Genètica Bacteriana - Bloc C PDF

Microbiologia – 2020-21 BLOC C GENÈTICA BACTERIANA INTRODUCCIÓ I AVENÇOS HISTÒRICS Podríem assenyalar un gran nombre d’avenços històrics des de que Mendel, entre d’altres, varen iniciar la disciplina de la genèt...

Microbiologia – 2020-21 BLOC C GENÈTICA BACTERIANA INTRODUCCIÓ I AVENÇOS HISTÒRICS Podríem assenyalar un gran nombre d’avenços històrics des de que Mendel, entre d’altres, varen iniciar la disciplina de la genètica. Aquesta ciència estudia els fenòmens de l’herència i la variació de les espècies. En aquest camp, són molt coneguts els estudis que va realitzar Mendel amb pèsols en el segle XIX. Potser alguns dels avenços posteriors més destacables són la determinació de l’estructura del DNA per Watson i Crick i l’elucidació del codi genètic per diferents investigadors a mitjans del segle XX. A finals del segle XX, la introducció de les tècniques de seqüenciació ràpida (1977) i automatitzada del DNA (1986) són també fites destacables. No obstant, malgrat el seu nom, aquestes tècniques de seqüenciació eren tedioses i no gaire ràpides. Actualment un dels avenços que està revolucionant moltes disciplines científiques es relaciona amb les millores aconseguides en les tècniques de seqüenciació. Aquestes ens permeten conèixer amb precisió i en poc temps els genomes complets de diferents tipus de cèl·lules i virus. El primer genoma cel·lular va ser seqüenciat al 1995 amb una tècnica anomenada seqüenciació aleatòria de genomes complets (whole – genome shotgun sequencing) que permetia per primer cop la seqüenciació de fragments llargs de DNA. Es va realitzar amb el bacteri Haemophilus influenzae que contenia 1,8 milions de parells de bases (Mb). Uns anys després, al 2000, es va presentar la seqüència esborrany del genoma humà. Aquesta tasca es va realitzar amb la col·laboració de diferents laboratoris (principalment dels EEUU). Va durar uns 13 anys i va costar més de 2.000 milions d’euros. En aquest cas el genoma contenia aproximadament uns 3.000 Mb. Pregunta 1. Per què van ser importants els microorganismes per aconseguir la seqüenciació del genoma de l’home amb aquesta tècnica? Els microorganismes van ser utilitzats com a vectors per seqüenciar el genoma humà. Van fragmentar el genoma humà i van introduir aquests fragments en cèl·lules de llevat. Aquestes cèl·lules es van anar multiplicant i aleshores van obtenir moltes còpies. De forma que, seqüenciar el genoma era més fàcil. Si no haguéssim tingut microorganismes no haguéssim pogut seqüenciar el genoma humà. Avui en dia podem seqüenciar el genoma d’una persona en unes poques hores i per menys de 1.000€. Les tècniques utilitzades actualment són variades i molt diferents a la tècnica anterior. Reben el nom comú de seqüenciació de nova generació, massiva o d’alt rendiment (“Next generation sequencing”). Per emmagatzemar tota aquesta gran quantitat d’informació, generada amb la seqüenciació de gens i genomes de milers d’espècies d’organismes, és necessària l’existència de les bases de dades públiques (un altre avenç destacat en aquest camp). Són exemples el GenBank (EEUU), el DDBJ (Japó) i el EMBL (Europa). Són moltes les fites aconseguides en el camp de la genètica utilitzant els bacteris com a model d’estudi (algunes d’aquestes les estudiarem en aquest bloc). ESTUDIS GENÈTICS: MODEL BACTERIÀ Avantatges: Baix temps de generació: En comparació amb altres models, com els pèsols o les mosques del vinagre. Material genètic molt més senzill. A partir d’una cèl·lula bacteriana, en poques hores podem tenir una població de milers de cèl·lules “idèntiques”, que anomenem clon o soca.  