Biologie Tissulaire Bases de la Microscopie Op/que 2023-2024 PDF

Biologie Tissulaire Bases de la Microscopie Op/que [email protected] Introduc/on: Défini&on On reconnaît, dans l’organisme différents niveaux d’organisa8on structurale: Niveau de l’organisme en8er Niveau des appareils et systèmes Niveau des organes Niveau 8ssulaire Niveau cellulaire Niveau moléculai...

Biologie Tissulaire Bases de la Microscopie Op/que [email protected] Introduc/on: Défini&on On reconnaît, dans l’organisme différents niveaux d’organisa8on structurale: Niveau de l’organisme en8er Niveau des appareils et systèmes Niveau des organes Niveau 8ssulaire Niveau cellulaire Niveau moléculaire www.edi&on-ellipses.fr Introduc/on: Défini&on - Les %ssus sont faits exclusivement de cellules et de MEC - Seules varient d’un %ssu à l’autre la nature des cellules, la composi%on moléculaire de la MEC et la propor%on rela%ve des cellules et de la MEC - Les %ssus - 1er niveau d’organisa%on supracellulaire - peuvent être définis comme des ensembles coopéra%fs de cellules différenciées qui forment une triple associa%on : territoriale, fonc%onnelle et biologique A. Associa8on territoriale Les 8ssus forment habituellement Des ensembles topographiquement bien individualisés, souvent même par une limite précise comme une membrane basale (MB) qui sépare les épithéliums du 8ssu conjonc8f sous-jacent B. Associa8on fonc8onnelle Qu’il s’agisse d’un ensemble de cellules toutes semblables (8ssu car8lagineux) ou de cellules différentes (système nerveux central), un 8ssu remplit un rôle qui procède de l’intégra8on cohérente quan8ta8ve et/ou qualita8ve de la fonc8on des cellules qui le composent C. Associa8on biologique Chaque 8ssu a des caractéris8ques biologiques qui lui sont propres, sous l’angle du renouvellement cellulaire, des contacts entre ses cellules, de son comportement en culture de 8ssu Introduc/on: Défini&on 4 grandes familles de %ssus Les épithéliums Les -ssus conjonc-fs Le -ssu nerveux Les -ssus musculaires Introduc/on: Les dimensions des cellules Les Cellules : unités de base des organismes, pe=tes et complexes Diamètre Typique d’une cellule ? Animales : 10 -20 μm (1/5 de la dimension de la plus pe-te par-cule visible à l’oeil nu, Végétales : l 30 à 50 μm * L≈100 μm Bactéries : ≈ 0,2 μm Ø L’ Observa=on est réalisée à l’aide de microscopes : - Photonique : source lumineuse = photons - Electronique : source = électrons Un peu d’Histoire Un peu d’Histoire C’était avant-hier … 1674 : Leeuwenhoek fut le premier à observer des organismes microscopiques. John Dollond (Grande-Bretagne ; milieu XVIIIe siècle) Antoni Van LEEUWENHOEK (1632-1723) Un peu d’Histoire C’était avant-hier … Robert Hooke, 1665 contemporain de Leeuwenhoek Désigne par « cellules » les « chambres » observées sur le liège du chêne liège Un peu d’Histoire C’était avant-hier … Beaucoup de marques Françaises disparues (Nachet, BBT, Krauss…) Un peu d’Histoire … Aujourd’hui Peu de changement …. …. de l’aspect général Améliora=on des op=ques …. Les différentes par/es d’un microscope Microscope Leica Oculaire X10 en général Tête Et porte-oculaire Potence Tourelle porte-objecAfs X4, X10, X40,X100 Objec-fs Pla-ne Condenseur Diaphragme Base / Socle Eclairage Réglage intensité lumineuse Bras Chariot et valets Visse macrométrique Visse micrométrique Architecture d’un microscope Grossissement = G = OC x OBJ OCULAIRE x10 (ou x20) Ex : G= 10 x 40 = 400 Tourelle OBJECTIFS x4, x10, x40, x100 Lame + Objet Source lumineuse Condenseur +diaphragme Architecture d’un microscope Microscope inversé : L’éclairage est apporté par le dessus de la préparation : microbiologie, cultures cellulaires Objec5fs Oculaire La Lumière : rappels Nature de la lumière ondulatoire Lumière = Onde électromagné5que corpusculaire Lumière = Photons rela%on de Planck-Einstein Le photon est une par:cule de vitesse c et d’énergie E La Lumière : rappels Défini&ons importantes : La