Biochemie N a v OH (přednášky) PDF

Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Biochemie N a v OH (přednášky) Mgr. Roman Guráň, Ph.D.* Doc. RNDr. Ondřej Zítka, Ph.D. *Budova K, II. poschodí, N2024 *e-mail: [email protected]  6. Enzymy ▪ proteiny specializované na katalýzu chemických reakcí v organis...

Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Biochemie N a v OH (přednášky) Mgr. Roman Guráň, Ph.D.* Doc. RNDr. Ondřej Zítka, Ph.D. *Budova K, II. poschodí, N2024 *e-mail: [email protected]  6. Enzymy ▪ proteiny specializované na katalýzu chemických reakcí v organismu (řídí rychlosti reakcí v nich probíhajících) ▪ většinou (asi ze 60 až 70 %) povahy složených bílkovin ▪ patří mezi globulární bílkoviny ▪ (1986 - objev RNA-enzymu; izolován z protozoí) ▪ enzymy nacházíme ve všech živých systémech ▪ (i nejjednodušší buňky obsahují přes 3 000 enzymů) ▪ enzymy jeví druhovou specifitu ▪ (každý biologický druh má své vlastní enzymy) ▪ odhaduje se počet existujících enzymů na miliardy 2  Enzymy předčí umělé katalyzátory: 1. Jsou účinnější jediná molekula enzymu je schopna za 1 s přeměnit až 5. 104 molekul substrátu, výjimečně i více 2. Vykazují značnou specifitu jak co do typu katalyzované reakce, tak co do struktury přeměňovaných substrátů 3. Pracují většinou za mírných podmínek teplota 20 až 40 oC, tlak 0,1 MPa, pH kolem 7 4. Jejich účinek lze snadno regulovat na několika úrovních Předností enzymů při jejich průmyslových aplikacích je i jejich netoxičnost. 3  Kofaktory - nízkomolekulové neaminokyselinové struktury - jsou obecně stálé při zahřívání, kdežto většina enzymových bílkovin je při vyšších teplotách denaturována Funkcí kofaktorů při biochemických reakcích je přenos: a) atomů b) skupin atomů c) elektronů Rozdělení dle pevnosti vazby na bílkovinnou složku (apoenzym): a) kofaktor je pevně vázán (stabilní součást molekuly) a nazývá se prostetická skupina Např.: riboflavinové struktury u flavinových transhydrogenas, pyridoxalfosfát u aminotransferas, hem u transelektronas cytochromů aj. b) kofaktor je vázán jen slabě (může se lehce oddělovat, disociovat) a nazývá se koenzym Existuje plynulá škála v pevnosti vazby kofaktoru, je mnohdy obtížné rozlišit 4 prostetickou skupinu a koenzym.  Koenzym a prostetická skupina se odlišují ve způsobu regenerace (přechodu do původního stavu) Snadno odštěpitelné koenzymy fungují jako 2. substrát (“kosubstrát”): na bílkovinném nosiči reagují koenzym a substrát jako dva reaktanty. Po proběhnutí reakce přechází zreagovaný koenzym na jiný apoenzym a tam reaguje s dalším substrátem, čímž se regeneruje. Katalytické působení koenzymů je realizováno spřažením dvou reakcí prováděných různými enzymy. Enzymy s kofaktory typu prostetických skupin fungují jinak - krátce po sobě reagují se dvěma substráty, přičemž obě reakce realizuje tentýž enzym. struktura kofaktorů byla objasněna dříve než bílkovinných částí jde o látky různé chemické povahy jejich molekuly většinou obsahují heterocyklus (funkce: reaktivní část kofaktoru, rozpoznávací prvek pro makromolekulu) mnohé z kofaktorů mají úzký vztah k vitaminům hydrofilním většinou obsahují jako podstatnou složku zbytek kyselin fosforečných (vznikem fosforečného esteru, resp. nukleotidu se zvyšuje obsah energie kofaktoru) 5  Rozdělení kofaktorů dle funkce 1. Kofaktory oxidoreduktas a) Pyrimidinové (nikotinamidové) (di) nukleotidy b) Flavinové nukleotidy c) Biopterin d) -Lipoát e) Benzochinony s izoprenoidním postranním řetězcem f) Hem g) Ionty Fe vázané přímo na bílkovinu h) Glutathion 2. Kofaktory přenášející skupiny atomů a) Adenosintrifosfát (ATP) b) Aktivní