Chapitre 1: Les Molécules du Vivant (PDF)

L1SpS - UE2 2023-2024 Les Molécules du Vivant: Acides aminés, Protéines, Enzymologie Valérie Lamour Note: Ce document est le support de cours définitif 2023-2024, déposé dans l’espace Moodle de l’UE2 à l’issue des cours magistraux. Le document est à usage exclusif des étudiants de L1SpS et ne pas...

L1SpS - UE2 2023-2024 Les Molécules du Vivant: Acides aminés, Protéines, Enzymologie Valérie Lamour Note: Ce document est le support de cours définitif 2023-2024, déposé dans l’espace Moodle de l’UE2 à l’issue des cours magistraux. Le document est à usage exclusif des étudiants de L1SpS et ne pas être diffusé pour un autre usage sans autorisation de l’enseignant.  Introduction Échelle du vivant: https://learn.genetics.utah.edu/content/cells/scale/  Introduction Transcription Traduction Acide désoxyribonucléique Acide ribonucléique Acide aminé Métabolisme Glucides, lipides  Polymères Acide désoxyribonucléique Acide ribonucléique Protéines 4 bases A, T, C, G 4 bases A, U, C, G 20 Acides aminés naturels  Les protéines Transcription Traduction Ce sont les protéines qui portent la fonction. Les éléments de base : les acides aminés Formule générale d’un acide α-aminé α NH2 CH COOH α R Radical, Chaîne latérale  Les acides aminés cas de la glycine Série D et Série L & principalement Représentation de Fischer  Les acides aminés (aa) Les acides aminés sont des ions dipolaires (zwitterion) dans leur état naturel : Ils sont solubles dans l’eau, comme les composés ioniques. Les acides α-aminés naturels : – aa synthétisés par l’organisme – aa essentiels, ceux qui ne peuvent être synthétisés par l’être humain et doivent donc être apportés par l’alimentation 20 aa : éléments de construction des protéines. Les acides aminés à 1 fonction amine et acide Nom Symbole Formule Propriétés AA essentiels Glycine Gly (G) Apolaire Apolaire, hydrophobe : soluble dans les solvants organiques Alanine Ala (A) Apolaire Valine Val (V) Oui Apolaire Les acides aminés à 1 fonction amine et acide Nom Symbole Formule Propriétés AA essentiels Leucine Leu (L) Oui Apolaire Isoleucine Ile (I) Oui Apolaire Les acides aminés à 1 fonction amine et acide Nom Symbole Formule Propriétés AA essentiels Sérine Ser (S) Polaire Non ionisable Polaire, hydrophile : Forme des liaisons hydrogène avec H2O Thréonine Thr (T) Oui Polaire Non ionisable  Les acides aminés acides et leurs dérivés amides Nom Symbole Formule Propriétés AA essentiels Acide Asp (D) aspartique Polaire ionisable Asparagine Asn (N) Polaire Non ionisable  Les acides aminés acides et leurs dérivés amides Nom Symbole Formule Propriétés AA essentiels Acide Glu (E) glutamique Polaire ionisable Glutamine Gln (Q) Polaire Non ionisable  Les acides aminés basiques Nom Symbole Formule Propriétés AA essentiels Lysine Lys (K) Oui Polaire ionisable Arginine Arg (R) Oui Semi-essentiel Polaire ionisable  Les acides aminés soufrés Nom Symbole Formule Propriétés AA essentiels Cystéine Cys (C) Polaire Non ionisable Méthionine Met (M) Oui Apolaire  Les acides aminés aromatiques Nom Symbole Formule Propriétés AA essentiels Phénylalanine Phe (F) Oui Apolaire Tyrosine Tyr (Y) Polaire Non ionisable  Les acides aminés hétérocycliques Nom Symbole Formule Propriétés AA essentiels Histidine His (H) Oui Semi-essentiel Polaire ionisable Proline Pro (P) Acide α-iminé Hétérocycle pyrrol Apolaire Tryptophane Trp (W) Oui Apolaire  Ionisation des acides aminés (aa) 2 fonctions ionisables portées par le C asymétrique : caractère amphotère des aa Le pHi, point isoélectrique, d'une molécule est défini comme étant le pH pour lequel la charge globale de cette molécule est nulle. À pH acide (saturation en H+), pH < pHi, aa sous forme de cation (chargé +) À pH neutre (pH = pHi), aa à charge globale nulle : zwitterion À pH basique, pH > pHi, aa sous forme d’anion (chargé -) Chaque acide aminé a un pHi différent (radical / chaîne latérale différent) 2 aa acides (Asp et Glu) de pHi proche de 3 3 aa basiques (His, Lys et Arg) de pHi supérieur à 7.  Polarité des chaînes latérales des aa Les aa possédant une chaîne latérale très polaire car ionisable sont les plus hydrophiles (les acides et basiques). Ils ne sont pas solubles dans les solvants organiques. Les aa polaires (non ionisables), possèdent des gpts fonctionnels qui forment des liaisons hydrogène avec l’eau. Les aa possédant une chaîne apolaire sont fortement hydrophobes, solubles dans les solvants organiques.  Absorption des aa aromatiques Les aa aromatiques (ceux possédant un noyau aromatique insaturé à double liaison) ont une absorption caractéristique vers 260-280 nm: Phe, Trp, Tyr Ces fortes absorptions sont à l’origine des méthodes spectroscopiques de détermination de la concentration des protéines en solution. Spectre d’absorption Ultraviolet des aa aromatiques à pH 6 Polarité des chaînes latérales des aa Classification des aa Acides aminés apolaires : – Val, Ile, Leu, Met, Pro, Phe, Trp, Ala, et Gly Acides aminés polaires non ionisables : – Cys, Tyr, Ser, Thr, Asn et Gln Acides aminés polaires ionisables : – Asp, Glu, His, Lys et Arg  Origine du nom des acides aminés - Les acides aminés ont été identifiés au 19ème siècle par des chimistes, principalement en Allemagne - Expériences: protéines chauffées et dégradées en présence d’acide ou de base puis extraction et identification des acides aminés - Acides aminés nommés au fur et à mesure selon les circonstances de leur découverte Quelques exemples: - glycine, préfixe gly- ou glu- hérité du grec signifiant sucré - Acide aspartique et asparagine isolés à partir d’asperge - Acide glutamique et glutamine isolés du gluten contenu dans le blé - Histidine isolé de tissus, préfixe dérivé de histologie (étude des tissus) - Lysine isolée de tissus en processus de lyse, de liquéfaction - … Code à une lettre: - première lettre utilisée, alanine = A - Plusieurs aa commencent par la même lettre, arginine = R (« R »ginine) Biochemical Education 26 (1998) 116-118 Principales propriétés biochimiques des aa La réactivité chimique des acides aminés leur confère des rôles importants dans de nombreux processus cellulaires : - La synthèse des protéines et leur régulation post- traductionnelles - La synthèse de vitamines ou autres composés intermédiaires métaboliques : acides aminés précurseurs - Le métabolisme des acides aminés : interrelations métaboliques (cycle de Krebs, les acides gras)  Anomalies enzymatiques d’origine génétique Principales propriétés biochimiques des aa Réactions dues au groupt carboxylique –COOH – Décarboxylation par des décarboxylases R-CH-COOH CO2 + R-CH2-NH2 (amine) l NH2 Exemple: L-histidine histamine Molécule de signalisation du système immunitaire Principales propriétés biochimiques des aa Réactions dues au groupt carboxylique –COOH – Formation du groupt amide –CO-NH2 Ex : glutamate + NH3 + ATP glutamine + ADP + P Glutamine synthétase Principales propriétés biochimiques des aa Réactions dues au groupt carboxylique –COOH – Formation de la liaison peptidique Elle constitue le squelette de la structure primaire des protéines. Elle s’effectue entre le COOH α d’un aa et le NH2 α d’un autre aa. Principales propriétés biochimiques des aa Réactions dues au groupt amine – NH2 – Désamination = libération d’ammoniac NH3 2 étapes : 1. libération de la fonction amine sous forme d’ammoniac NH3 Glutamine + H2O NH3 + glutamate Glutaminase 2. action de la déshydrogénase spécifique de l’aa pour lui ôter son azote Glutamate + H2O + NAD NH3 + α-cétoglutarate + NADH + H+ Glutamate déshydrogénase intermédiaire du cycle de Krebs Principales propriétés biochimiques des aa Réactions dues au groupt amine – NH2 – Transamination Transfert du groupt NH2 d’un aa sur un α-cétoacide devenant l’aa correspondant Exemple : Alanine + α-cétoglutarate pyruvate + glutamate Phosphate de pyridoxal Alanine transaminase (ALAT) aa + cétoacide cétoacide + aa Réaction se faisant en présence d’un cofacteur, le phosphate de pyridoxal (groupt prosthétique) et en présence d’une transaminase correspondante  Principales propriétés biochimiques des aa Réactions dues à la chaîne latérale des aa (dues au radical) – La réactivité du radical conditionne in vivo les modifications post-traductionnelles