longueur d'onde (λ) = Distance parcourue par l'onde lumineuse durant un temps (T) appelé période. Ainsi on a les rela&ons suivantes : Période = 1 / Fréquence λ = Vitesse x Période soit λ = Vitesse/Fréquence = c / f Rappel important : l'expression "lumière visible » désigne la par/e du spectre électromagné/que comprise entre 400 nm et 760 nm. La Lumière : rappels … se propage par ondes concentriques autour de la source émeYrice. L'énergie lumineuse peut se propager dans le vide sous forme de vibra&ons dont le caractère dominant est d'être sinusoïdal. Dans le vide : sa vitesse de propaga&on notée c est de 2,99 792 458.108 m.s-1 soit d’environ 300 000 km/s = vitesse limite de tout objet matériel Elle est constante dans le vide. Elle est détectée par l'oeil et peut être également détectée par ses effets thermiques, chimiques et électriques. La Lumière : rappels Le spectre électromagné/que : les longueurs d’onde 750 nm 400 nm = 400.10-9 m = 0,4 microns Pearson 2011 Plus les λ sont courtes, plus le rayonnement est énergé/que Les Grands Principes La vitesse dans le vide de la lumière est constante MAIS quand elle traverse des corps transparents, sa vitesse diminue en fonc:on de la nature du milieu traversé. Lors de l'interac5on de la lumière avec la ma5ère, le milieu traversé peut être décrit par une propriété unique : l'indice de réfrac:on, noté n. Cet indice n correspond au rapport des vitesses dans le vide (300 000 km/s) et dans le corps traversé (= vitesse de phase (ν)). Les Grands Principes La vitesse de la lumière dépend de l'indice n pour une longueur d'onde donnée suivant la formule suivante : n=c/ν vitesse de propaga&on dans le vide notée c vitesse de phase notée v L'indice n est toujours supérieur ou égal à 1 Par exemple, dans l'eau, la vitesse de la lumière est de 225 000 km/s, ce qui donne un indice de réfrac&on de l'eau de 300 000 / 225 000 = 1,33. Indices de réfrac&on de quelques milieux : air =1 ; eau = 1,33 ; glycérol = 1,47 ; Huile à immersion du verre = 1,515 ; Baume du Canada 1,4 < n < 1,9 = 1,528 La Réfrac/on La lumière est réfractée (= se courbe ) quand elle passe d’un milieu d’indice donné vers un milieu différent, avec un indice différent L’indice de réfrac:on = caractérise un milieu et mesure la capacité à ralen5r la vitesse de la lumière (courbure) => La direc/on et l’angle de courbure sont déterminés par l’indice de réfrac/on des milieux traversés Indice de Réfrac/on Quand la lumière traverse des corps transparents, sa vitesse est plus ou moins freinée suivant la nature du milieu traversé, le rapport des vitesses dans le vide (300 000 km/s) et dans le corps traversé donne l'indice de réfrac5on du milieu (n). Exemple : dans l'eau, la vitesse de la lumière est de 225 000 km/s, ce qui donne un indice de réfrac5on de l'eau de 300 000 / 225 000 = 1,33. Indices de réfrac5on de quelques milieux : Indice de réfrac5on de l'air = 1 Indice de l'eau = 1,33 Indice du glycérol = 1,47 Indice de l'huile à immersion = 1,515 Indice du verre 1,4 < n < 1,9 Indice du Baume du Canada = 1,528 La Réflexion Un faisceau lumineux qui rencontre une surface polie se réfléchit avec les propriétés suivantes (lois de la réflexion) : 1/ - Le rayon incident - le rayon réfléchi - et la normale …… sont dans un seul et même plan. 2/ L'angle de réflexion est égal à l'angle d'incidence : θ1 = θ2 La Réflexion Le phénomène de réflexion totale : … survient lorsqu'un rayon incident arrive sur la surface de sépara5on de 2 milieux d'indices op5ques n différents avec un angle d'incidence supérieur à une valeur cri5que. ALORS = plus de rayon réfracté MAIS uniquement un rayon réfléchi. 