sulfát (PAPS) c) Kofaktory přenášející jednouhlíkové štěpy (aktivní metyl, tetrahydrofolát (THF), biotin) d) Kofaktory přenášející dvojuhlíkaté štěpy (tiamindifosfát (TPP), koenzym A (CoA)) e) Kofaktory přenášející aminoskupinu f) Kofaktory přenášející rozsáhlé struktury (uridindifosfát (UDP), cytidindifosfát (CDP)) 3. Kofaktory lyas 6 4. Kofaktory izomeras 1. Kofaktory oxidoreduktas a) Pyridinové (nikotinamidové) (di)nukleotidy O O C C O NH2 O NH2 N+ N+ -O P O CH -O P O CH 2 O 2 O OH OH OH OH O NH2 O NH2 N N N N N N N N -O P O CH -O P O CH 2 O 2 O O O O OH O P O- OH OH O- nikotinamidadenindinukleotid nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NAD+) (NADP+) H H CONH2 CONH2 +2H + N -2H N X - apoenzym R (X-) R (X H) oxidovaná forma redukovaná forma 7 b) Flavinové nukleotidy O O H3 C N C H3 C N C NH NH H3 C N N O H3 C N N O CH2 CH2 C OH C OH C OH C OH C OH C OH H2 C O P CH2 O flavinmononukleotid O P O- (FMN) O NH2 N O P O- N O N N CH2 O OH OH flavinadenindinukleotid (FAD) 8  c) Biopterin O OH OH O OH OH H N CH CH CH3 N CH CH CH3 HN HN + NADH + H+ + NAD + HN N N H2N N N H H dihydrobiopterin tetrahydrobiopterin 9 d) -Lipoát CONH-Lys S S CONH-Lys 2H HS SH 10 e) Benzochinony s izoprenoidním postranním řetězcem O O H3CO CH3 H3C CH3 H3CO H H3C H O CH3 O CH3 n n (n = 6 - 10) (n = 9) ubichinony plastochinon 11 f) Hem -OOCH CH C CH2CH2COO - 2 2 H C H3C CH3 N N HC Fe CH N N CH3 CH2=CH C H CH3 CH=CH2 Fe-protoporfyrin IX 12  g) Ionty Fe vázané přímo na bílkovinu (1) - jsou známy 3 typy FeS-center: FeS-proteiny - jediný ion železa je čtyřstěnově koordinován k thiolovým skupinám 4 zbytků cysteinu Cys............... Cys Cys............... Cys S S S S S S 3+ 3+ e- 2+ 3+ Fe Fe Fe Fe S S S S S S Cys............... Cys Cys............... Cys oxidovaný stav redukovaný stav S - anorganický sulfid Fe2S2 - proteiny 13 g) Ionty Fe vázané přímo na bílkovinu (2) Pr Cys S S Fe Pr Cys S Fe S Pr - apoprotein Fe S S Cys S Fe Pr S Cys Pr Fe4S4 - proteiny 14 h) Glutathion -OOC CH CH CH CO NH CH CO NH CH COO - 2 2 2 +NH 3 H2 C SH zbytek kyseliny glutamové cysteinu glycinu -  - glutamylcysteinylglycin 15 2. Kofaktory přenášející skupiny atomů a) Adenosintrifosfát (ATP) NH2 N N N N O O O CH2 O P O P O P O OH HO O O O O 16 b) Aktivní sulfát (PAPS) PAPS = 3′-Phosphoadenosine-5′-phosphosulfate/3´- fosfoadenosin-5´-fosfosulfát NH2 N N O O -O S O P O CH N N 2 O O O OPO2- 3 OH 17 c) Kofaktory přenášející jednouhlíkové štěpy aktivní methyl NH2 N N -OOCCHCH CH S+ CH N N 2 2 2 O + NH CH3 3 HO OH 18 c) Kofaktory přenášející jednouhlíkové štěpy biotin CO2 O HN NH CH2 CH2 CH2 COOH H CH2 S 19 c) Kofaktory přenášející jednouhlíkové štěpy tetrahydrofolát (THF) 2-amino-4-hydroxy-6-metyl -5,6,7,8-tetrahydropteridin 4-aminobenzoová kyselina glutamová kyselina OH H O 4 5N N 6 CH N C N CH CH 2 CH 2 COOH 2 3 H 7H H H COOH H 2N 2 N N8 H H kyselina 5,6,7,8-tetrahydropteroylglutamová (tetrahydrofolát) 20 d) Kofaktory přenášející dvojuhlíkaté štěpy thiamindifosfát (TPP) H NH2 S + N CH2 N O O CH2 CH2 O P O P O H3C N H CH3 O O 21 d) Kofaktory přenášející dvojuhlíkaté štěpy koenzym A (CoA) CO-NH-CH2-CH2SH CH2 vazba acylu NH2 CH2 N N NH OH CH3 O O N N CO-CH-C-CH2 O P O P O CH2 O O O CH3 OPO2- 3 OH 22 e) Kofaktory přenášející aminoskupinu pyridoxalfosfát (PLP) O C O H - HO CH2 O P O - O H3 C N 23 f) Kofaktory přenášející rozsáhlé struktury uridindifosfát (UDP) O CH2-OH HN H O H H O O O N OH H OH O P O P O CH2 O H OH O- O- OH OH uridindifosfátglukóza uridindifosfátglukosa 24 f) Kofaktory přenášející rozsáhlé struktury cytidindifosfát (CDP) CH3 + H3C N CH3 NH2 CH2 N CH2 O O- O- N O P O P O