Microbiologia – 2020-21 Inconvenients: Mida petita: Per aquest motiu cal estudiar poblacions (no individus). Reproducció sexual no convencional: Aquesta reproducció la hem d’entendre com l’intercanvi de material genètic que es produeix entre els bacteris. Altres models eucariotes utilitzats per fer aquests estudis sí que presenten una reproducció sexual convencional. Pregunta 2. Encara que la definició de clon o soca inclou el fet que aquesta població estigui formada per cèl·lules idèntiques, realment poden ser tan idèntiques totes les cèl·lules d’un clon o soca? No, ja que en aquest procés de multiplicació bacteriana poden aparèixer mutacions. De fet, aquesta és la causa que explica el fet que molts bacteris hagin creat resistències contra els antibiòtics. CONCEPTES GENÈTIC PREVIS: ESTRUCTURA I FUNCIÓ DEL DNA I EL RNA El DNA està compost per dues cadenes formades per seqüències complementàries de 4 nucleòtids diferents: Adenina (A), guanina (G), timina (T) i citosina (C). D’aquesta forma, una cadena pot servir de motlle per formar la cadena complementària. El RNA és similar al DNA, però la desoxiribosa es substitueix per ribosa i timina per uracil (U), sent en aquest cas U la base complementària de A. Per altra banda, la seqüència de triplets de nucleòtids del DNA codifica la seqüència d’aminoàcids en les proteïnes i determina el codi genètic. Pregunta 3. Què vol dir que existeix una degeneració del codi genètic? Es diu que el codi genètic és degenerat perquè hi ha més triplets o codons que aa, de manera que un determinat aa pot estar codificat per més d’un triplet. En concret, tenim 64 triplets (60 + 1 inici: AUG (Met) + 3 STOP) que codifiquen per 20 aa. DOGMA DE LA BIOLOGIA MOLECULAR Va ser proposat per Crick al 1958 i detalla com funciona el flux de la transmissió de la informació genètica. Aquesta informació va de DNA a RNA, per un procés que s’anomena transcripció i de RNA a proteïnes, pel procés de traducció. Així mateix, del DNA s’obtenen còpies pel mecanisme de replicació, que permet que la informació genètica passi d’una generació a la següent. No obstant, avui en dia coneixem que els virus de RNA també es repliquen perquè la seva informació genètica passi d’una generació a la següent. A més, alguns d’ells, com els retrovirus, passen la informació de RNA a DNA. EL GEN BACTERIÀ Concepte clàssic: Un gen conté la informació per la síntesi d’una proteïna (1 gen = 1 proteïna), però hem de pensar que les proteïnes poden estar formades per diferents polipèptids, els quals són productes de diferents gens. Concepte actual: Un gen es defineix com aquella seqüència de nucleòtids que codifica un producte funcional com un polipèptid, rRNA o tRNA. A més, conté seqüències que ni es transcriuen ni es tradueixen, que estan relacionades amb funcions de control (ex: regions reguladores, promotors...). DIFERÈNCIES ESTRUCTURA GÈNICA PROCARIOTES I EUCARIOTES Procariotes: En el cas dels bacteris, la informació normalment és continua sense incloure seqüències no codificants, anomenades introns (freqüents en els eucariotes). Es pot produir la transcripció de 2 gens adjacents conjuntament, formant un mRNA policistònic o poligènic (imatge). Posteriorment, els dos polipèptids es separen en el procés de traducció.  Microbiologia – 2020-21 Eucariotes: Moltes vegades els gens contenen la informació codificant (exons) interrompuda per introns. La transcripció produeix un pre – mRNA inicial que inclou exons i introns. Mitjançant un procés de tall i unió (“splicing”), els introns s’han d’eliminar per formar el mRNA abans de que es produeixi la traducció. ESTRUCTURA I FUNCIÓ DEL GEN BACTERIÀ 2 cadenes de DNA: Cadena codificadora: Conté la informació codificadora del gen i té la mateixa seqüència que el mRNA. Cadena motlle: És complementària i s’utilitza com a motlle per la síntesi del mRNA, durant la transcripció en el sentit 3’ – 5’. Exemple: 5’ CGCTAAATTCG 3’ DNA cadena codificadora. 3’ GCGATTTAAGC 5’ DNA cadena motlle. 