des protéines. – Selon la nature du radical, une protéine peut par ex s’associer à des motifs glucidiques pour former des glycoprotéines … > - asparagine N-glycosylation sur NH2 des Asn O-glycosylation sur OH des Ser et Thr > - threonine ↳ serine – Elles peuvent également être phosphorylées sur les OH des résidus Sérine (Ser), Thréonine (Thr) et Tyrosine (Tyr). Cette phosphorylation est très importante car c’est un des phénomènes réversibles de régulation des activités enzymatiques. – On trouve également des Acétylations sur les groupements NH2 des Lysine (Lys) Protéines: liaison peptidique  La chaîne peptidique N-terminal C-terminal Plusieurs acides aminés reliés entre eux par des liaisons peptidiques. Ici un tétrapeptide. Structure primaire = enchaînement des acides aminés Peptides, polypeptidique, protéines Exemples de poids moléculaire de protéines (PM) L’unité de mesure du poids moléculaire est le g/mol ou le Dalton: 1 Da = 1 g/mol 1 acide aminé en moyenne 110 g/mol Insuline (51 AA) 5 700 Da (g/mol) Ribonucléase 13 700 (= 13,7kDa) Trypsine 23 800 Ovalbumine 45 000 Hémoglobine humaine (574 AA) 64 500 γ -Globuline 150 000 Myosine 493 000 Certaines enzymes > 10 6  Le rôle des protéines est très varié Catalyseur biologique - Enzymes : ce sont des protéines Transport de petites molécules - Hb (O2) : l’hémoglobine transporte l’O2 des poumons aux organes - Transferrine (Fer dans le plasma sanguin) Rôle de soutien et de structure - Glycoprotéines des parois ou membranes cellulaires - Kératine (cheveux, ongles, plumes, griffes) - Fibroïne (dans la soie, toile araignée) - Collagène (tissu conjonctif, cuir) Rôle contractile - Protéines musculaires (actine, myosine, actinomyosine)  Le rôle des protéines est très varié Rôle de reconnaissance - Hormone (peptide) se fixant sur un Récepteur - Reconnaissance de cellules entre elles pour constituer les tissus - Reconnaissance des Anticorps (Ig du système immunitaire) vis-à-vis des Antigènes (molécules étrangères) Protéines de stockage - Ovalbumine (protéine du blanc d’œuf) - Caséine (protéine du lait) P. nutritives - Myoglobine (stocke O2 dans le muscle) Contrôle de la différenciation et de la croissance cellulaire - Protéines régulatrices de gènes (Reconnaissance entre protéines et acides nucléiques)  Classification des protéines Les holoprotéines (constituées uniquement d’AA) Les hétéroprotéines = holoprotéine + groupement prosthétique La présence du groupement prosthétique (de nature non protéique) entraîne l’apparition de propriétés physiques, chimiques et biologiques caractéristiques. association par - liaisons covalentes et/ou - liaisons de coordination et/ou - liaisons ioniques et/ou - liaisons hydrogène et/ou - interactions hydrophobes Différentes variétés d’hétéroprotéines Les hétéroprotéines: Glycoprotéines (glucides) Lipoprotéines (lipides) Phosphoprotéines (acide phosphorique) Chromoprotéines (pigments) Nucléoprotéines (acide nucléique) Métalloprotéines (cofacteur métallique dans le cas des enzymes) liaisons de coordination entre le métal et la protéine  Hétéroprotéines Hétéroprotéine : association covalente entre une ou plusieurs chaînes polypeptidiques et un groupement prosthétique : – Glycoprotéines (association covalente entre une protéine et un groupt glucidique) dans les mbs cellulaires, les anticorps – Phosphoprotéines (ac phosphorique estérifiant les fonctions alcool de la sérine et de la thréonine) : ex la caséine – Chromoprotéines = chrome (couleur) due à une molécule organique (caroténoprotéines), ou bien à un ion métallique (Fer, Cu, Mg par ex) engagé dans des liaisons de coordination entre le métal et la protéine (par exemple via un groupement hème :Mb, Hb, cytochromes, métalloprotéines, enzymes héminiques : catalase, peroxydase)  Autre classification des protéines Les protéines fibreuses : – Rôle structural dans la cellule : Fibroïne de la soie, les collagènes, les kératines Les protéines globulaires : – Structure compacte – Chaînes latérales hydrophobes enfouies à l’intérieur de la molécule – Chaînes latérales hydrophiles tournées vers l’extérieur Les protéines membranaires : – Protéines membranaires insolubles dans les solutions aqueuses – Protéines membranaires peuvent être solubilisées en présence de détergents.  Différents niveaux de structure 1. Structure primaire : séquence des acides aminés (enchaînement) 2. Structure secondaire : conformation régulière du squelette peptidique (hélice α et feuillet β) 3. Repliement en structure compacte des hélices α et des feuillets β en domaines 4. Structure tertiaire : organisation tridimensionnelle de ces domaines 5. Structure quaternaire : plusieurs sous-unités protéiques associées par des liaisons faibles.  La chaîne polypeptidique Liaisons peptidiques R1 O R3 CH NH C CH C CH NH C O R2 O Squelette axial du polymère = non spécifique à une protéine donnée , squelette polypeptidique Chaînes latérales des acides aminés (R …) = partie caractéristique de la protéine Les propriétés physico-chimiques d’une chaine polypeptidique sont déterminées par les propriétés physico-chimiques des chaînes latérales La chaîne polypeptidique: exemple Enchaînement de 4 acides aminés Squelette peptidique Chaînes latérales Liaison Liaison peptidique peptidique  La liaison peptidique est plane Les 4 atomes C, O, N, H et les 2 Cα (1 et 2) situés dans un même plan constituent l’unité peptidique. Chaîne latérale R1 4 Cα1 3 1 Angle de torsion oméga Ω de la liaison peptidique autour de l’axe C-N 2 Cα2 Chaîne latérale R2  Configuration cis ou trans Chaînes latérales Chaînes latérales Config cis Config trans Ω = 0° ou Ω = 180° Angle de torsion oméga Ω de la liaison peptidique autour de l’axe C-N Configuration trans : minimum d’encombrement stérique entre les résidus adjacents Ω = 180° Configuration trans plus favorable du point de vue énergétique  Cas de la proline (acide iminé) En raison de la présence de l’hétérocycle pyrrolidine, la proline peut former avec le résidu précédent une liaison peptidique qui adopte soit la configuration cis ou trans qui changent la direction de la chaîne  Chaîne polypeptidique -Cα-CO-NH-Cα -Cα-CO-NH-Cα unité peptidique unité peptidique Φ Cα Ψ Cα Cα -Cα-CO-NH-Cα -Cα-CO-NH-Cα unité peptidique unité peptidique Modèle d’un fragment de chaîne polypeptidique Chaque unité peptidique contient : - le carbone α - le groupe CO d’un résidu n - le groupe NH - et le carbone α du résidu n+1. Ces 6 atomes de l’unité peptidique sont coplanaires. Conformations régulières de la chaîne polypeptidique -NH-Cα(HR)-CO unité répétitive : Chaîne latérale Chaîne latérale résidu d’aa Φ Cα Ψ Cα - Cα – CO – NH - Cα - Cα – CO – NH - Cα unité peptidique unité peptidique Les seules rotations possibles sont indiquées par des flèches : (angle Φ autour de la liaison Cα-N et angle Ψ autour de la liaison Cα-C).  Différents niveaux de structure 1. Structure primaire : séquence des acides aminés (enchaînement) 2. Structure secondaire : conformation régulière du squelette peptidique (hélice α et feuillet β) 3. Repliement en structure compacte des hélices α et des feuillets β en domaines 4. Structure tertiaire : organisation tridimensionnelle de ces domaines 5. Structure quaternaire : plusieurs sous-unités protéiques associées par des liaisons faibles.  Structures secondaires Hélice α droite Hélice gauche du collagène Feuillet plissé β parallèle Feuillet plissé β antiparallèle Les coudes et boucles Etc … Valeurs théoriques des paramètres des conformations régulières des chaînes polypeptidiques 3,3  Modèle moléculaire d’une hélice α Extrémité -Cα-CO-NH-Cα C-terminale unité peptidique 4 Gpt NH d’un résidu i+4 Liaison H Pas de l’hélice : 3 5,41 Å Gpt CO d’un résidu i 3,6 résidus par tour Ψ 1 2 Φ Extrémité N-terminale Φ = - 57° pour Cα-N Une hélice α droite et Ψ = - 47° pour Cα-C  Liaisons hydrogène dans une hélice α ou 3,613 Extrémité Liaisons hydrogène parallèles à C-terminale l’axe de l’hélice entre le groupt C -CO d’un résidu i et le groupt -NH d’un résidu i+4 Tous les atomes d’oxygène des groupes CO 4 pointent vers l’extrémité 2 C-terminale. 3 Tous les atomes H des groupes NH pointent vers l’extrémité N- 1 ter. N Extrémité successions N-terminale -Cα-CO-NH-Cα  Structure secondaire: hélice α 245 N-term C-term Les chaînes latérales se projettent vers l’extérieur.  