CH2 O O O cytidindifosfátcholin OH OH 25 Nejdůležitější skupiny přenášené v biochemických reakcích a jejich přenašeče Přenášená skupina Aktivátor a přenašeč vodík NAD(P)+ FMN, FAD -lipoát, ubichinony (CoQ) elektrony hem, FeS-proteiny fosforyl ATP sulfát 3-fosfoadenosin-5/-fosfosulfát (PAPS) adenylát (AMP) ATP methyl adenosylmethionin, terahydrofolát (THF) methylen, methenyl terahydrofolát (THF) formyl, forminino terahydrofolát (THF) karboxyl (CO2) biotin acetaldehyd, glykolaldehyd thiamindifosfát (TPP) acetyl koenzym A (CoA), -lipoát aminová pyridoxalfosfát (PLP) difosfocholin CTP glykosyl UDP 26 Heterocyklické součásti kofaktorů Heterocyklus Kofaktor pyrrol hem, N kobalamin H N imidazol biotin, N součást purinu H pyridin NAD(P)+, pyridoxalfosfát N pyrimidin N thiamindifosfát, součást purinu a pteridinu N N pyrazin součást pteridinu N N nukleotidové kofaktory: purin N NAD(P)+, ATP, BAPS, N N adenosylmethionin, CoA N N FMN, FAD, pteridin terahydrofolát (THF) N N tetrahydrothiofen biotin S N thiazol thiamindifosfát 27 S  Mechanismus účinku enzymů a) Fischerova teorie komplementarity („klíč – zámek“) b) Koshlandova teorie indukovaného přizpůsobení („ruka v rukavici“) a) b) 28  Aktivní centra enzymů enzymová reakce probíhá v relativně malé oblasti enzymové molekuly, které říkáme aktivní centrum nebo aktivní místo, zde se váží substráty a kofaktory obsahuje určité, přesně rozmístěné funkční skupiny tyto skupiny jsou součástí postranních řetězců aminokyselinových zbytků, které bývají v polypeptidovém řetězci vestavěny na různých, někdy dosti vzdálených místech jeho svinutím do osobité prostorové struktury se však dostávají do bezprostřední blízkosti Na výstavbě aktivních center enzymů se zúčastňuje několik typů skupin: a) málo početné katalyticky aktivní skupiny (tvořící katalytické centrum) b) vazebné skupiny, úkolem je specificky vázat substrát (tvořící vazebné centrum) c) řada skupin, jejichž úkolem je vytvářet vhodné chemické prostředí v centru a jeho vhodnou prostorovou strukturu V případě hydrolas (prostorová struktura byla zatím nejvíce studována) existují z hlediska prostorového zformování aktivního centra tří základní typy: a) tvaru štěrbiny (pukliny) b) tvaru mělké povrchové prohlubně c) ve formě jamky 29 Vyšší struktury molekul enzymů a) Oligomerní molekuly enzymů Příklady oligomerních molekul enzymů Enzym Mr Počet oligomeru podjednotek -amylasa 97 600 2 (lidská) alkoholdehydrogenasa 150 000 4 (kvasinky) glutaminsyntetasa 592 000 12 (E. coli) pyruvátdekarboxylasa 4 400 000 72 (E. coli) b) Multienzymové komplexy Např. pyruvátdehydrogenasový komplex 30  Lokalizace enzymů Dle místa působení: a) Intracelulární enzymy je jich většina zůstávají uvnitř buňky, ve které vznikly, a tam vykonávají své specifické funkce fungují buď v rozpuštěné formě, nebo vázané v biologických strukturách tvoří většinou organizované funkční komplexy - multienzymové jednotky nebo multifunkční enzymy mnohé z intracelulárních enzymů se vyskytují jen v některých orgánech, a pokud se týče lokalizace v buňkách, pouze v některých jejich částech (organelách) menší část intracelulárních enzymů naopak není specificky lokalizována a setkáváme se s nimi ve většině částí buněk a prakticky v celém organismu. b) Extracelulární enzymy jsou buňkami, které je vyrobily, vylučovány a nacházíme je v tkáňových kapalinách, např. u živočichů v trávicích šťávách, krvi, mozkomíšním moku podobně i některé mikroorganismy uvolňují do kultivačního prostředí extracelulární enzymy, zejména enzymy katalyzující hydrolýzu živin 31  Formy výskytu enzymů některé enzymy jsou vyráběny příslušnými