2 condi5ons sont donc indispensables pour qu'il y ait réflexion totale : le rayon incident doit passer … …d'un milieu plus réfringent vers un milieu moins réfringent (cad n1 > n2). L'angle d'incidence doit être plus grand que l'angle limite de réfrac5on. La Réflexion réflexion totale n1 > n2 2 condi&ons sont donc indispensables pour qu'il y ait réflexion totale : le rayon incident doit passer … …d'un milieu plus réfringent vers un milieu moins réfringent (cad n1 > n2). L'angle d'incidence doit être plus grand que l'angle limite de réfrac5on. Les Len/lles Les Len/lles : Réfrac/on et Point Focal La len/lle : focalise la lumière sur un point appelé “point focal” ou “foyer”, symbole F Distance entre le centre de la len&lle et le foyer est appelé “distance focale” ou “focale”, symbole f Foyer f Les Len/lles : Réfrac/on et Point Focal Puissance de la len/lle est liée à sa distance focale f PLUS la distance focale f est courte ….. PLUS le grossissement est important Foyer f Les Len/lles : Exemple des Len/lles Convergentes On peut u5liser deux len5lles combinées pour produire un grossissement plus important mais en plaçant cefe fois l'objet au-delà du point focal. Le résultat est une image réelle, grossie et dans la même orienta5on que l'objet. La qualité des len/lles Les aberra:ons chroma:ques sont induites par : La Varia5on de l'indice de réfrac5on du matériau composant les len5lles en fonc5on de la longueur d'onde de la lumière qui les traverse. = une distance focale variable, de sorte que la mise au point ne peut être effectuée simultanément pour toutes les couleurs du spectre. par exemple : la mise au point est effectuée pour le rouge, le bleu est alors flou : l'image d'un objet blanc présente alors sur ses bords une irisa5on bleutée. Principe du Microscope Un microscope peut-être vu comme 2 len5lles convergentes : – la 1ère produit une image réelle grossie et inversée – la 2nde produit une image virtuelle de la première image – cefe image virtuelle est focalisée par l'œil pour donner une image virtuelle très agrandie à l'infini Le Grossissement des Len/lles Les techniques de microscopie permeYent d’avoir des images plus grandes que leur dimension réelle Le Grossissement = G = D/d = M en anglais (Dimension de l’image (D) / dimension de l’objet réel (d) = “Magnifica/on” (M) La Distance de Travail La distance de travail (WD) = distance entre la surface de la len5lle objec5f et la surface de la lamelle couvre-objet WD diminue avec G, grossissement Len5lle objec5f Où trouver ces informa:ons ??????? Les Objec/fs 10X = Grossissement 0,25 = NA, ouverture numérique 6,1 = WD, working distance, mm Laffray Les changements de milieux Les changements d’indices : induisent des dévia5ons mul5ples Cellule végétale Cellule animale Lamelles (i=1,55) Eau (i=1,33) Lamelles (i=1,55) Eau (i=1,33) Paroi (i=1,42) Cytoplasme (i=1,35) Cytoplasme (i=1,35) Les changements de milieux : réduire leurs effets Indices de réfrac5on : Air : 1 ; eau : 1,33 ; huile = verre : 1,46 ;; Plexiglass : 1,51 huile à immersion è même indice que le verre = meilleure concentra5on lumière Changement d’indice de réfrac5on = perte lumière Rayons perdus nair λ excita7on nf = désexcita-ons non émissive La Microscopie à Fluorescence - Principe 400 nm = 400.10-9 m = 0,4 microns 750 nm L’excita&on et l’émission sont des phénomènes quan&ques : la molécule accepte une certaine quan&té d’énergie pour être excitée et réémet ceie énergie autour d’une valeur privilégiée (= pic d’émission) L’énergie d’un photon est : Eϒ = hc/λ où h et c sont des constantes (Planck : vitesse de la lumière dans le vide) L’énergie d’un photon décroit avec la longueur d’onde Eϒ XL Energie Quelques molécules Fluorescentes GFP = Protéine Fluorescente largement u5lisée Les Photons émis ont une énergie plus faible que le photon absorbé = longueur d’onde plus grande D’où différence entre λ excita5on & λ émission λ excita2on XL λ émission plus longue La Fluorescence Chaque fluorophore (molécule fluorescente) a des spectres d’excita5on et donc d’émission qui lui sont propres, avec une efficacité maximale d’accepta5on des photons et donc d’excita5on (= pic d’excita5on). Les avantages : - Fort rapport signal sur bruit - Spécificité du marquage - Compa5ble