Longueur des hélices α Dans les protéines globulaires, la longueur des hélices α varie de : – 4 ou 5 résidus – à plus de 40 – avec une moyenne de 10.  Spirale montrant la projection des résidus d’AA d’une hélice α Projection sur un plan perpendiculaire à son axe Les résidus hydrophiles en rouge Résidus C-ter Les résidus hydrophobes en bleu polaires N-ter Ser, Thr, Résidus Tyr, Cys, apolaires Asn, Gln Asp, Glu, Lys, Arg, Gly, Ala, Val, Leu, Ileu, His Met, Pro, Phe, Trp  Résumé: propriétés des hélices α Liaison hydrogène entre le groupt CO d’un résidu i et le groupt NH d’un résidu i+4. Liaisons hydrogène parallèles à l’axe de l’hélice Un pas de l’hélice : 3,6 résidus ; 5,4 Å Chaînes latérales à l’extérieur de l’hélice Les angles φ et ψ des liaisons peptidiques sont en moyenne : – de -57° et -47° dans une hélice α droite – De +57 et +47 ° dans une hélice α gauche. L’hélice α en 3D Différents types de protéines contenant des hélices Protéines globulaires avec un pourcentage variable d’hélice α Protéines fibrillaires comme la kératine α avec un degré d’hélicité proche de 100% Kératine α constitutive des phanères : les chaînes hélicoïdales s’associent pour former des super-hélices. Ex du cheveu : Autre protéine fibrillaire particulière : le tropocollagène qui est une triple hélice, chacune des hélices étant une hélice gauche formée par la répétition d’un motif à 3 acides aminés  Autre type d’hélice = Le collagène protéine majeure de la matrice extracellulaire secrété par les cellules des tissus conjonctifs (fibroblastes) unité structurale élémentaire du collagène : le tropocollagène – constitué de 3 chaînes polypeptidiques entrelacées – chaîne composée d’environ 1000 acides aminés. – Les molécules de tropocollagène, d’une masse moléculaire de 285 000, ont environ 300 nm de long et seulement 1,4 nm de diamètre. – Il existe plusieurs types de collagène définis par leur composition en acides aminés Composition en acides aminés du collagène Près d’un résidu sur 3 est une glycine ↳ Glycine Teneur en proline élevée proline + Hyp Trois acides aminés modifiés : 5 – la 4-hydroxyproline (Hyp) HO 2 4 – la 3-hydroxyproline 3 1 – et la 5-hydroxylysine (Hyl) Pro + Hyp = 30% des aa du collagène Certains résidus d’hydroxylysine peuvent également être glycosylés (glucosyl-galactose) ⇒ glycoprotéine.  Séquences répétitives GLY-PRO-MET-GLY-PRO-SER-GLY-PRO-ARG- GLY-LEU-HYP-GLY-PRO-HYP-GLY -ALA-HYP- GLY-PRO-GLN- GLY -PHE-GLN-GLY-PRO-HYP- GLY-GLU-HYP-GLY-GLU-HYP-GLY -ALA-SER- GLY-PRO-MET-GLY-PRO-ARG- GLY-PRO-HYP- GLY-PRO-HYP-GLY -LYS -ASN-GLY -ASP-ASP succession de motifs à 3 résidus : GLY -PRO -X Pro + Hyp = 30% des aa GLY -PRO -HYP Pro du + Hyp = 30% des aa collagène du collagène GLY-X-HYP Liaison hydrogène interchaîne dans la triple hélice du collagène Proline Glycine Chaîne A Chaîne B Triple hélice droite du collagène formée de 3 hélices gauches 3,3 résidus par tour de chacune des chaînes de tropocollagène Séquence répétitive Gly-Pro-Hyp ⇒ un enroulement gauche. Image de Chacune des chaînes s’enroule autour des autres fromant une triple microscopie hélice droite. électronique Triple hélice droite du collagène formée de 3 hélices gauches Molécule de tropocollagène Figure 4.23 du manuel Mécanique et biomécanique en techniques de physiothérapie, de Mathieu Deschamps.  Structures secondaires Hélice α droite : pas de l’hélice 3,6 AA Hélice gauche du collagène Feuillet plissé β parallèle Feuillet plissé β antiparallèle Les coudes et boucles Etc …  Autre structure secondaire: Brins β et feuillets plissés β Les brins β sont des conformations de base constituées d’un fragment de chaîne polypeptidique non enroulé et presque complètement étiré. Les brins peuvent y être soit – antiparallèles, constituant des feuillets plissés β antiparallèles, – parallèles, formant alors des feuillets plissés β parallèles.  Structure secondaire: brins β Et tjs la même succession Cα-CO-NH …. C-term N-term  Feuillet β anti-parallèle N-term C-term C-term N-term N-term C-term C-term N-term N-term C-term Angle Φ (liaison Cα-N) = -139° Angle Ψ (liaison Cα-C) = +135°  Feuillet β anti-parallèle Angle Φ (liaison Cα-N) = -139° Angle Ψ (liaison Cα-C) = +135° Feuillets β anti-parallèles  Feuillet β parallèle C-term N-term C-term N-term C-term N-term C-term N-term Angle Φ (liaison Cα-N) = -119° Angle Ψ (liaison Cα-C) = +113°  Feuillet β parallèle Angle Φ (liaison Cα-N) = -119° Angle Ψ (liaison Cα-C) = +113°  Structures secondaires Hélice α droite : pas de l’hélice 3,6 AA Hélice gauche du collagène Feuillet plissé β parallèle Feuillet plissé β antiparallèle Les boucles et coudes (ou tours) Etc …  Boucles et coudes Dans une protéine, 1/3 environ des acides aminés font partie de boucles ou de tours (ou coudes) qui permettent à la chaîne polypeptidique de faire un « demi-tour » (environ 180° ou moins). Les tours ou coudes (de 2 à 4 AA) connectent 2 brins β anti- parallèles dans un feuillet. Les boucles (> à 4 AA) connectent des hélices entre elles, des hélices α avec des brins β, des brins n’appartenant pas au même feuillet.  Structure tertiaire de la porine Hélices α, feuillet β Protéine membranaire permettant le passage de petites molécules à travers la mb cellulaire. Repliement tonneau β Boucles entre 2 brins β Boucles entre hélices et des brins β Tours ou coudes  Boucles et coudes Les boucles et les coudes participent souvent à la formation – des sites de reconnaissance – des sites de liaison – et des sites actifs des protéines (et enzymes). Les boucles sont essentiellement constituées – de résidus polaires, – éventuellement chargés, – très hydrophiles qui peuvent entrer en interaction avec le milieu aqueux.  Différents niveaux de structure 1. Structure primaire : séquence des acides aminés (enchaînement) 2. Structure secondaire : conformation régulière du squelette peptidique (hélice α et feuillet β) 3. Repliement en structure compacte des hélices α et des feuillets β en domaines 4. Structure tertiaire : organisation tridimensionnelle de ces domaines 5. Structure quaternaire : plusieurs sous-unités protéiques associées par des liaisons faibles.  Structure tertiaire de la protéine Correspond aux repliements de la protéine sur elle- même Dépend de sa structure primaire Concerne des relations spatiales s’établissant entre des aa non contigus dans la structure primaire Elle caractérise les protéines globulaires, par opposition aux protéines fibreuses qui n’ont pas, au sens strict, de structure tertiaire.  Structure tertiaire: Repliement des chaînes polypeptidiques Le repliement et la stabilisation des conformations biologiquement fonctionnelles des protéines globulaires dépendent de plusieurs types d’interactions non covalentes : – Liaisons ioniques ou électrostatiques – Liaisons hydrogène – Interactions hydrophobes (la composante la plus importante) les groupes hydrophobes s’associent entre eux. – Éventuellement des liaisons covalentes :ponts disulfure  Repliement de la chaîne polypeptidique des protéines globulaires en milieu aqueux Le rapprochement de la plupart des résidus hydrophobes à l’intérieur de la protéine impose un repliement de la chaîne. W = Trp, F = Phe, M = Met, L = Leu, I = Ile Les résidus polaires hydrophiles se retrouvent à la surface de la protéine en contact direct avec l’eau avec laquelle ils entrent en interaction. D = Asp, S = Ser, K = Lys, (G = Gly) dans la boucle. Chaîne principale : enchaînements –Cα-CO-NH-Cα- où les groupes CO et NH sont polaires et hydrophiles. Ces groupes perdent leur caractère polaire et hydrophile lorsqu’ils sont unis par les liaisons hydrogène au sein des structures secondaires en hélices ou en feuillets plissés.  