buňkami v inaktivních formách označovaných jako proenzymy nebo (en)zymogeny jsou to prekurzory aktivních enzymů např. trávicí proteázy, enzymy procesu srážení krve a fibrinolýzy názvoslovně je odlišujeme připojením předpony pro-, nebo koncovkou -gen např. protrombin, chymotrypsinogen Zymogeny jsou často dopravovány příslušnými tkáňovými kapalinami z místa vzniku na jiná místa, kde se teprve zapojují do chemického dění v organismu K přeměně na aktivní enzym dochází: 1. limitovanou proteolýzou: odštěpením určité části inaktivní molekuly, která maskuje aktivní centrum 2. přerušením klíčových vazeb (jedné nebo několika) za reorganizace prostorové struktury a zformování aktivního centra - aktivaci provádějí specializované proteasy nebo jde o autokatalytický děj - vznik zymogenů je regulačním mechanismem hladiny enzymů a současně je ochranným mechanismem pro buňky orgánů, které je syntetizují. 32  Formy enzymů katalytickou funkci může vykonávat více různých forem téhož enzymu formy katalyzující tutéž reakci a mající geneticky podmíněné rozdíly v primární struktuře, tj. vznikající pod kontrolou různých genů, označujeme jako iso(en)zymy v ostatních případech jako pseudoisoenzymy. Isoenzymy mohou být různé formy daného enzymu, které se postupně nahrazují během vývoje organismu, nebo formy, které zastávají podobné úlohy v různých částech organismu mohou být nezávislými produkty genů, např. mitochondriální a cytosolová malátdehydrogenasa, nebo mohou být podmíněny rozdíly v kontrolních sekvencích DNA nebo RNA. u bílkovin sestávajících z neidentických podjednotek představují izoenzymy různé hybridní formy např. savčí laktátdehydrogenasa. Pseudoisoenzymy jsou mnohočetné formy katalyzující stejnou reakci, ale rozdíly v jejich vlastnostech nejsou způsobeny geneticky podmíněnými odlišnostmi v primární struktuře jejich existence je důsledkem enzymových nebo neenzymových modifikací enzymu s jednou primární strukturou in vivo k modifikaci však může docházet i během izolace, potom jde o artefakty příkladem pseudoisoenzymů vytvářených in vivo jsou různé chymotrypsiny, trypsiny, pepsiny a karboxypeptidasy, odvozené vždy od jediného inaktivního prekurzoru rozdíly mohou spočívat v různých dodatečných modifikacích nebo ve vazbě různých látek na molekuly enzymů. 33 Účinková (reakční) specifita enzymů COO- C O + CH2 + NADPH + NH4 CH2 COO 2-oxoglutarát 1 + H2O + COO - + NADP COO- H2N C H C O 2 CH2 CH2 + pyridoxamin-5-fosfát + PLP CH2 CH2 COOH 3 COOH L-glutamát 2-oxoglutarát + PLP H2N CH2 CH2 + CO2 CH2 COO kyselina 4-aminomáselná Nově koncovka –asa místo –áza! 34 1 glutamátdehydrogenáza 2 glutamátaminotransferáza 3 glutamátdekarboxyláza Kofaktor se může účastnit zcela odlišných funkcí: např. pyridoxalfosfát 1. transaminace v aminotrasferasách 2. dekarboxylace v dekarboxylasách aminokyselin 3. recemizace v racemasách aminokyselin 35  Substrátová specifita enzymů vedle specifity k typu reakce jsou enzymy specifické i k přeměňovanému substrátu substrátová specifita je zajišťována na třech úrovních: 1. strukturní specifita - enzym musí nejprve rozpoznat některé obecné strukturní rysy na substrátu (a u enzymů pracujících s koenzymem i na koenzymu) specifita absolutní, tj. katalyzují přeměnu jen jediného substrátu Např. enzym ureasa a aspartasa (deaminující aspartát za vzniku fumarátu) skupinová specifita, tj. enzym katalyzuje určitou reakci u celé skupiny substrátů téhož typu (i když rozdílnými rychlostmi), např. u alkoholů, esterů, bílkovin Např. alkoholdehydrogenasa katalyzuje oxidaci velkého souboru alkoholů a hexokinasa přenos fosforylové skupiny z ATP na různé hexosy