in vivo Exemple du DAPI Pic d’excitaAon 4’,6-diamidino-2-phénylindole = DAPI NRJ insuffisante pour excitaAon La Microscopie à Fluorescence - Principe Fluorescéine - excitée par le bleu (450-490 nm) - émet dans le Vert (520-560 nm) λ Analyse λExcita5on Mirroir filtre : Bleu éliminé XL La Microscopie à Fluorescence - Principe Diaphragme de champ Diaphragme-Iris Plaque de contraste Oculaires Pla&ne Lampe halogène Tige des filtres Vis Macro/Micro métrique Rhéostat Racine Monocot Racine Monocot L’autofluorescence de certaines cellules par des composés cellulaires (fréquente chez Plantes) Différence d’autofluorescence entre les 5ssus (cellulosique / lignifié) Tige renoncule Tige renoncule Feuille Monocot Feuille Monocot XL 65 ImmunoFluorescence - Principe Détec/on de structures avec les An/corps An/corps - Se lient à des an/gènes spécifiques, en général des séquences de 5 à 6 amino acides sur les protéines Types d’an/corps Ac Polyclonaux Ac Monoclonaux ImmunoFluorescence - Principe Anticorps Polyclonaux - Injection sous-cutanée, intradermique, ou intramusculaire = maximiser la présence de l’antigène dans l'organisme Mouse Goat Rabbit ImmunoFluorescence - Principe Sérum contenant l'an&corps recherché = an&sérum. Con&ent plusieurs espèces d'an&corps différents (environ une dizaine de clonotypes) dirigés contre plusieurs épitopes (déterminants an&géniques ou sites de liaison) du même an&gène On parle de prépara2on polyclonale. une même molécule d'an/gène peut fixer en même temps plusieurs an/corps différents, chacun sur son épitope spécifique. Chaque an)corps est produit par une cellule secrétrice différente (un lymphocyte B) ImmunoFluorescence - Principe An/corps Monoclonaux spécifiques d’un épitope techniques permeYant d'isoler et de cloner des lymphocytes ne produisant qu'une espèce moléculaire (i.e. clonotype) d’AC Leur spécificité permet de les diriger contre des molécules qui sont des composants mineurs d’un mélange complexe Remarque : La Propor&on d’an&corps polyclonaux contre ces composants mineurs serait trop faible pour qu’ils soient détectés è AC monoclonaux è Fixa&on d’un colorant avec l’AC ImmunoFluorescence - Principe Produc/on des an/corps Monoclonaux Une technique par&culière : = Fusion d’un seul lymphocyte B de souris secrétant un an&corps avec une cellule de tumeur de souris (cellule cancéreuse éternelle) = Hybridomes Georges Köhler et César Milstein (Prix Nobel de médecine en 1984) Þ hybridome qui peut être propagé comme un clone pour produire des AC monoclonaux (lignées cellulaires) Þ On cul&ve des cellules lymphocytaires éternelles (tumorales) donc produc/on con/nue d’AC Microscopie à Fluorescence et An/corps Méthodes d’immunofluorescence : 2 groupes : Direct/Indirecte - Les réac/ons directes : l’an5corps est directement couplé à un fluorochrome = consiste à faire incuber le 5ssu, avec l’an5corps étudié qui a été préalablement couplé à une molécule fluorescente (la fluorescéine ou la rhodamine, par exemple). UV fluorochrome Ac Ag Microscopie à Fluorescence et An/corps - Les réac/ons indirectes : deux étapes : - le 5ssu est mis en contact avec l’an5corps *Rinçage* - incuba5on avec un second an5corps qui est couplé avec le fluorochrome (l’an5corps secondaire est dirigé contre les immunoglobulines de l’espèce où a été produit le premier an5corps) UV fluorochrome Ac IIre Ac Ire Ag Ag Ag Microscopie à Fluorescence et An/corps - Les réac/ons indirectes CeYe seconde technique permets une amplifica/on du signal UV 1- Un an2corps primaire (lapin) est fixé sur l’An5gène fixé sur le support 2- Un an5corps secondaire couplé à un marqueur et dirigé contre les AC de lapin se fixe à plusieurs endroits Ag Microscopie à Fluorescence et An/corps Les microtubules du fuseau : avec un AC vert fluorescent Les Centromères : Avec des AC fluorescence Rose L’ADN est fluorescent en bleu REM : 3 couleurs = 3 images superposées Marquage Fluorescent simple Marquage