5’ CGCUAAAUUCG 3’ mRNA. Promotor: Es troba al principi del gen i és on hi ha la zona de reconeixement i unió (caixa Pribnow) de la RNA polimerasa (l’enzim que sintetitzarà el mRNA). El promotor té la funció d’orientar aquest enzim a una distància específica del primer nucleòtid on s’inicia la transcripció (+1). Aquesta seqüència del promotor ni és transcrita ni traduïda. També té altres funcions relacionades amb la regulació i l’expressió dels gens. Seqüències de remolc i de terminació: Es troben al final del gen i indiquen a la RNA polimerasa el final de la transcripció i es separa del gen. Seqüència líder del mRNA: No es tradueix, però incorpora una seqüència anomenada Shine – Dalgarno que és molt important per determinar l’origen de la traducció del mRNA, orientant la seva unió als ribosomes. Regió codificadora: Comença sempre amb el triplet AUG, que en els bacteris codifica un aminoàcid modificat que s’anomena N – formilmetionina, que s’utilitza per iniciar la síntesi de proteïnes. La regió codificadora finalitza amb un codó de terminació o sense sentit (“stop”) que indica el final de la síntesi de la proteïna i atura la traducció al ribosoma. Situada a continuació, la seqüència remolc no es tradueix però és necessària per la correcta expressió de la regió codificadora del gen.  Microbiologia – 2020-21 ELS AL·LELS Els gens poden presentar diferents formes alternatives que s’anomenen al·lels. L’al·lel més habitual que es troba normalment a la natura s’anomena al·lel salvatge. Depenent de la degeneració del codi genètic, un canvi en una única base del gen pot produir que s’incorpori un aminoàcid diferent en la proteïna. Exemple: Es pot donar un canvi de C per T: En el codó al·lel salvatge: CCC (codifica prolina), codó al·lel mutant: CTC (codifica leucina). Un polimorfisme de nucleòtid únic (SNP: Single Nucleotide Polymorphism) són les formes que presenta un gen degudes a la variació d’una única base i que es presenten amb una determinada freqüència en la població. De vegades, aquest petit canvi pot arribar a ocasionar un fenotip diferent i, fins i tot, una malaltia. CROMOSOMA BACTERIÀ, GENOMA I GENOTIP Cromosoma bacterià: És el principal element genètic dels procariotes i conté la major part de la informació de la cèl·lula. Normalment els procariotes tenen un únic cromosoma circular ue conté la majoria dels gens. En aquesta fotografia s’observa la gran quantitat de fibres de DNA alliberades d’una cèl·lula d’E. coli, que formen el seu cromosoma. Per fer-nos una idea de les mides d’aquestes estructures, una cèl·lula d’E. coli pot tenir aproximadament 1 – 2 μm de llarg per 0,5 μm d’ample. Si estiréssim aquests fils de DNA, mesurarien uns 1 – 1,5 mm. A la part inferior esquerra, es poden veure 2 elements genètics circulars molt petits, que no formen part del cromosoma bacterià. Són plasmidis. Genoma bacterià: Conté tots els gens o material genètic que presenta. Inclou doncs, el cromosoma i els plasmidis (entre altres elements genètics). El genoma d’una cèl·lula d’E. coli pot incloure aproximadament 4 – 5 Mb i uns 3.200 gens. En el cas d’una cèl·lula eucariota, inclouria els cromosomes i els gens dels mitocondris o cloroplasts, entre d’altres elements genètics. Pangenoma bacterià: És un concepte relativament nou que inclou tots els gens de les diferents soques d’una espècie. Depenent de les espècies, les soques d’una mateixa espècie poden variar considerablement en els gens que contenen. Generalment, el nombre de gens augmenta a mesura que es coneixen els genomes de noves soques d’una determinada espècie. Per exemple, el pangenoma E. coli conté aproximadament 20.000 gens. El seu genoma central, és a dir, aquells gens presents en tots les soques, està format per menys de 2.000 gens. No obstant, hi ha gens únics, que són aquells que només estan presents en una soca. Per exemple, una soca d’una E. coli comensal té 20 – 30 gens únics. En canvi, una soca d’una E. coli patògena pot tenir 200 – 300 gens únics. Pregunta 4. Què poden codificar els gens únics d’una soca patògena d’E. coli? La patogenicitat és funció d’alguns antígens superficials i de les toxines que generen. Molts d’aquests (com l’Ag, O i K) es troben a plasmidis d’elevat pes molecular. Per tant, aquests gens únics codificaran per nous antígens de superfície que, alhora, produiran determinades toxines patògenes per altres organismes. Genotip: Es tracta de la informació genètica o conjunt de gens d’una determinada soca d’un bacteri o d’un individu. Fenotip: És el conjunt de característiques observables d’un organisme. En funció d’aquests conceptes podem diferenciar entre variacions genotípiques, també anomenades mutacions. Les mutacions són aquelles que afecten a la seqüència del DNA i variacions fenotípiques, que són canvis que es produeixen causats per l’ambient.  