relativní skupinová specifita - tento případ nastává tehdy, jestliže enzym katalyzuje přednostně reakci jedné skupiny substrátů, ale je schopen ve zmenšené aktivitě působit i na jiné skupiny substrátů 2. regio specifita - musí být zajištěno, aby katalýza proběhla ve specifické oblasti substrátu 3. stereospecifita - většinou musí být dodržen stereospecifický průběh katalýzy substrátovou specifitu určuje vždy jen bílkovinná část molekuly enzymu naproti tomu na účinkové specifitě se u enzymů povahy složených bílkovin podílí nejen 36 kofaktor, ale i bílkovinná složka enzymů. Vliv reakčních podmínek na účinnost enzymů enzymově katalyzované reakce probíhají různou rychlostí, která je závislá na: 1. Koncentraci substrátu a enzymu 2. Fyzikálně chemických vlastnostech prostředí 3. Přítomnosti látek ovlivňujících činnost enzymů 37 Obecné schéma enzymatické reakce k1 k2 E + S ES E + P k-1 Rovnice Michaelise a Mentenové V [S] v = KM + [S] 38 Michaelisova konstanta (KM) je rovna koncentraci substrátu, při níž je dosaženo poloviny mezné rychlosti charakterizuje katalytické vlastnosti enzymu k příslušnému substrátu je nezávislá na koncentraci enzymu závisí však na prostředí (pH, teplota, přítomnost efektorů apod.) pro většinu enzymů jsou její hodnoty v rozmezí 10-1 až 10-6 mol·dm-3 čím je její hodnota nižší, tím je afinita k danému substrátu vyšší u enzymů působících na více substrátů považujeme za hlavní substrát ten, pro který má enzym nejnižší KM hlavní nedostatky rovnice Michaelise a Mentenové: komplex ES se nerozpadá přímo na P a E, jde o vícestupňový děj neuvažuje zpětný rozpad produktu, popisuje jen počáteční rychlost reakce vystihuje kinetiku pouze nejjednodušších typů enzymových reakcí, přeměňujících jediný substrát přes tyto nedostatky je nejpoužívanějším kinetickým vztahem v enzymologii nejčastější reakce v látkové přeměně organismů jsou takové, kdy enzym katalyzuje přeměnu dvou substrátů na dva produkty 39 1. Vliv koncentrace substrátu a enzymu a) b) V0 V0 [S] = konst. [E]0 = konst. V V 2 [ E ]0 KM [S] 40 a) Vliv koncentrace enzymu V0 [S] = konst. [ E ]0 41 b) Vliv koncentrace substrátu V0 [E]0 = konst. V V 2 KM [S ] 42 2.1. Vliv teploty Maximální enzymová Optimální teplota aktivita (%) 100 0 70 Teplota ( o C) ▪ poloha maxima je dána termostabilitou enzymu a je ovlivněna dobou působení ▪ u živočišných enzymů většinou kolem 50 až 60 °C. 43  2.2. Vliv pH Vliv pH na počáteční rychlost reakce katalyzované fumarázou fumarasou fumaráza - hydratuje dvojnou vazbu fumarátu za vzniku malátu fumarasa v0 0 5 6 7 8 9 pH ▪ většina enzymů působí katalyticky jen v určité oblasti pH, mimo ní jejich účinnost klesá optimum účinnosti pH 5 až 7 ▪ enzymy trávicích šťáv – pepsin pH 1,5 až 2,0. 44  3. Látky ovlivňující činnost enzymů ▪ označujeme jako efektory nebo modifikátory ▪ zvyšují-li aktivitu nazýváme je aktivátory ▪ za aktivátory považujeme pouze ty látky, které se vážou na molekulu enzymu vratně např. kationy kovů s protonovým číslem od 11 do 30 (většina kovů s vyšším protonovým číslem působí jako ireverzibilní inhibitory) ▪ snižují-li aktivitu inhibitory ▪ mohou to být látky nejrůznější povahy ▪ inhibice enzymové aktivity je jedním z hlavních regulačních prostředků živé buňky ▪ použití inhibitorů je jednou z nejdůležitějších metod enzymologie ▪ rozdělují se na reverzibilní a ireverzibilní (blokují nevratně enzymovou aktivitu, tvoří velmi pevný komplex enzym-inhibitor) ▪ reverzibilní inhibice rozdělujeme dle mechanizmu účinku na 4 typy ▪ na základě srovnání Michaelisovy konstanty a mezné rychlosti naměřené bez a za přítomnosti inhibitoru (hodnoty stanovené s inhibitorem označujeme čarou). 