indirect (ex : immunofluorescence) Avantages : - variété de fluorochromes - coûts rela-vement bas Désavantages : - seulement cellules fixées - long - artéfacts de fixa-on Colora5on (ex : DAPI) Proteine de fusion (ex : GFP) Avantages : Avantages : - sur cellules vivantes ou fixées - plusieurs marqueurs spécifiques pour différents organelles - Marqueurs avec propriétés différentes selon état de la cellule Désavantages : - coûts très élevé - influence le comportement de la cellule - Stabilité - sur cellules vivantes - Suivi en temps réel - Coût rela-vement bas Désavantages : - Nécessite travail lourd de clonage et de transfec-ons - Artéfacts de surexpression - Suscep-ble au photoblanchiment 26 Microscopie à Fluorescence et AC XL 76 Microscopie Confocale à Fluorescence Rappel : En microscopie photonique ordinaire, les /ssus sont obervés sous forme de coupes La sec&on entraîne une perte d’informa&on sur la visualisa&on en 3 dimensions : Observa&on sur un plan de mise au point + profondeur de champ limitée de part et d’autre du plan de mise au point l’image est floue diffusion de la lumière dans l’épaisseur du &ssu Microscopie Confocale à Fluorescence ž La microscopie Confocale permet une visualisa/on en 3 dimensions en intervenant sur la lumière avant la mesure › U&lise des op/ques pour fluorescence › N’éclaire pas l’échan&llon en en&er simultanément : illumine avec un laser un point/plan unique, à une profondeur spécifique de l’échan&llon : on prend n images des n plans analysés et l’informa&que fait une image de synthèse 3D › possible techniquement par la puissance de l’éclairement laser et informa&que (photostacking) Microscopie Confocale à Fluorescence Rappels 1 : Les len&lles focalisent la lumière sur un point appelé “foyer” ou également “point focal” (symbole F) Rappels 2 : La distance entre le centre de la len&lle et le foyer est appelée “distance focale” ou “focale” (symbole f) Microscopie Confocale à Fluorescence L’ouverture en trou d’épingle (Pinhole aperture) face au détecteur est placée en posi&on confocale* avec l’ouverture de l’illuminateur (illumina/ng pinhole) La lumière émise par les régions en dehors du plan de mise au point ne sont pas au foyer, au “pinhole” => rayons exclus exclus Microscopie Confocale à Fluorescence Image Confocale Image ne(e détaillée des cellules de l’embryon Deux microphtographies d’embryon de Drosophile au stade Gastrula Image Conven5onnelle Informa(on hors plan de MAP Floue par la présence de fluorescence des structures Au-dessus et en-dessous du plan de MAP Microscopie Confocale à Fluorescence Source : Microscopie Confocale à Fluorescence 32 Channel Detector Collect Lambda Stack FITC Raw Image Sytox-green Source : Derive Emission Fingerprints Unmixed Image Courtesy: Duncan McMillan, Carl Zeiss Microimaging Bases de la Microscopie Electronique Microscopie Electronique Un peu d’Histoire Les temps héroïques : Ruska et Knoll 1931 Les premiers virus enfin visibles en franchissant le fossé entre 1 micron et 1 nm (10-6 et 10-9 m) (sauf mimi virus). Microscopie Electronique Résout les problèmes de visualisa5on des structures cellulaires par microscopie photonique La rela5on entre la limite de résolu5on et la longueur d’onde s’applique pour toute forme de radia5on La longueur d’onde de l’électron décroît lorsque sa vitesse augmente Rappel : Le pouvoir de résolu5on DR = distance entre 2 points est déterminé par la loi de Rayleigh (simplifiée) : DR = 0,61. l / NA. Avec : DR = Résolution, nm l = longueur d’onde u5lisée, nm NA. = Numerical Aperture = Sinus de la moi5é de l’angle de cône de la radia5on qui entre dans la len5lle Microscopie Electronique Quel microscope ? Soit e- traversent échan&llon (coupes ultrafines) è Transmission Electron Microscopy = TEM ; e- excitent écran/impressionnent pellicule photo Soit e- sont réfléchis par l’échan&llon è Scanning electron Microscopy = SEM ; e- excitent couches superficielles de l’échan&llon