Repliement 3D des protéines Illustration de la manière dont une protéine se replie dans une conformation globulaire Chaînes Liaisons hydrogène latérales possibles avec les non polaires chaînes latérales polaires externes Chaînes latérales Cœur hydrophobe polaires contenant les chaînes latérales hydrophobes internes Polypeptide non replié Polypeptide replié dans une conformation globulaire en milieu aqueux  Myoglobine protéine globulaire Repliement globinique : 8 hélices α de A à H, connectées par de très courtes boucles et disposées de façon à délimiter une zone hydrophobe interne. Zone hydrophobe où peut se loger l’hème  Importance de l’eau dans la stabilisation des structures protéiques ✓ Couches d’hydratation en surface de la protéine : - liaisons hydrogènes avec les acides aminés polaires - liaisons hydrogènes entre molécules d’eau Molécules d’eau H2O (position représentée par l’atome d’oxygène) ✓ Molécules d’eau à l’intérieur des protéines : Exple: site catalytique d’une endonucléase, ion Mg catalytique Coordination de molécules d’eau: octaèdre autour du Mg The active site of Serratia endonuclease contains a conserved magnesium-water cluster. MD. Miller, J Cai, KL. Krause, J. Mol. Biol. 1999, 288: 975-987  Notion de domaine Domaine = élément de structure tertiaire  Notion de domaine fonctionnel – La structure tertiaire des protéines définit des unités de repliement qui correspondent à des domaines. – Véritables « modules » fonctionnels que l’on trouve sur des protéines différentes mais qui peuvent avoir une origine ancestrale commune. – Les protéines qui partagent des domaines fonctionnels équivalents font souvent partie d’une même famille ou super- famille de protéines. Exemple les ATPases − La majorité des grosses protéines sont composées de plusieurs domaines souvent associées à des fonctions précises :  Fixation d’un ligand  Fixation d’un substrat  Fonction d’adhésion  Etc …  Animation http://www.youtube.com/watch?v=swEc_sUVz5I&feature=PlayList& p=E5ED31A5472DD43F&index=0&playnext=1 Repliement des protéines Liaisons intervenant dans la structure spatiale des protéines (structure tertiaire) Liaison hydrogène Liaison ionique ou saline Interaction hydrophobe Liaison disulfure (ou pont disulfure) : liaison de covalence entre 2 résidus de cystéine  Particularité de la cystéine NH 2 CH COOH NH 2 CH COOH Cys CH 2 CH 2 SH oxydation S Cystine S SH + 2H+ + 2e- CH 2 Cys CH 2 NH 2 CH COOH NH 2 CH COOH Formation d’un pont disulfure intracaténaire S SH S HS Au sein d’une même1 chaîne polypeptidique, repliée et stabilisée grâce à un pont disulfure. Ex : domaine type Ig (immunoglobuline)  Domaine de l’immunoglobuline Diagramme topologique de l’organisation des brins β Un pont disulfure Les 7 brins β du domaine type Ig sont disposés en feuillets anti-parallèles. Chaque domaine : - environ 110 AA - stabilisation par un pont disulfure. 7 brins β antiparallèles Formation d’un pont disulfure intercaténaire SH HS S S Entre chaînes polypeptidiques  Structure d’une immunoglobuline G Chaîne légère VL Chaîne lourde Domaine type Ig avec pont disulfure VH Ponts disulfure entre 2 chaînes lourdes Pont disulfure dans la même chaîne : domaine type Ig La structure de chaque chaîne est formée de plusieurs domaines (1 domaine variable V par chaîne pour la reconnaissance et la fixation d’un antigène cible)  Protéines transmembranaires La plupart des mbs biologiques contiennent des protéines – qui assurent la transduction des signaux intercellulaires (protéines récepteurs) – ou le transport à travers ces mbs (protéines transporteurs) – ou des fonctions d’adhésion entre les mbs.  Protéines transmembranaires À un seul segment transmb Sites de O-glycosylation ou de N-glycosylation N Milieu extracellulaire Résidus d’aa hydrophobes Mb à l’intérieur de la double couche lipidique Milieu intracellulaire C  Structure en hélice α espace extracellulaire de la partie transmb (20 AA) NH2 His (200) Gly Ser noyau Phé hydrophobe Ile de la double Gly Ala couche Phé lipidique Tyr Mb Gly Cys Leu Gly Résidus d’AA apolaires Leu principalement Phe (hydrophobes) ds la Mb Ala Ala Ala His Gly cytoplasme (220) Thr COOH Protéines transmembranaires À plusieurs segments transmbs N C  Protéines transmembranaires Bactériorhodopsine à plusieurs segments On trouve également des protéines membranaires en tonneau β = porine Protéine capable de convertir l’énergie lumineuse en énergie chimique  Protéines transmembranaires Hélices α, feuillet β Les protéines membranaires peuvent également être composées de brins et feuillets β. Exple: La porine Protéine membranaire permettant le passage de petites molécules à travers la mb cellulaire. Repliement en tonneau β  Différents niveaux de structure 1. Structure primaire : séquence des acides aminés (enchaînement) 2. Structure secondaire : conformation régulière du squelette peptidique (hélice α et feuillet β) + boucles et coudes 3. Repliement en structure compacte des hélices α et des feuillets β en domaines 4. Structure tertiaire : organisation tridimensionnelle de ces domaines 5. Structure quaternaire : plusieurs sous-unités protéiques associées par des liaisons faibles. Différents niveaux de structure  Structure quaternaire : interactions entre les sous-unités Oligomères : complexes (souvent symétriques) composés d’assemblages non-covalents de 2 ou plus de sous-unités monomériques + éventuellement des ponts disulfures entre sous- unités L’association de sous-unités est une caractéristique très fréquente de l’organisation macromoléculaire des structures fonctionnelles. La plupart des enzymes sont des oligomères constituées – de sous-unités identiques (homo-oligomères) – ou de sous-unités différentes (hétéro-oligomères).  Alcool déshydrogénase du foie L 2 sous-unités identiques chacune portant 2 domaines Structure quaternaire de l’alcool déshydrogénase du foie. Chaque domaine contient un feuillet parallèle à 6 brins entourés de 2 hélices α.  Hémoglobine humaine Hémoglobine humaine: tétramère α2β2 :: Structure quaternaire Sous-unité α 8 hélices α par sous-unité Sous-unité β Protein Data Bank (PDB) fichier 1GZX  Structure d’une immunoglobuline G Chaîne légère VL Chaîne lourde Domaine type Ig avec pont disulfure VH Ponts disulfure entre 2 chaînes lourdes Pont disulfure dans la même chaîne : 2 chaînes lourdes domaine type Ig 2 chaînes légères Structure quaternaire  Structure d’une immunoglobuline G Les immunoglobulines G (IgG) 75 à 80 % de nos anticorps circulants. - produites en réaction à un antigène (corps étranger non reconnu par l'organisme) - protègent l'organisme contre les bactéries, les virus, et certaines toxines  Domaines de l’immunoglobuline G Immunoglobuline G L1 L2 H1 H2 H3 Anticorps IgG H4 12 domaines IgG sur 4 chaînes - 4 domaines sur la chaîne lourde H1 à H4 (jaune et bleu) - 2 domaines sur la chaîne légère L1 à L2 (vert)  Stabilité des structures des protéines La flexibilité conformationnelle des protéines Les proteines intrinsèquement désordonnées  la dénaturation de la structure des protéines Flexibilité conformationnelle des protéines Protéines flexibles, adoptent de nombreuses conformations. Ces fluctuations jouent un rôle important dans les propriétés fonctionnelles des protéines. Possibilité de s’adapter à un changement de milieu ou de fixer des ligands de manière optimale. Changements conformationels importants. Enzymes allostériques  Exemple: ADN topoisomérase 2 (Top2) Les topoisomérases interviennent dans la réplication de l’ADN, la transcription de l’ADN, la ségrégation des chromosomes Fonction : relâchement des torsions de l’ADN, surenroulement de l’ADN par un mécanisme de coupure /religation de l’ADN Topoisomerases relaxation Enzymes essentielles conservées de la bactérie à l’homme : cibles pour les antibiotiques (fluoroquinolones) et les composés anti-cancers (étoposide)  Exemple: ADN topoisomérase 2 Mécanisme allostérique Animation schématique du passage de l’ADN à travers la coupure double brin introduite par une Top2 Lien internet : doi:10.1371/journal.pone.0011338.s005 Flexibilité conformationnelle des protéines Régulation de l’activité enzymatique: Transition d’un état à un autre : – Passage d’un état inactif à un état actif – Passage d’un état de faible affinité à un état de forte affinité. Cas des enzymes allostériques où leur activité est contrôlée par des mouvements globaux suite aux interactions des substrats eux-mêmes, de leurs produits ou de la fixation d’effecteurs. S A ctivateurs T R Conformation T I nhibiteurs Conformation R Forme tendue Forme relâchée Faible affinité pour Substrat Forte affinité pour S Les protéines « intrinsèquement désordonnées » Protéines entières, boucles ou domaines de protéines sans structure secondaire - Se structurant suite à des modifications post-traductionnelles :phosphorylations, acétylations, etc - et/ou au contact d’autres protéines pour former des complexes multi-protéiques → signalisations, régulations transcriptionnelles P P Chgt de structure secondaire au sein d’une même chaîne Les protéines « intrinsèquement désordonnées » Protéines impliquées dans les maladies neuro-dégenératives Alzheimer, Parkinson, Huntington, Sclérose en plaques, Encéphalite bovine spongiforme … Transitions entre protéine de structure flexible et formation d’agrégats protéiques, ou des plaques amyloïdes = protéines instables Au contact de la forme pathogène, la forme normale transitionne à son tour vers une La protéine Prion structure tertiaire pathogène. Transition hélice/ feuillet (plus stable et avec tendance à l’aggrégation) PrP PrPSc D’après Fomler et al., PLoS Biology 2012, vol 10, e1001459 Forme normale Forme pathogène Les feuillets exposent des résidus qui entrent en contact. Les formes pathogènes s’associent et forment des plaques amyloïdes.  