45  Kineticky odlišitelné inhibice a) Kompetitivní - inhibitor neovlivňuje meznou rychlost (V = V´), ale zvyšuje Michaelisovu konstantu (K´M > KM) b) Nekompetitivní - inhibitor snižuje meznou rychlost (V´ < V), ale nevyvolá změnu Michaelisovy konstanty (K´M = KM) c) Akompetitivní - inhibitor snižuje meznou rychlost i Michaelisovu konstantu, ale tak, že se nemění jejich poměr (K´M / KM = V´/ V) d) Smíšená - inhibitor mění Michaelisovu konstantu, meznou rychlost i jejich poměr 46 Nekompetitivní inhibitory neovlivňují vazbu substrátu na enzym, ale snižují rychlost jeho přeměny na produkt účinek je nezávislý na koncentraci substrátu mechanismus účinku je založen na allosterickém efektu vážou se mimo aktivní centrum a mění jeho konformaci na inaktivní prostřednictvím šířící se změny struktury, kterou vazbou vyvolají působí na jiném místě než je aktivní centrum, proto se označují též allotopické tímto mechanismem působí většina přirozených inhibitorů (vykonávají regulační funkce a řídí metabolické pochody) allosterické efektory se nazývají látky (inhibitory a aktivátory), které konformační změnou, vyvolanou vazbou na specifická centra, indukují změnu prostorové struktury a tím i změnu aktivního centra enzymu, umístěného v jiné části molekuly enzymům s takto ovládanou katalytickou aktivitou se začalo říkat allosterické enzymy tento mechanismus používají tzv. regulační enzymy řídí jednotlivé metabolické dráhy – nacházejí se na jejich význačných místech (na začátku, na jejich křižovatkách nebo v místech nejpomalejších reakcí) např. citrátsyntasa, isocitrátdehydrogenasa. 47 Názvosloví enzymů v počátcích studia byly enzymům dávány celkem náhodné triviální názvy, většinou s koncovkou –in některé z nich používáme dodnes, např. pepsin, trypsin později byla pro enzymy zvolena koncovka -asa (podle starého názvosloví: -áza) název byl tvořen: a) podle substrátu, jehož přeměnu enzym katalyzoval (amylasa, proteasa, lipasa) b) podle charakteru katalyzované reakce (oxidasa, hydrolasa, transaminasa) bližší poznávání stále rostoucího počtu enzymů si vynutilo účelné třídění a jednotnou nomenklaturu podle mezinárodní nomenklatury bylo vytvořeno i české názvosloví enzymů je zachována koncovka -asa a názvy se píší (až na výjimky) jako jedno slovo. 48  Systémové názvy enzymů se tvoří takto: a) enzym katalyzující přeměnu substrátu A reakcí typu R má název: ARasa, např. D-glyceraldehyd-3-fosfátfosfohydrolasa b) enzym katalyzující reakci substrátu A se substrátem (nebo kofaktorem) B reakci typu R má název: A: B-Rasa, např. (S)-laktát: NAD+ oxidoreduktasa (NAD+ je kofaktor pyridinových transhydrogenas) systémové názvy jsou pro praktické použití většinou složité použijeme je spolu s číselným kódem pouze k „představení“ enzymu běžně dáváme přednost jednoduššímu a praktičtějšímu doporučenému triviálnímu názvu. 49  Klasifikace enzymů základem jednotné klasifikace a nomenklatury enzymů je jejich rozdělení do sedmi tříd (sedmá třída přibyla v roce 2018) podle typu katalyzované reakce: 1. Oxidoreduktasy katalyzují intermolekulové oxidačně redukční přeměny jedna z nejpočetnějších tříd enzymů jsou povahy složených bílkovin oxidoredukční děje realizují: 1) přenosem atomů vodíku (transhydrogenasy nebo dehydrogenasy) 2) přenosem elektronů (transelektronasy) 3) vestavěním atomu kyslíku do substrátu (oxygenasy) na podtřídy se dělí podle funkčních skupin, které jsou donory H nebo elektronů např. laktátdehydrogenasa dehydrogenuje (vratně) laktát na pyruvát COO - COO - C O + NADH + H+ HC OH + NAD+ CH3 CH3 laktátdehydrogenáza EC 1.1.1.27 laktátdehydrogenasa 