Omicas - Arquitetura Molecular PDF

5. Ómicas Course Arquitetura Molecular Status completed Task Análise de expressão genética pode ser feita de dois modos: Chip array RNA Seq DNA chip array Quantificação da...

5. Ómicas Course Arquitetura Molecular Status completed Task Análise de expressão genética pode ser feita de dois modos: Chip array RNA Seq DNA chip array Quantificação da expressão genética baseada na hibridização Dependência do conhecimento existente sobre a sequência do genoma Alto fundo devido à hibridização cruzada Exige uma grande quantidade de material inicialFaixa dinâmica de detecção limitada Chip: 5. Ómicas 1  cDNA array - comercial ou feito em lab oligonucleotide base array (Affymetrix) - comercial DNA microarray pode ser usado para observar o perfil genético de pacientes com cancro → possíveis abordagens terapêuticas Protein array Poder ser do tipo forward phase ou reverse fase Pode ser usado em: interações proteína-proteína especificidade de anticorpos biomarcadores substratos enzimáticos moléculas pequenas 5. Ómicas 2  Sequênciação de Sanger Método de sequenciação do DNA baseado na incorporação seletiva de dideoxidonucleótidos (terminam a cadeia) por uma DNA polimerase durante replicação do DNA in vivo A técnica de sequenciamento de DNA com dideoxirribonucleotídeos (ddNTPs, terminadores de cadeia) funciona interrompendo a síntese de uma fita de DNA sempre que um ddNTP é incorporado. Esses nucleotídeos especiais, que não possuem um grupo 3’-OH, impedem a adição de novos nucleotídeos, causando o término da replicação da fita. Leitura da sequência: A sequência de DNA é lida na direção de 5' para 3', partindo dos fragmentos menores para os maiores no gel de sequenciamento. Composição de uma reação de sequenciamento: Template (o DNA a ser sequenciado) Primer específico (oligonucleotídeo) DNA polimerase Todos os quatro dNTPs não marcados (nucleotídeos normais) Todos os quatro ddNTPs marcados fluorescentemente (mostrados aqui nas cores azul, vermelho, amarelo e verde) em menores quantidades 5. Ómicas 3  Essa técnica é conhecida como sequenciamento de Sanger e permite determinar a ordem dos nucleotídeos em uma fita de DNA. Next generation sequencing Os termos "next generation" e "massive parallel" são usados coletivamente para se referir às tecnologias de sequenciamento de DNA de alto rendimento disponíveis, que são capazes de sequenciar um grande número de diferentes sequências de DNA em uma única reação (ou seja, em paralelo). Essas técnicas permitem uma análise muito mais rápida e eficiente em comparação com os métodos tradicionais, como o sequenciamento de Sanger, facilitando o estudo de genomas completos e a realização de projetos genômicos em grande escala. Tecnologias possíveis: Illumina sequencing Roche 454 Ion torrent SOLiD Illumina: No sequenciamento de nova geração (NGS), um grande número de leituras curtas de DNA é sequenciado em um único processo. Para isso, o DNA de 5. Ómicas 4  entrada é primeiramente fragmentado em seções curtas. O comprimento desses fragmentos depende do equipamento de sequenciamento utilizado. No sequenciamento Illumina, são usadas leituras de 100 a 150 pares de bases (bp). Fragmentos um pouco mais longos são ligados a adaptadores genéricos e depois anexados a uma lâmina por meio desses adaptadores. A PCR (reação em cadeia da polimerase) é realizada para amplificar cada leitura, criando um ponto com muitas cópias da mesma sequência. Em seguida, os fragmentos são separados em fitas simples para serem sequenciados. A lâmina é inundada com nucleotídeos e DNA polimerase. Esses nucleotídeos são marcados com fluoróforos, sendo que cada cor corresponde a uma base específica. Eles também possuem um terminador, de modo que apenas uma base é adicionada por vez. Uma imagem da lâmina é capturada, e em cada posição de leitura haverá um sinal fluorescente indicando a base que foi adicionada. Este processo é repetido, permitindo a leitura das sequências de DNA. 1. Fragmentação e marcação de fragmentos genômicos/cDNA: O DNA genômico ou cDNA é fragmentado em pedaços menores. Esses fragmentos são então marcados com adaptadores universais, o que permite a utilização de primers universais, facilitando a amplificação de genomas complexos usando primers comuns durante a PCR. 2. Imobilização do template: As fitas de DNA são separadas em fitas simples. 5. Ómicas 5  Cada molécula de DNA é capturada em uma partícula ou conta (bead), com apenas uma molécula de DNA por conta, para que possam ser amplificadas individualmente. 