Dénaturation de la protéine Dénaturation et renaturation Protéine native Protéine dénaturée  Dénaturation des protéines Irréversible Réversible – Chaleur – Urée 8 M – UV (Rupture des liaisons hydrogène , van – Acides der Waals et interactions hydrophobes) – Bases – Chlorure de guanidium (Rupture des liaisons hydrogène, van der – Solvants organiques Waals et interactions hydrophobes) – Forte agitation – ß-mercaptoéthanol (ßSH) – Grande dilution (Rupture des ponts disulfures) – Détergents anioniques (SDS) —S—S— SH  Détection des protéines Par spectre UV Par des colorants Par des anticorps spécifiques de la protéine  Par des techniques d’imagerie moléculaire : determination des structures 3D des protéines Par le dosage des substrats ou produits de réactions enzymatiques catalysées par les enzymes  Absorption des aa aromatiques Les aa aromatiques (ceux possédant un noyau aromatique insaturé à double liaison) ont une absorption caractéristique vers 260-280 nm. Ces fortes absorptions sont à l’origine des méthodes spectroscopiques de détermination de la concentration des protéines en solution. Spectre d’absorption UV des aa aromatiques à pH 6 Détection des protéines par des colorants Directement dans une solution : détection de l’ensemble des protéines Après migration des protéines dans un gel d’électrophorèse : détection des protéines séparées en fonction de leur taille  Détection des protéines par des colorants Première étape: séparation d’un mélange de protéines sur gel d’électrophorèse – SDS PAGE Electrode puits Solution aqueuse d’électrolytes Protéines de grande taille Protéines de grande taille Une bande de protéine Protéines de petite taille Electrode Protéines de petite taille Sens de la migration Gel Biorad.com  Protéines dénaturées avec un détergent SDS : gel dénaturant Le Sodium dodecyl sulfate (SDS) dénature la protéine, expose la structure primaire et charge négativement le polypeptide  Migration des protéines à travers les mailles d’un gel de polyacrylamidedans un champs électrique Les protéines migrent en function de leur taille en Ac. Am., les plus grandes en haut du gel, les plus petites en bas du gel du pôle – au pôle +  Détection des protéines par des colorants Deuxième étape: coloration du gel de protéines Colorants Le plus courant: Bleu de coomassie se fixe sur les ac. aminés basiques R,K,H  Détection des protéines par des anticorps Technique du Western blot (détection plus sensible) Fixation d’un anticorps spécifique Détection de l’anticorps fixé à la L’anticorps primaire d’une protéine protéine d’intérêt se fixe spécifiquement sur une petite région de la protéine (épitope) Révélation de la protéine d’intérêt en utilisant un anticorps secondaire détectable (colorant, groupe fluorescent ou de chimioluminescence) qui se fixe à l’anticorps primaire  Détection des protéines par des anticorps Test ELISA en solution  variation du WB en clinique: test Elisa Protéines en solution, détection par colorimétrie Détection des protéines dans les échantillons de tissus Technique d’immunohistochimie Détecter les protéines dans les tissus, dans la cellule Localisation : noyau, cytoplasme ? Expression: surexpression ou sous-expression ? utilisation d’un anticorps spécifique (avec une fonction fluorescente) Anticorps anti-actine Anticorps anti-vinculine Filament d’actin F du cytosquelette Impliqué dans le maintien du cytosquelette de la cellule ou entre cellules  Détermination des structures 3D des protéines Technique Cristallographie aux rayons X Cliché de diffraction Cristaux de protéine - interaction rayons X et nuage électronique - Plus de 23 prix Nobel dans le domaine depuis 100 ans Rayons X Densité électronique des Expérience de diffraction atomes de la protéine = - Processus cristallographique: https://www.youtube.com/watch?v=Eyy1y26QH5A modèle moléculaire Microscope électronique à transmission Image 2D Technique cryo-microscopie électronique Faisceau d’e- - interaction électrons et nuage électronique - 2017 Prix Nobel de chimie: cryo-microscopie électronique Modèle moléculaire à partir des données expérimentales de cristallo ou cryoME = Reconstruction 3D = Coordonnées x, y, z de chaque atome composant la modèle moléculaire structure déposées dans la Protein data bank rcsb.org  Résolution des structures 3D des protéines du SARS-CoV2 Les structures obtenues par les techniques de biologie structurale notamment la cryo-microscopie électronique en 2020 permettent de comprendre comment le virus se fixe à nos cellules. Membrane Récepteur cellulaire cellulaire Protéine intracellulaire Certains variants présentent des mutations ponctuelles de résidus de la protéine spike en contact avec le récepteur ACE2 doi: 10.1126/science.abb2762 doi: 10.3389/fphar.2020.577467 Les protéines de transport et stockage de l’O2 Hémoglobine et Myoglobine Deux hétéroprotéines globulaires (chromoprotéines)  Myoglobine : Hétéroprotéine globulaire Myoglobine (Mg) : apoprotéine + groupement prosthétique une seule chaîne protéique de 153 AA = apomyoglobine PM : 17 800 Da association avec un groupement prosthétique : l’hème, pour former la myoglobine HEME = site actif de la myoglobine Myoglobine : protéine globulaire Repliement globinique : 8 hélices α de A à H, connectées par de très courtes boucles et disposées de façon à délimiter une zone hydrophobe interne. Zone hydrophobe où peut se loger l’hème Teneur en histidine élevée  Myoglobine protéine de stockage de l’oxygène Dans les cellules des muscles squelettiques ou du myocarde, dont l’activité est conditionnée par un apport important et continu d’O2, la myoglobine (Mg) met en réserve les grandes quantités d’O2 nécessaires aux oxydations métaboliques. Un atome de fer héminique, inclus dans un cycle tétrapyrrolique, enfoui dans la zone hydrophobe interne d’une globine, constitue le centre actif. Le fer (élément essentiel) forme une combinaison réversible avec l’O2 moléculaire. Structure de la protoporphyrine et de l’hème Hème Cycle plan 4 liaisons entre le fer et les atomes d’azote des 4 pyrroles Cycle plan : électrons π (des doubles liaisons conjuguées) délocalisés 2 autres liaisons, perpendiculaires au plan du cycle tétrapyrrolique, possibles  Structure de l’hème et de l’hématine Les porphyrines peuvent se complexer avec le fer (Fe2+ ou Fe3+). Hème quand le fer est oxydé Fe2+ Hématine quand le fer est oxydé Fe3+ 4 liaisons entre le fer et les atomes d’azote des 4 pyrroles 2 autres liaisons, perpendiculaires au plan du cycle tétrapyrrolique, possibles  Structure tertiaire de la myoglobine Hélice F His prox sur hélice F Hélice E His distale sur hélice E Différentes représentations schématiques de la Mg - Repliement globinique : 8 hélices α (de A à H), connectées par des boucles - Zone interne hydrophobe (localisation de l’hème) - AA polaires et hydrophiles à la surface de la protéine. - Hélices E et F latérales proches de l’hème portant les His distale et proximale  Structure tertiaire de la myoglobine Fe ++ hélice F hélice E His proximale NH N Fe2+ O2 N HN His distale - Liaison de coordination entre Fe2+ et His proximale - L’espace entre le fer héminique et His distale permet de fixer réversiblement une molécule d’O2.  