50 Laktátdehydrogenasa (LD, EC 1.1.1.27) enzym složený ze 4 podjednotek a ty tvoří 5 možných kombinací (LD1 - LD5) izoenzymy LD1 a LD2 mají největší elektroforetickou pohyblivost a převládají v myokardu LD5 má nejmenší elektroforetickou pohyblivost a převládá v hepatocytech izoenzym LD3 je nejvíce přítomen v maligně transformovaných buňkách stanovení celkové aktivity LD nedává uspokojivé výsledky pro diagnózu infarktu myokardu se používá stanovení izoenzymů LD1 a LD2 (závažné je zvýšení poměru aktivit LD1/LD2 nad 1,0) normální hodnoty LD v krevním séru jsou 2,0 – 4,0 kat. l-1 izoenzymu LD1 kolem 1,33 kat. l-1 2. Transferasy realizují přenos skupin (-CH3, -NH2, zbytek glukózy apod.) v aktivované formě z jejich donoru na akceptor účastní se řady biosyntetických dějů početná skupina enzymů povahy složených bílkovin na podtřídy se rozdělují podle charakteru přenášených skupin např. aminotransferasy přenášejí aminoskupinu z AK na oxokyselinu COO - COO - COO- C O C NH2 COO - AST HC NH2 + CH2 CH2 + C O CH2 CH2 CH2 CH2 COO - COO - COO - COO - aspartát 2-oxoglutarát glutamát oxalacetát aspartátaminotransferasa (AST - EC 2.6.1.1) 52 3. Hydrolasy štěpí hydrolyticky vazby, které vznikly kondenzací, např. peptidové, glykosidové, esterové velmi početná skupina enzymů vesměs povahy jednoduchých bílkovin na podtřídy se dělí podle typu štěpených vazeb např. proteasy štěpí peptidové vazby v molekulách bílkovin a peptidů, ureasa rozkládá močovinu na oxid uhličitý a amoniak CO(NH2)2 + H2O CO2 + 2 NH3 ureáza (EC ureasa 3.5.1.5.) 53 4. Lyasy katalyzují nehydrolytické štěpení a vznik (pokud není energeticky náročný) vazeb C- C, C-O, C-N,... realizují to většinou tak, že odštěpují ze substrátu nebo do něj vnášejí malé molekuly (H2O, CO2, NH3,...) bez pomoci dalšího reaktantu jsou povahy složených bílkovin málo početná skupinu enzymů v triviálních názvech pro ně užíváme označení syntasy na podtřídy se rozdělují dle typu štěpených nebo syntetizovaných vazeb např. pyruvátdekaboxylasa odštěpuje z pyruvátu CO2 za vzniku acetaldehydu COO CHO H+ + C O CO 2 + CH3 CH3 pyruvátdekaboxylasa pyruvátdekarboxyláza (EC 4.1.1.1) 54 5. Izomerasy realizují vnitromolekulové přesuny atomů a jejich skupin, tedy vzájemné přeměny izomerů nejméně početná skupina enzymů většinou povahy jednoduchých bílkovin např. triosafosfátizomerasa katalyzuje vytvoření rovnováhy mezi glyceraldehyd-3-fosfátem a dihydroxy- acetonfosfátem CHO CH2OH HC OH C O CH2O P CH2O P triózafosfátizomeráza (EC 5.3.1.1.) triosafosfátizomerasa 55 6. Ligasy katalyzují vznik energeticky náročných vazeb za současného rozkladu látky uvolňující energii, např. ATP uplatňujících se při různých biosyntézách poměrně málo početná skupina enzymů povahy složených bílkovin v triviálních názvech se pro ně většinou používá označení syntetasy dělí se podle typu vytvářených vazeb např. pyruvátkarboxylasa katalyzuje zabudování CO2 do molekuly pyruvátu za vzniku oxalacetátu COO - COO - C O + CO2 + ATP + H2O C O + ADP + H+ + P CH3 CH2 COO- pyruvátkarboxylasa pyruvátkarboxyláza (EC 6.4.1.1) 56 7. Translokasy katalyzují transport látek, nejčastěji přes biologické membrány některé translokasy vyžadují ATP tato třída byla nově zavedena v r. 2018 integrální membránové bílkoviny katalysující antiport (někdy též symport) částic přes membránu. K nejznámějším patří ATP-ADP-translokasa, která zajišťuje výměnu ATP za ADP mezi matrix mitochondrie a cytosolem. 