza di sostanze tossiche. PERCHE’ VENGONO FATTI I BIOSAGGI? A volte la presenza di contaminanti, soprattutto se tossici, è così bassa che non ci sono degli strumenti analitici che la riescono a rilevare, mentre invece i micro e i macro organismi sono sensibili a questo rivelamento (effetto visibile sulla popolazione). Lo strumento non è in grado di catturarlo, mentre l’aumento o la diminuzione di un organismo ci dice se siamo in presenza di qualcosa estraneo all’ambiente. SAGGI DI FARMACO SENSIBILITÀ Il saggio per la determinazione della sensibilità a gli antibiotici è chiamato ANTIBIOGRAMMA, l’organismo migliore per questo biosaggio è un batterio che ci fa capire la resistenza ad un partciolare antibiotico. Mentre il saggio per determinare la sensibilità a gli antimicotici è chiamato ANTIMICOGRAMMA, per questo saggio utilizziamo microrganismi eucariotici, come per esempio i lieviti. Questi due biosaggi sono molto utili per: - Stimare l’attività di un determinato farmaco verso una specie - Predire l’efficacia clinica del farmaco - Guidare la scelta del farmaco da utilizzare in caso di un’infezione batterica o fungina. Per fare queste valutazioni però necessitiamo di due valori “range”: MIC e MBC. La MIC è la concentrazione minima di antibiotico in grado di inibire la crescita microbica (se togliamo l’antibiotico la crescita riprende). La MBC è la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di uccidere il 99% della popolazione microbica (se la togliamo la crescita non riprende, in quanto gli organismi ormai sono morti). La MIC ci mostra le categorie utilizzate dall’antibiogramma, ovvero la sensibilità, la sensibilità intermedia e la resistenza. A seconda dell’effetto che un antibiotico ha su una popolazione microbica allora vengono categorizzate. Il valore che noi utilizziamo in vitro diventa una predizione di efficacia, ovvero valutiamo le diverse concentrazioni di etanolo, per esempio, e notiamo un’inibizione della crescita, allora quel valore di concentrazione diventa il nostro valore MIC, mentre quello ottenuto in vitro diventa il valore utilizzato per capire la quantità di antibiotico da somministrare. 34 La MIC deve considerare il fatto che non deve essere dannosa per chi assume il farmaco, dobbiamo aggiungere una dose di antibiotico che va ad inibire il microrganismo (senza ucciderlo) ma senza causare danno a chi assume il farmaco. Questi valori di MIC vengono decisi da dei comitati che fanno analisi per valutare l’efficacia che l’antibiotici hanno sulle popolazioni. In Europa questo ente è l’EUCAST, che definisce i valori di sensibilità, sensibilità intermedia e resistenza: - Sensibile: quando la quantità bassa di antibiotico ha un effetto inibente sul microrganismo e non nuoce a chi assume il farmaco. - Sensibilità intermedia: se la quantità di antibiotico ha un effetto PLACEBO e bisogna somministrare una quantità al limite fra il danno e l’efficacia. - Resistente: la quantità di antibiotico da somministrare è superiore a quella che una persona riesce a tollerare. Questi valori risultano dal paragone del valore MIC con il Breakpoint clinico. I breakpoint clinici sono due valori, stabiliti da agenzie internazionali, che servono per valutare se un ceppo sia classificabile come "Sensibile", "Intermedio" o "Resistente". Questi valori sono esclusivamente riferiti alla coppia microrganismo-antibiotico. Quindi cambiando una delle due variabili (o il microrganismo o l'antibiotico), i valori cambiano. Esempio: l'antibiotico amoxicillina Per ogni coppia (microrganismo-antibiotico) le agenzie indicano questi due valori sulla base di: 1. Frequenza di distribuzione del valore di MIC (quante volte è stata osservato che uno specifico microrganismo è suscettibile ad una precisa concentrazione dell'antibiotico testato) 2. Meccanismi di resistenza, messi in atto da qualche ceppo dello specifico microrganismo, già identificati e resi noti 3. Livelli di efficacia nel paziente. Questi dipendono da fattori propri del farmaco come la velocità di distribuzione e l'effetto tossico I Breakpoints sono strettamente legati ai concetti di: - Sensibilità: Somministrando l'antibiotico ad una concentrazione pari al valore di break point più basso dei due (valore standard), c'è una elevata probabilità di inibire la replicazione del microrganismo 35  - Sensibilità intermedia: se viene innalzato il livello di esposizione (nuova definizione di Intermedio): Somministrando l'antibiotico ad una concentrazione pari al valore di break point più alto due, c'è una elevata probabilità di inibire la replicazione del microrganismo. - Resistente: Il microrganismo ha una bassa probabilità di essere inibito anche somministrando l'antibiotico ad una concentrazione pari al valore di break point più alto due. Per inibire il microrganismo servirebbe una dose troppo elevata che potrebbe risultare tossica per chi la assume. I valori dell’EUCAST vengono dati dalla farmacocinetica e dalla farmacodinamica; questi vanno a studiare il percorso e il tempo che impiega un antibiotico ad arrivare al sito di infezione (ovvero dal momento in cui viene ingerito fino al momento che non arriva al sito di infezione). Tutto ciò concorre a capire la dose da somministrare al paziente. FARMACODINAMICA: studio degli effetti dei farmaci sull'organismo. FARMACOCINETICA: studia gli effetti che i processi dell'organismo hanno sul farmaco I risultati si ottengono anche dall’ATTIVITA’ CLINICA mediante correlazione tra i risultati in vitro (MIC) e in vivo, ovvero la risoluzione di casi clinici. COME SI OTTENGONO I VALORI DI MIC? Vengono utilizzate due tecniche: DISC DIFFUSION TEST o TEST DI KIRBY-BAUER: un dischetto viene imbevuto di antibiotico e viene messo all’interno di un terreno solidificabile (con agar), sopra la quale vengono piastrate 10^7 microrganismi. Quelli che riescono a crescere sono nelle zone in cui l’antibiotico non c’è. Maggiore è l’alone che si crea intorno al dischetto e maggiore è la capacità dell’antibiotico di inibire la crescita e tanto è più sensibile il microrganismo a quell’antibiotico. L’alone indica la non crescita. Il terreno utilizzato si chiama Mueller-Hinton e questo saggio ci permette di valutare la capacità di resistenza o sensibilità ad un antibiotico di vari microrganismi su terreni solidi. Possiamo mettere più di un dischetto all’interno della piastra e ciò vuol dire testare più antibiotici. Questo test è di tipo qualitativo. E-TEST o MIC su strisce blottate (gradiente di concentrazione): questo test avviene sempre su una piastra con terreno solido ma a differenza di un discetto in cui la concentrazione di antibiotico era uniforme, questo è fatto con delle strisce che hanno un gradiente di concentrazione di antibiotico. A seconda dell’alone che si viene a creare, che dipende dalla 36  concentrazione, capiamo qual è quest’ultima che inibisce la crescita. Questo metodo è semiquantitativo, perché sappiamo la concentrazione ma non di quanto inibisce la crescita. Il valore di MIC su un terreno solido dipende molto dal terreno stesso e dalla capacità dell’antibiotico di diffondere in quel terreno. È importante che le dimensioni siano standardizzate: stessa concentrazione di agar e stesso tempo di esecuzione. MIC SU TERRENO LIQUIDO o TEST DELLE MICRODILUIZIONI: come abbiamo fatto in laboratorio, ovvero siamo andati a valutare la capacità di una sospensione liquida di resistere alle concentrazioni di etanolo. La sospensione liquida non ha tutti i limiti che ha