Liaison du fer Fixation réversible de O2 héminique avec His sur la myoglobine entre le proximale fer et His distale His prox His prox His dist His dist  Structure tertiaire de la métmyoglobine Fe +++ hélice F hélice E His proximale NH N Fe3+ H2O N HN His distale Seul le fer à l’état ferreux Fe2+ peut fixer O2. fe3t =L 3+ ème Hea Si l’atome de fer est oxydé en Fe , la 6 coordinence ne peut plus être occupée par une molécule d’O2, mais par l’atome d’oxygène d’une molécule d’eau = l’oxygène O2ne peut plus se fixer  Liaison de coordination entre la porphyrine et la globine par l’intermédiaire de l’atome de fer Liaison H avec His distale Fe2+ Forme désoxy Myoglobine Fe2+ Forme oxy Myoglobine Fe3+ Forme Mét Myoglobine ou désoxy Hémoglobine (α, β) ou oxy Hémoglobine (α, β) ou Mét Hémoglobine (α, β)  Environnement de l’hème Occupant Etat Forme d’oxydation 5 e position 6 e position du fer de coordinence de coordinence Désoxy-myoglobine +2 His proximale vide Oxy-myoglobine +2 His proximale O2 Ferri-myoglobine +3 His proximale H2O Carboxy-myoglobine +2 His proximale CO Les résidus His proximale et distale sont conservés dans la myoglobine et également sur les chaînes α et β de l’hémoglobine.  Hémoglobine Protéine de transport de l’oxygène Myoglobine (Mg) : une chaîne, une molécule d’O2 1 O2 Hémoglobine humaine adulte (Hb) : – 2 chaînes α, une molécule d’O2 par chaîne – 2 chaînes β, une molécule d’O2 par chaîne 4 O2  Hémoglobine Protéine de transport de l’oxygène Dans les chaînes α ou β de l’hémoglobine, on a exactement les mêmes structures désoxy et oxy que pour Mg. Le fer est lié à l’azote N3 de l’His proximale 2 sous-unités α + sous-unités β = 4 His proximales et 4 His distales  Transport de l’oxygène par l’hémoglobine Hémoglobine (Hb) : metallo protéine contenant du fer Transport de l’O2 à l’intérieur des globules rouges dans le sang des mammifères. Intermédiaire indispensable de la respiration chez les animaux à sang chaud. Un complexe Hb-(O2)4 se forme à la pression partielle d’O2 du milieu extérieur (poumons). Dissociation de ce complexe aux pressions partielles plus basses du milieu intérieur (organes).  Structure quaternaire de Hb Hémoglobine humaine: tétramère α2β2, vue de dessus Sous-unité α Sous-unité β Protein Data Bank (PDB) fichier 1GZX Symétrie d’ordre 2 PM 68 000 2 chaînes α et 2 chaînes β Association par interactions non covalentes  Hb, protéine allostérique 2 conformations R ⇔ T en équilibre pour Hb Les chaînes de la désoxyHb : forme T – Dans les chaînes β : espace insuffisant pour O2 entre Fe2+ et His distale – Dans les chaînes α : espace juste suffisant pour accepter O2 – L’insertion de O2 dans une chaîne α entraîne un déplacement de l’hélice F : transition T ⇒ R – Ceci entraîne un changt de conformation de l’autre chaîne α et des chaînes β et possibilité de fixer O2 : phénomène coopératif. Sous-unité α Forme R pour OxyHb Sous-unité β Différentes combinaisons des hémoglobines avec les gaz Combinaison avec l’O2 : Hb + 4 O2 ⇔ Hb[O2]4 oxygénation de Hb et non une oxydation car le fer reste à l’état ferreux Fe2+ ⇒ Oxyhémoglobine Combinaison avec le monoxyde de carbone (CO) [20 fois plus d’affinité qu’O2] ⇒ carboxyhémoglobine Hb[CO]4 (très forte stabilité) Combinaison avec le CO2 : ⇒ carbhémoglobine la fixation a lieu sur les gpts basiques de la globine et d’autres protéines du sang. R-NH + CO ⇔ R-NH-COO- + H+ (formation d’un carbamate) 2 2  Poisons de l’hémoglobine Monoxyde de carbone (CO) composé stable avec l’Hb : carboxyhémoglobine L’affinité de Hb pour CO est supérieure à celle de l’O2 ; CO concurrence efficacement O2 lors de l’oxygénation pulmonaire (affinité 20 fois supérieure). ⇒ malaises, céphalées, mort par asphyxie Cyanure CN- Sulfure d’hydrogène H2S, inhibiteurs de l’oxygénation Fonctions des myoglobines et hémoglobine Aptitude à fixer, de façon réversible, l’oxygène moléculaire La myoglobine a une plus forte affinité pour O2 que l’hémoglobine. = Courbes de saturation en O2 de la Mg et de l’Hb en fonction de la pression partielle pO2  courbes différentes. Courbes de saturation en O2 de la Mg et de Hb en fonction de pO2 L’affinité d’une protéine est caractérisée par une quantité dite P50 qui est la pression partielle d’oxygène, pour laquelle 50% des sites sont occupés. P50 faible, forte affinité pour O2 P50 élevée, faible affinité pour O2 Dans les tissus Mg : P50 faible (=3), forte affinité Hb : P50 forte (=26), faible affinité La myoglobine a une plus forte affinité pour O2 que l’hémoglobine. Hyperbole pour Mg Et courbe sigmoïde pour Hb (Protéine allostérique)  Courbes de saturation en O2 des Hb A et Hb fœtale Hb fœtale a une plus grande affinité pour O2 que Hb adulte de la mère. P50 foetus < P50 mère Au niveau du placenta, Hb A (α2β2) des hématies de la mère libère son O2 au profit de Hb F (α2γ2) des hématies du foetus  Hb, protéine allostérique Conformations R et T en équilibre Hb = 4 sous-unités 2 types d’interactions – Interactions homotropiques (interactions au sein de l’hémoglobine) effet de coopérativité positive entre les sites de fixation de O2 – Interactions hétérotropiques (interactions extérieures à l’hémoglobine) effecteurs allostériques négatifs : ions H+, CO2, BPG diminuent l’affinité de l’Hb pour l’O2 2,3 bisphosphoglycérate  Effet Bohr Effet du pH sur la libération d’O2 L’affinité de Hb pour O2 décroît en présence de CO2 et à pH faible Plus le pH du milieu tissulaire est acide, plus l’oxyhémoglobine libère d’oxygène. P50  Aff O2 A pH acide, 3 sites de protonation de Hb : - 2 dans la chaîne α (aa N-ter et His 122) - 1 dans la chaîne β (His 146) La protonation induit un changement de conformation et entraine une diminution de l’affinité de Hb pour O2. CO2 transporté sous forme de carbamate par Hb : R-NH2 + CO2 ⇔ R-NH-COO- + H+.  Drepanocytose et hémoglobine S Drépanocytose ou anémie falciforme : anomalie génétique de l’Hb mutation ponctuelle sur la sous-unité β Forme non mutée: Hb A, forme mutée: Hb S Les globules rouges falciformes (en forme de faucille) possèdent - Soit 2 sous-unités β :Hb A +Hb S - Soit 2 sous-unités β: uniquement Hb S.  Drépanocytose ou anémie falciforme chaînes β de l’Hb polaire Hémoglobine A : Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys …. N-ter C-ter Hémoglobine S : Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys apolaire Mutation au 6ème codon, GTG remplace GAG. N-terminal de la chaîne β de la globine Hb A Hb S Val (Hb S) à la place de Glu (Hb A) donne une bosse hydrophobe.  Formation de fibres par polymérisation du tétramère α2β2 de la désoxyhémoglobine S Interactions hydrophobes (Val) entre molécules de désoxyHb S. La solubilité de la désoxyHb S est réduite par rapport à la désoxyHb A. Interactions ⇒ Obstruction des capillaires hydrophobes ⇒ et formation de thromboses entre Val de β et Phe 85 et Leu 88 d’une autre chaîne β  Les enzymes Définitions Régulation des enzymes Notion de site actif Cofacteurs, coenzymes Les enzymes: des structures et assemblages variés Exple:La chymotrypsine  Les enzymes Définitions Régulation des enzymes Notion de site actif Cofacteurs, coenzymes Les enzymes: des structures et assemblages variés Exple:La chymotrypsine  Enzymes: Catalyseurs biologiques pouvoir catalytique important grande spécificité de substrat accélèrent des réactions chimiques spécifiques fonctionnent en solution aqueuse dans des conditions de température et de pH très douces. Les enzymes sont des protéines enzymatiques synthétisées par des êtres vivants. Cette synthèse est déterminée génétiquement.  Définitions Substrat : Molécule qui entre dans une réaction pour y être transformée grâce à l’action catalytique d’une enzyme. Produit : Molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par une enzyme.  Facteur : Enzyme Réaction enzymatique : enzyme Substrat Produit Un produit peut devenir à son tour substrat si la réaction est réversible ou encore s’il est transformé par une 2ème enzyme.  