CM5_anomalies_moleculaires_dans_les_tumeurs_UE_onco_2024.pdf

Licence 3 Santé Exploration des anomalies moléculaires dans les tumeurs Dr Anaïs Pujals CHU Henri Mondor Département de Pathologie Secteur d’oncologie moléculaire des tumeurs solides Introduction...

Licence 3 Santé Exploration des anomalies moléculaires dans les tumeurs Dr Anaïs Pujals CHU Henri Mondor Département de Pathologie Secteur d’oncologie moléculaire des tumeurs solides Introduction https://www.fondation-arc.org/sites/default/files/2021-01/fiche_therapiesciblees2020_0.pdf http://www.radiotherapie-hegp.fr/index.php/cancer-traitement/l-immunotherapie https://lacittarevestimentos.com.br/micro-immunoth%C3%A9rapie-effets-secondaires-k.html Introduction Hanahan and Weinberg, Cell, 2011 Introduction Source: The transcriptome.com Biologie moléculaire = discipline carrefour entre génétique biochimie et physique Etude des acides nucléiques: ADN et ARN Plusieurs applications dans différentes disciplines: génétique, détection du génome d’agent infectieux (Covid19) Introduction ADN = A – T – G – C ADN contient des séquences (= gènes) transcrit en ARN, traduits en protéines Mutations peuvent avoir plusieurs conséquences pour la cellule: Protéine tronquée et non fonctionnelle Changement d’acide aminé => protéine ayant une nouvelle fonction Délétion d’une portion de gène => activation d’une protéine en l’absence de signal d’activation Insertions de séquence(s) nucléotidique(s) => activation ou inactivation de protéines QUELLES ANALYSES POUR QUEL ORGANE? La phase pré-analytique…. Voies de signalisation altérées dans les tumeurs Voie des MAPKinases Voie PIK3/Akt/mTOR Analyses réalisées dans les cancers colo-rectaux Analyses réalisées dans les cancers colo-rectaux Cancers colo-rectaux Analyses réalisées dans les cancers colo-rectaux Microsatellites Microsatellites : séquences répétées dispersées dans le génome (mono, di, tri, quadri, penta… nt) 5’ ATCGCTGAAAAAAAAAAAAAAGTTTCGGACT 3’ 5’ CGCTGACACACACACACACACACAGTTTCGCT 3’ Microsatellites : simple séquences with complex evolution Hans Ellegen. Nature Reviews Genetics, 2004 Analyses réalisées dans les cancers colo-rectaux Microsatellites Défaut du système de détection et de réparation des mésappariements (MMR) Altérations de longueur des séquences microsatellites Détecté dans les cellules TUMORALES Analyses réalisées dans les cancers colo-rectaux Syndrome de Lynch / HNPCC Mutation germinale d’un gène du système de détection et réparation des mésappariements (MMR = Mismatch Repair) hMLH1, hMSH2 (le plus souvent) hMSH6, hPMS2 (moins fréquent) Inactivation somatique du second allèle → Instabilité des séquences microsatellites dans la tumeur Analyses réalisées dans les cancers colo-rectaux Détection du phénotype MSI par IHC https://www.lynchscreening.net/implementation/immunohistochemistry-ihc-only-2/ Analyses réalisées dans les cancers colo-rectaux Analyses réalisées dans les cancers colo-rectaux Le circuit du prélèvement Les prélèvements Matériel : Tumeur primitive / Métastase Pièce opératoire, Biopsie, Cytologie Sang Suffisamment riche en cellules tumorales Fixateur : formol +++ (formol tamponné pH7) Durée de fixation adéquate (24-48h) Décalcification ? Importance de la lame HES pour un gain de temps Données cliniques et renseignement sur le prélèvement indispensables ➔ démarche qualité Les prélèvements Les prélèvements Pièce opératoire Nécrose, stroma fibro-inflammatoire → % cellules tumorales ≈ 60% Les prélèvements Biopsie ganglionnaire Macro-dissection impossible → % cellules tumorales 10-20% Les prélèvements Les prélèvements ADN tumoral circulant - Première description en 1948 - ↗ Taux d’ADN circulant chez les patients atteints de cancer - Même anomalies moléculaires que tumeur primitive - Origine: apoptose, nécrose tumorale et lyse CTC - Taux lié à la taille tumorale, la localisation et la vascularisation de la tumeur Crowley, E. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2013 Les prélèvements Recherche altération sans prélèvement tumoral Prélèvement en suivi tissulaire non réalisable Matériel épuisé Mauvaise qualité ADN (métastases osseuses) Prélèvements disponibles pauvres en cellules tumorales Reflet global des différents sites métastatiques Suivi efficacité traitement Rémission moléculaire de la mutation EGFR cible (ex : disparition mutation activatrice EGFR) Détection rechute Réapparition mutation cible Apparition mutation résistance Les prélèvements ADN tumoral circulant Avantages Inconvénients Peu invasif Petits fragments Sans risque Dilution par l’ADN non Répétition dans le temps tumoral circulant Représentatif de l’hétérogénéité tumorale Pas de problème de décalcification des tissus Nécessité d’une technique très sensible! QUELLE TECHNIQUE POUR QUELLE ANALYSE? Le pré-analytique Extraction d’ADN Réalisée àl’aide de l’automate Maxwell Promega 16 échantillons peuvent être extraits en même temps Possibilité de choisir le volume d’élution en fonction de la taille du prélèvement Peut extraire l’ADN à partir de prélèvement issus de blocs FFPE, de culot de cellules congelées et de sang➔ utilisé aussi pour la biopsie liquide PCR en temps réel https://www.3trois3.com/articles/le-test-pcr-comme-outil-de-diagnostic-1-2-principes-de-base_15823/ PCR en temps réel HRM WT muté PCR en temps réel Exemple: Gène KRAS codon 12 et 13 50% des cancers colo-rectaux mutés Design d’un essai Taqman pour chacune des mutations usuellement retrouvées dans cette pathologie GGT-GGC AA A TT CC Une sonde spécifique de l’allèle sauvage Une sonde spécifique de l’allèle mutée muté Pas de traitement sauvage NGS 3 niveaux possibles : génome complet, exome ou liste restreinte d’exons d’intérêt NGS NGS – séquençage ciblé multiplexé Clonal Isolate Amplification Positive Load Chip Ion Sphere™ Particles Sequence et analyse sur Ion S5 Panel colon poumon Ampliseq (hot spots) (14,5 kb / 92 amplicons) KRAS, EGFR, BRAF, PIK3CA, AKT1, ERBB2, PTEN, NRAS, STK11, MAP2K1, ALK, DDR2, CTNNB1, MET, TP53, SMAD4, FBXW7, FGFR3, NOTCH1, ERBB4, FGFR1 et FGFR2 NGS Couverture et profondeur de séquençage Couverture : les régions d’intérêt du génome sont couvertes par un nombre suffisant de lectures (reads) Profondeur : nombre de lectures (reads) obtenues pour chaque base (au minimum 300 X en génétique somatique) Schéma Biancalana 2015 NGS Profondeur = 4240 EGFR L858R fraction allélique mutée : 1369/4240= 32% NGS EGFR del19 fraction allélique mutée : 4700/(4700+1425) = 78% Idylla Automatisation depuis l’extraction jusqu’au rendu de résultat en PDF Résultat en 2h Un gène à la fois, plus couteux si on veut faire plusieurs gènes que le NGS Dans le secteur Dans les cancers colorectaux pour KRAS/NRAS en mode dégradé MSI dans tous les organes Idylla Quelle place pour l’IA en oncologie moléculaire? Quelle place pour l’IA en oncologie moléculaire? Comparaison de 5 modèles de réseaux de neurones convolutifs (CNN) pour trouver celui capable de détecter les cellules tumorales avec un AUC>0,99 Quelle place pour l’IA en oncologie moléculaire? Un modèle a été entraîné pour classer les tumeurs MSS et MSI à partir des données du TCGA sur 315 adénocarcinomes gastriques et 360 CRC FFPE. Quelle place pour l’IA en oncologie moléculaire? Cohorte d’entrainement - TCGA CRC FFPE - TCGA CRC congélation - TCGA adénocarcinome gastrique FFPE Cohorte de validation - DACHS: cohorte allemande pour les CRC FFPE - KCCH: Cohorte japonaise FFPE mais attention, histologie particulière Quelle place pour l’IA en oncologie moléculaire? Les limites de l’étude et de l’outil Outil limité à un type de cancer avec une histologie bien définie Ne peut pas s’appliquer pour toutes les ethnies (ex des cancers gastriques asiatiques) ➔ Nécessité d’améliorer l’outil en l’entrainement avec de plus grosses cohortes La disponibilité du tissu conditionne le résultat➔ meilleurs résultats sur les pièces opératoires que sur les petites biopsies Quelle place pour l’IA en oncologie moléculaire? Quelle place pour l’IA en oncologie moléculaire? https://www.owkin.com/msintuit-crc Quelle place pour l’IA en oncologie moléculaire? Quelle place pour l’IA en oncologie moléculaire? Les limites de l’étude et de l’outil La disponibilité du tissu conditionne le résultat➔ meilleurs résultats sur les pièces opératoires que sur les petites biopsies Merci pour votre attention