3. Amplificação Clonal – Amplificação em Fase Sólida: O DNA imobilizado passa por um processo de amplificação clonal, onde múltiplas cópias idênticas da sequência de DNA original são geradas em uma superfície sólida, como beads ou uma lâmina, formando "clusters" de DNA. 4. Sequenciamento e Imagem – Reação de terminação reversível cíclica (CRT): Durante o sequenciamento, a tecnologia CRT (Cyclic Reversible Termination) é usada. Nesta técnica, nucleotídeos são adicionados um de cada vez, com terminação temporária, permitindo a leitura precisa das bases em cada ciclo. A cada ciclo, uma imagem é capturada para detectar o sinal fluorescente de cada nucleotídeo incorporado, determinando assim a sequência de DNA. 5. Ómicas 6  A lâmina é então preparada para o próximo ciclo. Os terminadores são removidos, permitindo que a próxima base seja adicionada, e o sinal fluorescente é eliminado, evitando que o sinal contamine a próxima imagem. O processo é repetido, adicionando um nucleotídeo de cada vez e capturando imagens entre cada adição. Computadores são usados para detectar a base em cada local de leitura em cada imagem, e essas informações são usadas para construir uma sequência. Todas as leituras de sequência terão o mesmo comprimento, pois o comprimento da leitura depende do número de ciclos realizados. Ion torrent: Diferente do sequenciamento Illumina, os métodos Ion Torrent e Ion Proton não utilizam sinais ópticos. Em vez disso, exploram o fato de que a adição de um dNTP a uma cadeia de DNA libera um íon H+. Assim como em outros tipos de NGS (sequenciamento de nova geração), o DNA ou RNA de entrada é fragmentado, desta vez em pedaços de ~200pb. Adaptadores são adicionados e uma molécula é colocada em uma esfera. As moléculas são amplificadas na esfera por PCR em emulsão. Cada esfera é então colocada em um único poço de uma lâmina. A lâmina é inundada com uma única espécie de dNTP, juntamente com tampões e 5. Ómicas 7  polimerase, um NTP de cada vez. O pH é detectado em cada um dos poços, já que cada íon H+ liberado diminui o pH. As mudanças no pH permitem determinar se aquela base foi adicionada à sequência e quantas dessas bases foram incorporadas. RNA Seq A população de RNA (poly A+) é convertida em uma biblioteca de fragmentos de cDNA com adaptadores ligados a uma ou ambas as extremidades. A amplificação em fase sólida é realizada, e as moléculas são sequenciadas a partir de uma extremidade (Single End) ou de ambas as extremidades (Pair End). Os reads geralmente têm entre 30 e 400 pb, dependendo da tecnologia de sequenciamento utilizada. 5. Ómicas 8  Contabilização de dados - pode ser a nível do CDS, gene ou dos exões Número de leituras é +/- proporcional a: tamanho do gene n.º de leituras total na base de dados Benefícios: Independência de conhecimento prévio Alta resolução, sensibilidade e grande faixa dinâmica Revela complexidades anteriormente inacessíveis Desafio: A interpretação não é simples Os procedimentos continuam a evoluir Cloning "Clonagem" é um termo carregado que pode ser usado para significar coisas muito diferentes: Cortar um fragmento de DNA de um organismo e inseri-lo em um vetor onde ele pode ser replicado por um organismo hospedeiro. (Às vezes chamado de subclonagem, porque apenas parte do DNA do organismo está sendo clonada.) Usar o DNA nuclear de um organismo para criar um segundo organismo com o mesmo DNA nuclear. É uma tecnologia que permite a manipulação de DNA por meios artificiais Baseia-se na clonagem molecular Clone: uma coleção de moléculas ou células idênticas ao original Uso de células recombinantes para a produção massiva de proteínas 5. Ómicas 9  bactéria levedura mamíferos 5. Ómicas 10  As técnicas de manipulação de DNA permitem introduzir mutações na sequência da insulina, modificações que alteram as propriedades da hormona, podendo ser utilizada em contexto clínico variável. 5. Ómicas 11  Animais transgénicos: Objetivo: Produção de ativador de plasminogênio tecidual (TPA) em ovelhas. Construção de um vetor contendo a ORF do TPA sob o controle do promotor de B-lactoglobulina, que é ativo apenas no tecido mamário; Injeção do construto em ovos de ovelha e implantação no útero; A progênie é transgênica e o leite delas é enriquecido com TPA. Por que usar um modelo animal mamífero para produzir TPA em vez de bactérias? Modificações pós-traducionais, especialmente N-glicosilação. Cloning bacteriano: Inserção e propagação de DNA recombinante (carrega um gene que codifica para a proteína de interesse) em bactéria (E.coli) 5 maneiras de cloning: ligação a enzima de restrição endonucleases específicas reconhecimento de sequências palindrómicas com 4-8 nucleotídeos Padrão de clivagem das enzimas de restrição: cortes blunt (= extremidades cegas ou lisas), ou 5. Ómicas 12  cortes staggered (= extremidades coesivas). A clivagem das ligações fosfodiéster pelas enzimas de restrição cria fosfatos 5' e hidroxilos 3'. gateway cloning Para realizar a clonagem Gateway, você deve primeiro preparar seu fragmento de DNA de interesse envolvendo-o com locais específicos