Enzyme Les enzymes ne modifient pas l'équilibre des réactions. Elles accélèrent la vitesse aller (v1) et la vitesse retour (v2) exactement d'un même facteur. v1 S P Substrat v2 Produit  Enzyme V1, k1 (Constante de vitesse aller) S P V2, k2 (Constante de vitesse retour) Constante d’équilibre [P] k1 K= = [S] k 2  Energie d’activation Réaction non catalysée Energie du système Energie d'activation nécessaire en Réaction catalysée l'absence d'enzyme Energie d'activation nécessaire en présence d'enzyme Etat initial Substrat Energie libre Etat final Produit de la réaction Evolution de la réaction  Energie d’activation Les enzymes abaissent les énergies d'activation des réactions qu'elles catalysent. En abaissant cette énergie d'activation les enzymes augmentent la vitesse de réaction. Pouvoir catalytique des enzymes Quelques exemples de taux d'accélération produits par les enzymes : Anhydrase carbonique 107 12 Phosphoglucomutase 10 13 Succinyl-CoA transférase 10 Uréase 1014 Classification des Enzymes : 6 classes 1. Les Oxydo-réductases 2. Les Transférases 3. Les Hydrolases 4. Les Lyases 5. Les Isomérases 6. Les Ligases (synthétases) Exemple: Anhydrase carbonique Cette enzyme (lyase) catalyse la réaction d’hydratation du gaz carbonique (lyase) CO2 + H2O H2CO3 Acide carbonique Dissociation rapide Présence d’un atome de Zinc H+ + HCO3- dans le site actif de l’enzyme Ion bicarbonate Zn nécessaire à l’activité de l’enzyme Exemple: Anhydrase carbonique Mb Globule rouge Mb L’entrée (au niveau des poumons) et la sortie (au niveau des tissus) du bicarbonate dans le globule rouge se font grâce à la présence d’un échangeur chlorure-bicarbonate.  Enzyme Grand pouvoir catalytique Chaque molécule d’anhydrase carbonique peut hydrater 105 molécules de CO2 par seconde. 10" (O /min Grande spécificité , L’anhydrase carbonique n’hydrate que le CO2.  Les enzymes Définitions Régulation des enzymes Notion de site actif Cofacteurs, coenzymes Les enzymes: des structures et assemblages variés Exple:La chymotrypsine  Régulation des enzymes Contrôles cellulaires - sur la synthèse des enzymes - Etape de transcription - Etape de traduction - et sur l'activité des enzymes 1. Mécanisme réversible 2. Mécanisme irréversible  Régulation de l’activité 1. Mécanisme réversible - Inhibition réversible par les produits de la réaction - Enzymes allostériques (activation ou inhibition) - Modification covalente * Phosphorylation sur sérine, thréonine, tyrosine * Acétylation sur Lys * Méthylation sur Glu, Asp …  Régulation de l’activité 1. Mécanisme réversible Exemple de régulation d’activité enzymatique par – phosphorylation par une kinase – et déphosphorylation par une phosphatase  Régulation de l’activité 1. Mécanisme réversible: Phosphorylation-déphosphorylation Kinase Forme inactive Forme active non phosphorylée phosphorylée Enz-OH Enz-O P Phosphatase  Régulation de l’activité 2. Mécanisme irréversible - Glycosylation : addition covalente d’un sucre - Coupures hydrolytiques de la chaîne peptidique Ex : Chymotrypsine Chymotrypsinogène Chymotrypsine + 2 dipeptides inactif Réaction irréversible Enzyme active Mécanismes de base de la régulation du métabolisme 1er niveau : Contrôle transcriptionnel 2ème niveau : phosphorylation ATP- dépendante par des kinases ou déphosphorylation par des phosphatases 3ème niveau : modulation par des ligands (molécules inhibitrices ou activatrices ayant une liaison spécifique avec l’enzyme) modulation par une autre protéine : exple lactose synthétase Régulation de la lactose synthétase Synthèse du lactose par la glande mammaire Synthèse catalysée par la lactose synthétase  Lactose synthétase UDP-Galactose + Glucose Lactose + UDP CH2OH CH2OH O O O Galactose Glucose Lactose  Lactose synthétase UDP-Galactose + Glucose Lactose + UDP Sous-unité catalytique + Sous-unité modificatrice Lactose synthétase active Sous-unité catalytique de la Lactose synthétase Protéine-glucide + UDP-Galactose Sous-unité catalytique seule = Galactosyltransférase Protéine-glucide-Gal + UDP  Lactose synthétase La sous unité modificatrice affecte la spécificité de la sous unité catalytique de façon à ce qu'elle unisse le galactose au glucose par une liaison osidique b 1-4 pour former du lactose. Contrôle hormonal (Prolactine) sur la synthèse de la sous-unité modificatrice.  Activités des différentes sous-unités de la Lactose synthétase Glycoprotéine CH2OH O Glycoprotéine Sous unité catalytique CH2OH + UDP O UDP UDP-β-D-Gal CH2OH CH2OH O O O H,OH CH2OH O Lactose Sous unité H,OH modificatrice + UDP Lactose synthétase D-Glu  Les enzymes Définitions Régulation des enzymes Notion de site actif Cofacteurs, coenzymes Les enzymes: des structures et assemblages variés Exple:La chymotrypsine  Structure des enzymes La plupart des enzymes sont des protéines globulaires Leur activité catalytique dépend de l'intégrité de la conformation de la protéine native. Les structures – primaire, – secondaire, – tertiaire – et quaternaire des protéines enzymatiques sont essentielles à leur activité catalytique.  Structure des enzymes: site actif Une réaction enzymatique est caractérisée par le fait qu'elle se produit à l'intérieur d'une poche formée par l'enzyme et appelée site actif. La molécule liée au site actif et sur laquelle l'enzyme va agir est appelée substrat.  Structure des enzymes: site actif Le site actif d'une enzyme est la région qui lie les substrats et le(s) cofacteur(s) s'il y en a un. Il apporte les résidus d'acides aminés qui participent directement à la formation (synthétase) ou au clivage des liaisons (hydrolase). Ces résidus sont appelés groupes catalytiques.  Structure des enzymes Site actif Substrat Enzyme Site actif Cofacteur Enzyme libre  Structure des enzymes: site actif Le site actif occupe une part relativement réduite du volume total de l'enzyme. Le site actif est une entité tridimensionnelle. Ce sont les repliements de la chaîne qui rapprochent les groupements fonctionnels de l'enzyme les uns aux autres pour former ainsi le site actif. (Structures tertiaire et quaternaire). Structure des enzymes: site actif Repliement de la chaîne Formation d’une poche  Structure des enzymes: site actif Le site actif de l'enzyme a par nature une forme complémentaire de celle du substrat. - Analogie avec la clé et la serrure (modèle de Fischer) - Modèle de reconnaissance dynamique : le site actif a une forme complémentaire de celle du substrat seulement après que le substrat se soit lié ; ajustement induit. (modèle de Koschland)  Structure des enzymes: site actif Hiérarchie fonctionnelle des acides aminés 1. les AA "non collaborateurs" ou indifférents 2. les AA "collaborateurs" ou de conformation (repliement de la chaîne) 3. les AA auxiliaires (ajustement induit) 4. les AA de contact (liaison avec le substrat, catalyse)  Structure des enzymes Site actif NH2 HOOC AA non collaborateurs Zone du site actif AA collaborateurs ou de conformation  Structure des enzymes Site actif chaîne polypeptidique Substrat AA auxiliaires ajustement induit Agrandissement de la zone du site actif AA de contact catalyse  Structure des enzymes: site actif Mécanismes moléculaires de l'acte catalytique Au niveau du site actif, il existe des groupements possédant les caractéristiques d'un réactif nucléophile (riches en électrons) : - OH des sérines, - SH des cystéines, - Noyau Imidazole des histidines.  Structure des enzymes: site actif Les acides aminés sont + ou – importants pour la fonction de l’enzyme selon leur localisation, leur position dans la structure primaire. Problème des mutations.  Mutations ADN Transcription codon ARNm Traduction aa1 modifié Protéine mutée, si résidus catalytiques = fonction enzymatique affectée  Les enzymes Définitions Régulation des enzymes Notion de site actif Cofacteurs, coenzymes Les enzymes: des structures et assemblages variés Exple:La chymotrypsine Exple:catalyse avec le coenzyme phosphate de pyridoxal  Structure des enzymes Certaines enzymes sont actives par elles- mêmes, sans autres groupes fonctionnels que ceux de leurs résidus en acides aminés (cas de la RNase). D'autres au contraire nécessitent la présence d'un composé chimique supplémentaire appelé cofacteur.  