Microbiologia – 2020-21 Exemple: La utilització de la lactosa per E. coli és un clar exemple de variació fenotípica. Tot i tenir el mateix genotip, quan hi ha lactosa en el medi, aquest bacteri produeix l’enzim β – galactosidasa, i si no hi ha lactosa en el medi, no es detecta aquest enzim. És un canvi de tipus enzimàtic. També és un clar exemple de regulació de l’expressió gènica que enllaça el genotip d’un organisme amb el seu fenotip. Aquests canvis deguts a l’ambient poden ser també de tipus morfològic. Pregunta 5. Pots comentar alguna variació fenotípica de tipus morfològic que hagis detectat a les pràctiques quan has fet l’observació de tincions de bacteris? Especialment en la tinció de bacteris gram negatius en una mateixa soca de cultiu pur es podien diferenciar cèl·lules petites i d’altres cèl·lules molt llargues. Això és una variació fenotípica relacionada directament amb la corba de creixement en funció dels nutrients que hi ha al medi, ja que si haguéssim mirat el fenotip d’aquestes cèl·lules haguéssim obtingut un fenotip idèntic. MUTACIONS: TIPUS I EFECTES Les mutacions són canvis permanents i heretables (variacions genotípiques) que es produeixen en la seqüència del DNA. Aquests canvis poden produir efectes positius, negatius o no detectables en les característiques que presenta un organisme. També aquests efectes estan en funció de la importància que tingui per la cèl·lula el gen o gens afectats. CLASSIFICACIÓ DE LES MUTACIONS Segons el seu origen: Mutacions espontànies: Apareixen a l’atzar en totes les cèl·lules, sense un tractament conegut. Una de les característiques més destacables és la seva raresa, ja que apareixen en molta baixa freqüència (un mutant per 107 – 1011 cèl·lules). Es relacionen principalment amb els errors que apareixen en la replicació del DNA. Altres causes es poden relacionar amb el dany o les alteracions produïdes en el DNA per les radiacions, pels mutàgens endògens generats en el metabolisme cel·lular i pels transposons (elements genètics). Mutacions induïdes: Generades per un tractament amb agents mutàgens. Aquests agents provoquen un dany de forma directa en el DNA, alteren la seva química o interfereix d’alguna forma en el seu funcionament, induint mutacions. Segons el grau d’afectació del DNA: Macrolesions: El grau d’afectació del DNA és gran (es veu afectada més d’una base del DNA). Es poden produir per: Delecions (pèrdua del material genètic). Inversions (s’inverteix una seqüència). Duplicacions (multiplicació d’un fragment). Translocacions en el DNA. Microlesions (afecta a un o dos parells de bases). Les substitucions, delecions o insercions d’un únic parell de bases són les més freqüents i s’anomenen mutacions puntuals. MUTACIONS PUNTUALS Podem diferenciar 2 tipus de mutacions puntuals: Transició: Si la mutació és per substitució d’una única base i el canvi es produeix per una base del mateix tipus químic (ex: purina per purina o pirimidina per pirmidina). Són transicions els canvis de G per A o A per G i C per T o T per C. Transversió: Es produeix quan canvia el tipus químic de la base (ex: purina per pirimidina o a l’inrevés). EFECTES O CONSEQÜÈNCIES DE LES MUTACIONS EN UNA PROTEÏNA Els efectes o conseqüències d’aquests mutacions en les proteïnes, poden ser diversos des de no detectar-se fins a arribar a ser no funcional. Depèn de la importància de la proteïna en la cèl·lula, del lloc que es vegi afectat... També pot dependre del tipus de base que s’hagi canviat, en funció de la degeneració del codi genètic.  