Clase ELISA y Citometria PDF

Ensayo de ELISA Noviembre del 2023 Principio de la tecnología • El antígeno se inmoviliza en una superficie sólida. Esto se puede realizar de manera directa o usando un anticuerpo de captura inmovilizado en dicha superficie. Cargando… Pasos generales de un ELISA Tipos de ELISA Cargando… ...

Ensayo de ELISA Noviembre del 2023 Principio de la tecnología • El antígeno se inmoviliza en una superficie sólida. Esto se puede realizar de manera directa o usando un anticuerpo de captura inmovilizado en dicha superficie. Cargando… Pasos generales de un ELISA Tipos de ELISA Cargando… El antígeno es inmovilizado a la superficie y es detectado con un anticuerpo especifico para dicho antígeno. El anticuerpo está directamente conjugado a HRP El antígeno es inmovilizado a la superficie y es reconocido por un anticuerpo primario, seguido por la unión de un anticuerpo secundario, dirigido contra el anticuerpo que reconoce al antígeno inmovilizado. Formato de mayor uso. Requiere dos anticuerpos específicos para diferentes epitopes del mismo antígeno. Uno de ellos recubre la superficie del pocillo y sirve como anticuerpo de captura del antígeno. El otro anticuerpo está conjugado, facilitando la detección del antígeno. Mide la concentración de un antígeno por la detección de interferencia de la señal. Se usa un antígeno de referencia que competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo primario. Cargando… Ejemplo de construcción de una curva estándar y calculo de la concentración de una muestra desconocida. Citometría de flujo 19 La citometría de flujo es una técnica basada en láser de uso común que se emplea para contar, clasificar y fenotipar células en una suspensión unicelular. Analiza un elevado número de eventos (1000 a 100000 células) en un corto periodo de tiempo. Realiza medidas, tanto cualittivas como cuantitativas de mas de 15 parámetros de forma simultánea encualquier tipo celular (en suspensión). 20 21 Attune™ NxT Flow Cytometer, blue/red/violet 22 23 Estructura del citometro y análisis de resultados 24 25 26 Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con este causando dispersión de la luz, basándose en la difracción de la luz. La dispersión en sentido frontal, evalua el tamaño de las células que pasan (parámetro denominado Forward Scatter). La dispersión en sentido lateral evalúa la granularidad o complejidad de estas (parámetro denominado Side Scatter 27 28 Esquema del funcionamiento y selección de células en un citómetro de flujo Cargando… 29 ¿Cómo represento los resultados? Validación de la identificación de la población celular pesquisada Histograma 30 31 32 •Lymphocytes: average diameter = 8.5 µm •Neutrophils: average diameter = 8.85 µm •Monocytes: average diameter = 15 µm •Eosinophils: average diameter = 14.5 µm •Basophils: average diameter = 15 µm 33 34 35 36 Determinar las poblaciones linfocitarias sanguíneas: ¿Cómo? (+ , -) (+ , +) (- , ) Se marca la población diferentes anticuerpos celular con (- , +) Resultado de la citometría 37 38 Evaluación de la viabilidad de los espermatozoides mediante microscopia de fluorescencia Verde: vivo, Acrosoma + Rojo: Célula muerta Verde/rojo: Acrosoma + /muerto Sin marca: vivo/acrosoma - 39 40 FIGURE 1. Flow cytometric presentation of a PTCL. (A) Forward scatter (FSC) vs. side scatter (SSC) plot after doublet exclusion showing a unique population of medium-to-large sized cells. (B,C) CD5 vs. CD21 plot (B) and CD3 vs. CD4 plot (C) of P2-gated cells showing a predominant population of CD5+CD3+CD4+ cells. 41 42