de recombinação (também conhecidos como locais de recombinação Gateway; sequências ATT). Portanto, você deve primeiro clonar seu fragmento de DNA em um "plasmídeo doador". Isso pode ser feito através de métodos de clonagem tradicionais ou usando a clonagem TOPO ou a reação de clonagem Gateway BP Clonase. O plasmídeo resultante é chamado de Clone de Entrada. Uma vez que o fragmento de DNA está em um Clone de Entrada, ele pode ser rapidamente transferido para qualquer vetor de Destino Gateway compatível. Assim, você pode clonar seu gene de interesse uma vez usando clonagem por enzimas de restrição e, em seguida, usar recombinação bacteriana para transferi-lo facilmente para uma série de plasmídeos. Este método é muito útil tanto para transferir muitos fragmentos de DNA para um tipo de plasmídeo quanto para muitos tipos diferentes de plasmídeos. 5. Ómicas 13  Gibson assembly O método de Gibson Assembly, também conhecido como SLIC, é o processo pelo qual muitos fragmentos de DNA são adicionados a uma construção, tudo em uma única reação em tubo de ensaio, produzindo clones sem cicatrizes. Você pode montar várias partes ao mesmo tempo para ter um design de sequência flexível e a capacidade de introduzir promotores, terminadores e outras sequências curtas na montagem. A montagem é concluída em menos de 2 horas. A Gibson Assembly não depende da presença de locais de restrição dentro de uma sequência específica a ser sintetizada ou clonada, portanto, você tem controle total sobre o que está sendo montado. Você também evita a inclusão de sequências adicionais indesejadas, que geralmente são usadas para facilitar a clonagem de várias sequências de DNA. Assim, um número maior de fragmentos de DNA pode ser unido em uma única reação com maior eficiência do que os métodos convencionais. No entanto, atenção: há uma queda acentuada na taxa de sucesso ao montar mais de 5 fragmentos ao mesmo tempo. 5. Ómicas 14  TOPO(TA) cloning A clonagem TOPO utiliza uma única enzima, a topoisomerase (TI), para desenrolar e ligar o DNA. A TI é utilizada no processo natural de replicação; quando o DNA está se desenrolando, isso cria pressão mais adiante, então, para aliviar esse estresse e prevenir quebras, a TI se liga ao DNA, cliva e desenrola, e depois reune o ponto de ruptura que foi criado. A TI é muito eficiente; você pode completar uma reação em apenas 5 minutos à temperatura ambiente, e não precisa usar enzimas de restrição ou ligase. A TI é removida da reação, deixando um fragmento de DNA de interesse selado e inserido no vetor. Apesar do tempo de reação rápido, você pode passar algum tempo na preparação inicial, pois são necessários primers específicos. Além disso, a eficiência da clonagem TOPO pode variar dependendo da polimerase utilizada. Golden Gate Assembly A montagem por Golden Gate utiliza duas enzimas de restrição do tipo IIS, que cortam o DNA fora do local de reconhecimento real da enzima. Os locais de reconhecimento estão separados por pelo menos um par de bases da sequência de overhang, garantindo que não haja cicatrizes na sequência de DNA, pois a sequência de overhang não é ditada pela enzima de restrição. Se a sequência de reconhecimento não for palindrômica, você pode montar múltiplos fragmentos ao mesmo tempo e de maneira ordenada. Além disso, como o local de restrição é alterado durante a reação, a digestão e a ligadura podem ocorrer em um único tubo, ao mesmo tempo. Assim, esse método é frequentemente considerado uma "maravilha de um só pote". 5. Ómicas 15  O processo de ligadura por Golden Gate é próximo de 100% de eficiência, graças aos mecanismos de redigestão. Além disso, a religação é evitada, pois o corte fora dos locais de enzimas de restrição remove-os do produto. No entanto, você pode achar que projetar as sequências de overhang corretas pode ser tedioso, e a montagem por Golden Gate é muito menos independente de sequência do que outros métodos de clonagem. 5. Ómicas 16  T4 DNA ligase: Enzima que une moléculas de DNA, criando moléculas recombinantes. Junta extremidades coesivas e cegas. Reforma ligações fosfodiéster entre 5'-fosfatos adjacentes e 3'- hidroxilas usando um cofator energético. Utiliza ATP como cofator energético. Modificação das extremidades de DNA: Os fosfatos podem ser removidos das extremidades dos ácidos nucleicos por fosfatases. Os fosfatos podem ser adicionados de volta às extremidades do ácido nucleico desfosforilado pela quinase de polinucleotídeos T4. A quinase de polinucleotídeos T4 transfere o fosfato gama (último) do ATP para o 5'-hidroxilo do ácido nucleico. Se o fosfato gama for radioativo (^32P), então o ácido nucleico é 5. Ómicas 17  rotulado com o fosfato radioativo. Todas as ligases de DNA requerem um 5'-fosfato e um 3'-hidroxilo no local da formação da fosfodiéster. 5. Ómicas 18