Structure des enzymes Les cofacteurs Substrat Enzyme Site actif Cofacteur Enzyme libre, active  Structure des enzymes Cofacteur Un ion inorganique (cofacteur minéral): Cu++, Fe++, Mg++, Mn++, Zn++, K+ Une molécule complexe, organique ou métallo-organique : appelée coenzyme → cosubstrat : liaisons hydrogène, ioniques avec l’apoenzyme → gpt prosthétique: liaisons de coordination, covalente avec l’apoenzyme  Structure des enzymes Partie protéique : apoenzyme ou apoprotéine Holoenzyme = enzyme catalytiquement active - apoenzyme sans aucun cofacteur - apoenzyme + cofacteur minéral - apoenzyme + coenzyme (co-substrat ou gpt prosthétique) - apoenzyme + coenzyme + cofacteur minéral  Les cofacteurs minéraux Les ions métalliques se retrouvent dans Métalloprotéines Liaisons de coordination  Caractères communs à tous les coenzymes Cosubstrat et grpts prosthétiques De nature non protéique Molécules organiques de petit PM - Composés nucléotidiques - Systèmes organiques conjugués (double liaison) - Noyaux cycliques ou hétérocycliques Mobilité électronique très grande Composés thermostables Réaction de molécule à molécule Non responsables de la spécificité enzymatique Les coenzymes dérivent des vitamines.  Nature des coenzymes De nombreuses vitamines sont des précurseurs de coenzymes. Ce sont des éléments organiques indispensables en petite quantité dans le régime alimentaire.  Exemples de vitamines Coenzyme ou forme active Hydrosoluble vitamine B1 (thiamine) thiamine (TPP) vitamine B2 (riboflavine) flavine mononucléotide (FMN) flavine adénine dinucléotide (FAD) vitamine PP nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) (acide nicotinique) nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP) acide pantothénique, vit B5 coenzyme A (CoA) vitamine B6 (pyridoxine) phosphate de pyridoxal biotine biocytine acide folique acide tétrahydrofolique vitamine B12 coenzyme B12 acide lipoïque lipoyllysine acide ascorbique acide ascorbique Liposoluble vitamine A 11-cis-Rétinal vitamine E vitamine K Coenzymes impliqués dans le métabolisme énergétique  Fonction des coenzymes Les coenzymes fonctionnent comme des transporteurs transitoires de groupements fonctionnels spécifiques. Ils peuvent transporter différents groupements suivant le type de réaction catalysée. Espèces transportées par les coenzymes Réactions d’oxydoréduction Coenzyme Espèces transportées Nicotinamide nucléotides + - NAD, NADP (co-substrats) 2 H , 2e Flavine nucléotides FAD (Gpt prosthétique) + - 2 H , 2e Espèces transportées par les coenzymes Réactions de transfert de groupements Exple Coenzyme Espèces transportées Coenzyme A Gpt Acyl (R-CO) Phosphate de pyridoxal CO2, NH2  Caractères spécifiques des cosubstrats Le coenzyme (cosubstrat) est lié à l’apoenzyme par des liaisons faibles - Liaisons électrostatiques ou liaisons ioniques - Liaisons hydrogène - Liaisons de Van der Waals. Holoenzyme Apoenzyme + Cosubstrat Enzyme entière active Parties séparées inactives  NAD+ cosubstrat de déshydrogénases Réaction 1 : Apoenzyme 1 (LDH par ex.) AH2 + NAD+ A + NADH + H+ AH2 substrat réduit A produit oxydé (Lactate) (Pyruvate) Le cosubstrat réduit (NADH + H+) quitte l'apoenzyme 1 pour se fixer sur l'apoenzyme 2 qui catalyse une 2ème réaction Réaction 2 : Apoenzyme 2 B + NADH + H+ BH2 + NAD+ B substrat oxydé BH2 produit réduit  Exple de groupement prosthétique Phosphate de pyridoxal (dérivé de la vitamine B6) Exple : aminoacides décarboxylases Liaison covalente entre le phosphate de pyridoxal et l'apoenzyme en l'absence de substrat  Les enzymes Définitions Régulation des enzymes Notion de site actif Cofacteurs, coenzymes Les enzymes: des structures et assemblages variés Exple:La chymotrypsine  Les enzymes Les enzymes: des structures et assemblages variés - 1 seule chaîne structure tertiaire - oligomères, enzyme allostérique (structure quaternaire) - complexes multienzymatiques (structure quaternaire) - isoenzymes  Structure des enzymes Chaînes polypeptidiques - Une seule chaîne : cas de la RNase - D'autres enzymes sont formées de plusieurs chaînes polypeptidiques (sous-unités) identiques ou différentes : Cas des enzymes allostériques  Structure des enzymes Chaînes polypeptidiques A A Enzyme allostérique L'interaction des sous-unités à l'intérieur de B B l'oligomère est une condition absolue pour l'expression de l'activité catalytique. E=A2B2 La sous-unité isolée est soit inactive ou soit active mais sans régulation possible. Seule la molécule oligomère est active et présente la régulation allostérique: exple les ADN topoisomérases 2  Structure des enzymes Enzymes allostériques avec plusieurs protomères Les associations entre protomères se font par diverses liaisons (faibles), en fonction des complémentarités de surface : - Liaisons électrostatiques ou liaisons ioniques - Liaisons hydrogène - Liaisons de Van der Waals.  Les complexes multienzymatiques Les diverses enzymes impliquées dans une séquence réactionnelle sont rassemblées pour former un grand assemblage protéique appelé complexe multienzymatique. De cette façon, le produit de l’enzyme A est directement transmis à l’enzyme B et ainsi de suite jusqu’au produit final. Ex : Le complexe pyruvate déshydrogénase α α = La pyruvate déshydrogénase hétérotétramère, 2 chaînes α, 2 chaînes β  Associée à 2 autres enzymes ( + acétyltransférase +autre déshydrogénase) β β PDB:1NI4  Structure des enzymes Les complexes multienzymatiques Dans le cas d’une séquence métabolique E1 E2 E3 A B C …L Les complexes multienzymatiques contribuent à l’accélération de la vitesse du métabolisme cellulaire.  Structure des enzymes Les isoenzymes sont des enzymes existant sous plusieurs formes moléculaires mais qui présentent les mêmes activités enzymatiques.  Structure des enzymes Exemple : La lactate déshydrogénase (LDH) Lactate + NAD+ LDH pyruvate + NADH + H+  Structure des enzymes Chaînes polypeptidiques Isoenzymes LDH 5 variétés isoenzymatiques de cette enzyme. Chaque isoenzyme a un poids moléculaire de 140 000 dissociable en 4 sous-unités monomériques de PM 35 000 Da. Ces isoenzymes résultent de l'association 4 par 4 de 2 types de monomères (M et H).  Structure des enzymes Isoenzymes : différentes formes de la LDH Isoenzyme Composition Répartition % normal dans le plasma LDH1 H4 Cœur 20% LDH2 M1H3 Cerveau 40% LDH3 M2H2 Cerveau 20% LDH4 M3H1 Muscle 10% LDH5 M4 Muscle, foie 10%  Structure des enzymes Les isoenzymes de la LDH Du fait de leur répartition tissulaire différente, toute lyse cellulaire par nécrose libérera une isoenzyme donnée qui peut être dosée de façon spécifique. L’augmentation de cette isoenzyme dans le sang signera ainsi l’origine de la nécrose. Différentes isoenzymes sont ainsi dosées au laboratoire pour l’aide au diagnostic, notamment dans les affections cardiaques et hépatiques. Lors d'un infarctus, on trouve souvent dans le plasma de la H4 d'origine cardiaque, qui représente alors environ 50% alors que normalement elle ne représente que 20%.  Structure des enzymes Définitions Régulation des enzymes Notion de site actif, exemples Cofacteurs Les enzymes: des structures et assemblages variés Exple:La chymotrypsine Intervention de quelques enzymes lors de la digestion des protéines Pancréas Synthèse de précurseurs enzymatiques dans le pancréas : Trypsinogène, Chymotrypsinogène etc... Régulation de l’activité de la chymotrypsine 2. Mécanisme irréversible - Coupures hydrolytiques de la chaîne peptidique Ex : Chymotrypsine Chymotrypsinogène Chymotrypsine + 2 dipeptides précurseur inactif Réaction irréversible Enzyme active  Chymotrypsinogène 1 245 inactif S-S S-S Coupure par la Trypsine π-Chymotrypsine 1 15 16 245 active Arg Ileu S-S S-S Auto-coupure par la π-Chymotrypsine Ser-Arg et Thr-Asn 14 15 147 148 α-Chymotrypsine 1 13 16 146 149 245 active Leu Ileu Tyr Ala S-S S-S Chaîne A Chaîne B Chaîne C Activation protéolytique du chymotrypsinogène La chymotrypsine : structure tertiaire a-Chymotrypsine 1 13 16 146 149 245 active Leu Ileu Tyr Ala Chaîne A S-S Chaîne B S-S Chaîne C Enzyme digestive: protéase à sérine dégradation des protéines Protéine globulaire compacte : constituée de 3 segments peptidiques issus d’une même chaîne polypeptidique protéolysée Les 3 chaînes de l’α-chymotrypsine reliées par 2 liaisons disulfure sont repliées en 2 domaines après activation.  La chymotrypsine, une protéase à sérine Protéine globulaire compacte constituée de 3 segments polypeptidiques issus de la coupure protéolytique d’une seule chaîne originelle connectées par 2 ponts disulfures et repliées en 2 domaines de 120 AA chacun Ces domaines adoptent la conformation d’un tonneau β formé de 6 brins β anti-parallèles. La chymotryps