57  Klasifikace enzymů (1) Doporučený název Číslo Reakce Systémový název 1. Oxidoreduktasy 1.1.1.1 alkoholdehydrogenáza etanol + NAD = acetaldehyd + NADH etanol: NAD+-oxidoreduktasa 1.1.1.27 laktátdehydrogenasa L-laktát + NAD = pyruvát + NADH (S)-laktát:NAD+-oxidoreduktasa 1.11.1.6 katalasa H2O2 + H2O2 = O2 + 2 H2O H2O2: H2O2-oxidoreduktasa 2. Transferasy 2.6.1.2 alaninaminotrasferasa L-alanin + 2-oxoglutarát = pyruvát + L-glutamát L-alanin: 2-oxoglutarát-aminotransferasa 2.7.1.1 hexokinasa ATP + D-hexosa = ADP + D-hexosa-6-fosfát ATP: D-hexosa-6-fosfotransferasa 3. Hydrolasy 3.1.3.9 glukosa-6-fosfatasa D-glukosa-6-fosfát + H2O = D-glukosa + mono- D-glukosa-6-fosfát-fosfohydrolasa fosfát 3.2.1.1 -amylasa (diastasa, ptyalin) endohydrolasa 1,4- -D-glykosidových vazeb 1,4- -D-glukan-glukanhydrolasa v polysacharidech 3.4.21.4 trypsin nemá přednostní štěpení: Arg-, Lys- (hydrolýza bílkovin) 3.6.1.3 adenosintrifosfatasa ATP-fosfohydrolasa ATP + H2O = ADP + Pi 58  Klasifikace enzymů (2) Doporučený název Číslo Reakce Systémový název 4. Lyasy 4.1.2.13 fruktosa-bisfosfátaldolasa D-fruktosa-1,6-bisfosfát = dihydroxyacetonfosfát + D-fruktosa-1,6-bisfosfát-D- D-glyceraldehyd-3-fosfát glyceraldehyd-3-fosfátlyasa 4.2.1.1 karbonátdehydratasa karbonáthydrolyasa H+ + HCO3- = CO2 + H2O 4.2.1.2 fumaráthydratasa L-maláthydrolyasa L-malát = fumarát + H2O 5. Izomerasy 5.3.1.1 triosafosfátizomerasa D-glyceraldehyd-3-fosfát = dihydroxyacetonfosfát D-glyceraldehyd-3-fosfát-ketolizomerasa 6. Ligasy 6.4.1.1 pyruvátkarboxylasa ATP + pyruvát + CO2 + H2O = ADP + monofosfát pyruvát: CO2-ligasa (tvořící ADP) + oxalacetát + 7. Translokasy 59  Vyjadřování katalytické účinnosti v roce 1961 byla zavedena standardní (mezinárodní) jednotka aktivity: 1 U představuje množství enzymu katalyzujícího za standardních podmínek (30 oC a optimálního pH) při saturaci substrátem přeměnu 1µmol substrátu za minutu po zavedení jednotek SI (1972) definována nová jednotka pro katalytickou aktivitu - katal: 1 kat představuje množství katalyzátoru, které přemění za standardních podmínek 1 mol substrátu za 1 sekundu v praxi používáme její zlomky: mikrokatal (µkat = 10-6 kat) nanokatal (nkat = 10-9 kat) vztah staré a nové jednotky je 1 U = 16,67 nkat 60  Vyjadřování katalytické účinnosti (2) v roce 1981 zavedl IUPAC* pro katalytickou aktivitu vyjadřovanou v katalech název rychlost přeměny substrátu používají se i další veličiny: a) koncentrace katalytické aktivity (jednotka katdm-3) b) specifická katalytická aktivita - aktivita vztažená na jeden kg enzymu (jednotka katkg-1) c) molární katalytická aktivita (jednotka katmol-1) * Mezinárodní unie pro čistou a užitou chemii (International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC) 61 je nejvyšší mezinárodní autoritou v oboru chemického názvosloví.  Průmyslové využití enzymů Enzym Obvyklý zdroj Hlavní účinek Využití  -amylasa Bacillus subtilis škrob → oligosacharidy + k výrobě glukosy, pro účely liho- (bakteriální) glukosa + maltosa varnického průmyslu, odstraňo- vání škrobu apod. laktasa Saccharomyces laktosa → glukosa + galak- hydrolýza laktosy v mléce v mlé- (-galaktosidasa) fragilis tosa kárenském průmyslu, odstranění intolerance k laktose u lidí a drůbeže lyzozym vaječný bílek degraduje bakteriální buněč- použití v oční terapii né stěny papain šťáva z papajovníků hydrolyzuje bílkoviny (včet- zjemnění masa před tepelným (Carica papaya) ně kolagenu a elastinu masa) zpracováním a konzervací glukosaoxidasa Aspergillus niger, D-glukosa + O2 + H2O → zábrana žluknutí tuků, odstranění Penicillium kys. glukonová + H2O2 glukosy popř. kyslíku z potravi- chrysogenum nářských výrobků alkoholdehydro- kvasinky etanol + NAD+ → stanovení alkoholu nebo i někte- genasa rých inhibitorů acetaldehyd + NADH + H+ 62 Děkuji Vám za pozornost 63