massif et permeient de visualiser la surface et analyser sa composi&on chimique Le concept d’un microscope à transmission (TEM) est similaire à celui d’un microscope photonique, mais : Inversé Beaucoup plus gros Microscopie Electronique Quelle u2lisa2on ? - M.E. à Transmission : ultrastructure cellulaire (TEM = Transmission Electron Microscopy), virus - M.E. à Balayage : analyse de surfaces (= SEM Scanning Electron Microscopy) + MicroAnalyse X = composi5on élémentaire de l’échan5llon Microscopie Electronique La Source d’électrons = 1 filament (cathode) ou 1 pointe chauffée qui émet des électrons au sommet de la colonne è colonne obligatoirement sous vide secondaire car e- sont diffusés par les collisions avec les molécules d’air Cathode(-) ž Les électrons émis (par chauffage du filament) : ž Traversent par le Wehnelt (tension +/-néga-ve qui module le flux d’ež sont accélérés par l’anode et traversent un pe-t orifice pour former le faisceau d’électrons ž Sont focalisés par des bobines électromagné-ques - Anode + Microscopie Electronique à Transmission (TEM) 90 Microscopie Electronique à Transmission (TEM) Cependant en MET, des problèmes persistent : En effet, les 5ssus composés d’atomes de faible poids atomique Tels que carbon, oxygène, azote, hydrogène Sont tranparents aux eDonc pour les rendre plus visibles, il faut : une imprégna2on avec sels de métaux lourds Mais le traitement est toxique et peut entraîner des altéra2ons = artéfacts Microscopie Electronique à Transmission (TEM) u Comment obtenir le contraste avec un M.E.? èLes coupes sont contrastées par des composés opaques aux e- : acétate d’Uranyle, acétate ou citrate de Pb (toxiques) èUranyl Acétate : Cible ègroupes Phosphate et Amino è acides nucléiques, protéines èCitrate de Pb : Cible ècomposés chargés néga5vement et sur zones ayant réagit avec osmium èlipides membranes Le traitement peut entraîner des altéra/ons = artéfacts 92 Microscopie Electronique à Transmission (TEM) TEM : microscopie électronique à transmission Coupe transversale de foie de rat la densité des gris et des noirs est fonc5on du degré d’absorp5on /dévia5on des e- Microscopie Electronique à Balayage (SEM) Sonde CAMECA (France) Spectromètres à cristaux Microscopie Electronique à Balayage (SEM) MEB Console Contrôle Diode pour Analyse X Console d’Analyse Informa5que Sas Vue d’ensemble d’un MEB INRA Nancy Doc Laffray Microscopie Electronique à Balayage (SEM) - Principe Principes de base : iden5que à la TEM -canon à e- + anode -len5lles magné5ques MAIS : Bobine = balayage = « scan » èAnalyse différente -Les e- secondaires forment l’image (et non les e- primaires du faisceau direct) -Les e- primaires renseignent sur la composi5on de l’échan5llon Microscopie Electronique à Balayage (SEM) - Principe -Principe de fonc/onnement -Le faisceau d’e- scanne et traverse la surface de l’échan/llon massif (qq microns) et génère des : - électrons rétrodiffusés (backscaiered electrons) - électrons secondaires (interac&on e- primaires-atomes) - Rayons X résultant des processus d’excita&on/désexcita&on des e- des couches atomiques K, L M des atomes de l’échan&llon (interac&ons e- primaires-atomes) -Deux détecteurs en fonc&onnement simultané 1 – des électrons secondaires è image du relief sur détecteur et moniteur avec G 2 types d’analyse des rayons X - WDS = Wavelength Dispersion Spectrometry - EDS = Electron Dispersion Spectrometry Microscopie Electronique à Balayage (SEM) - Principe Prépara2on des Echan2llons -soit lyophilisa5on (pb de déforma5on) -soit pla5ne froide (congelé et maintenu à -100°) Les échan5llons sont rendus conducteurs par dépôt de carbone ou d’or sous vide dans appareil spécial ou dans le MEB Carbone chauffé Echan5llons sur support INRA Nancy Doc Laffray Microscopie Electronique à Balayage (SEM) Bourgeon de membre supérieur d’un embryon de Poulet à 4 jours de Développement Embryon en5er de Poulet à 2 jours de Développement Merci