Microbiologia – 2020-21 Podem diferenciar diversos tipus: Mutació silenciosa: Canvia la seqüència d’un codó, però no es modifica l’aminoàcid que s’incorpora. Per aquest motiu, no detectem cap canvi a la proteïna. Exemple: Un canvi de AGG per CGG codifica el mateix aminoàcid, l’arginina. Mutació neutra: Canvia la seqüència d’un codó i s’inclou un nou aminoàcid. Podem detectar el canvi a la proteïna, però si el nou aminoàcid té la mateixa funció a la proteïna, aquesta no es veurà afectada. Exemple: Un canvi de AAA, que codifica lisina, per AGA, que codifica arginina. Aquests dos aminoàcids tenen la mateixa funció a la proteïna. Mutació sense sentit: El nou aminoàcid té un altre funció. Els efectes a la proteïna dependran d’on es produeixi el canvi. No sempre s’afecta la funcionalitat de la proteïna. Mutació en sentit erroni: S’incorpora un codó de terminació i això provocarà una aturada primerenca de la traducció, produint-se un polipèptid i incomplet. Algunes mutacions puntuals es produeixen per delecions o insercions d’una única base. Aquestes provoquen el desplaçament del marc de lectura i alteren substancialment la seqüència primària del polipèptid codificat. Per poder entendre els efectes d’aquestes mutacions podem plantejar el següent exemple que utilitza una frase amb paraules de tres lletres en lloc de codons de bases: UNAOCAQUECAUDELCIM Descodifiquem UNA OCA QUE CAU DEL CIM UNAOCAQUECAUDELCIM Deleció de la lletra A UNOCAQUECAUDELCIM Descodifiquem UNO CAQ UEC AUD ELC IM Es perd el significat Però, de la mateixa forma, amb una altra mutació addicional podem recuperar en part el sentit inicial de la frase i, en el cas del DNA, la seqüència inicial de la proteïna. UNOCAQUECAUDELCIM Inserció de la lletra I UINOCAQUECAUDELCIM Descodifiquem UIN OCA QUE CAU DEL CIM Es recupera en part el significat Pregunta 6. Quins canvis produiria a la seqüència d’aminoàcids, la delecció de la primera A de la seqüència de DNA: GACATGAAACATCCC? Amb la deleció de la primera A de la seqüència de DNA canvia tota la seqüència. 5’-GACATGAAACATCCC-3’ DNA cadena codificadora Deleció primera A: 3’-CTGTACTTTGTAGGG-5’ DNA cadena motlle 5’-GCATGAAACATCCC-3’ DNA cadena codificadora 5’-GACAUGAAACAUCCC-3’ mRNA 3’-CGTACTTTGTAGGG-5’ DNA cadena motlle Descodifiquem: 5’-GCAUGAAACAUCCC-3’ mRNA 5’- GAC – AUG – AAA – CAU – CCC -3’ Descodifiquem: 5’ – Asp – Met – Lys – His – Pro – 3’ 5’- GCA – UGA – AAC – AUC – CC -3’ 5’ – Ala – STOP – Asn – Ile MUTAGÈNESI I DETECCIÓ I AÏLLAMENT DE MUTANTS Pregunta 7. Amb els coneixements teòrics i pràctics de microbiologia que tens, què faries per detectar i aïllar un bacteri mutant resistent a un antibiòtic? Si saps que hi ha un bacteri resistent: Posem el bacteri en un medi de cultiu amb antibiòtic. Si no saps que hi ha un bacteri resistent: Cal molta mostra perquè, quantes més cèl·lules tens, més probabilitat hi ha de que hi hagi un bacteri resistent degut a mutacions espontànies.  Microbiologia – 2020-21 Hi ha diferents formes de detectar i seleccionar mutants amb més o menys facilitat. Com ja hem vist, la freqüència d’obtenció de mutants per mutació espontània és molt baixa (un mutant per 107 – 1011 cèl·lules). Per tal d’augmentar la freqüència de mutació, s’utilitzen tècniques que inclouen l’ús d’agents mutàgens. Entre els més utilitzats destaquen diferents agents químics o físiques, com les radiacions que provoquen diferents tipus de danys al DNA. A l’utilitzar mutàgens, la freqüència de mutació es pot incrementar fins a obtenir un mutants per 103 – 106 cèl·lules. Una vegada hem obtingut el mutant, podem aplicar una segona mutació per veure com reverteixen i com es recupera el fenotip inicial. Obtenció de mutants auxotròfics Selecció de mutants: obtenció de per la lisina mitjançant la tècnica mutants revertents que poden sintetitzar de rèplica en placa lisina (protòtrofs) a partir d’un nou tractament amb mutàgens dels ESTUDI DE LES REVERSIONS Reversió vertadera: Es torna al genotip inicial. Al fer la mutació 2 torna a ser de tipus salvatge (no pots distingir entre el revertit i el salvatge). Per simplificar aquest estudi utilitzarem només un parell de bases. Es produeix una reversió veritable quan el revertent recupera el mateix parell de bases que tenia la soca salvatge: Tipus salvatge...mutació 1...Mutant...mutació 2...Revertent (GC) (AT) (GC) Nou parell de bases: Si en el revertent presenta un nou parell de bases, el fenotip original es pot recuperar per la producció d’una mutació silenciosa o una mutació neutra. Mutació silenciosa: Quan s’incorpora un nou parell de bases però el codi genètic queda igual. No es pot detectar a nivell proteic però sí a nivell genètic (té el mateix aminoàcid). Mutació neutra: Canvia la base i comporta un canvi en l’aa, però té la mateix funció. Mutació supressora: En aquest cas la segona mutació compensa els efectes de la mutació inicial. Podem diferenciar: Mutació supressora intragènica: Les dues mutacions es produeixen en el mateix gen. Exemple: Aquelles que provoquen el desplaçament del marc de lectura. Mutació supressora extragènica: La segona mutació (la que corregeix el gen) es produeix en un gen diferent.  Microbiologia – 2020-21 Pregunta 8. Com es pot compensar la mutació inicial en un gen amb una mutació supressora extragènica? Descriu un exemple real. Es produeix una mutació en un gen determinat, per exemple, el gen 1. Per corregir-la es produeix una mutació en el gen que codifica el RNA de transferència, que agafa els aa del gen 1 (abans de ser mutat) i els afegeix a la cadena, de forma que corregim la mutació. MUTÀGENS Els mutàgens són agents que causen mutacions. N’hi ha de varis tipus amb diferents mecanismes d’acció: Incorporació al DNA, unió al DNA, danys físics... MUTÀGENS QUÍMICS S’uneixen o s’incorporen al DNA (l’alteren). Anàlegs de bases: Són semblants a les bases del DNA però tenen les seves propietats d’emparellament alterades. Exemple: El 5 – bromouracil (5BrU) és un anàleg de la T que pot emparellar-se amb A o G, degut a que la seva molècula pot presentar amb freqüència canvis tautomèrics (formes ceto i enol). Si el 5BrU s’incorpora al DNA durant la multiplicació d’un bacteri pot arribar a produir transicions estables (ex: De AT a GC: (A T)...(A 5BrU)...(G 5BrU)...(G C)). Agents intercalants: Distorsionen el DNA a l’inserir-se entre 2 bases de la mateixa cadena. Durant la replicació, aquesta distorsió de la cadena provoca l’aparició d’insercions o delecions. Exemple: Les acridines i el bromur d’etidi. Reaccionen amb el DNA provocant canvis directes a les bases: Àcid nitrós: Desamina les bases de DNA. Pot desaminar A i transformar aquesta base a hipoxantina (H) directament a la mateixa cadena. Quan es repliqui el DNA, en dos cicles pot produir una transició: (A T) – (H T)...(H C)...(G C). Agents alquilants: S’afegeixen grups alquil entre les cadenes del DNA. La metil – nitrosoguanidina és un agent alquilant monofuncional molt potent que afegeix un grup metil a la G i fa que aquesta base modificada s’aparelli amb T. També pot funcionar com agent alquilant bifuncional entrecreuant les cadenes del DNA amb enllaços covalents. Altres agents d’aquest tipus són les mostasses nitrogenada i la mitomicina. La cèl·lula, per desfer-se dels efectes d’aquestes mutacions i poder multiplicar-se, ha d’activar enzims que degradin les zones bloquejades del DNA. Aquest mecanisme de reparació del DNA provoca tot tipus de mutacions: Transicions, transversions, desfases i macrolesions. MUTÀGENS FÍSICS: RADIACIONS. REPARACIÓ DEL DNA Radiacions ionitzants (ex: raigs X, raigs gamma): Poden produir moltes mutacions a més d’altres efectes biològics.  Microbiologia – 2020-21 Radiació ultraviolada (UV): És de 260 nm i, per tant, és fortament absorbida pel DNA. Una de les alteracions que provoca és la formació de dímers de pirimidines adjacents en la mateixa cadena, habitualment dos T unides per enllaços covalents (T=T). Quan el DNA es replica, la DNA polimerasa no sap quina base incorporar en la posició que es troben aquests dímers i es produeixen errors que provoquen moltes mutacions que causen la mort dels bacteris. REPARACIÓ DANY RADIACIÓ UV Fotoreactivació: Si les cèl·lules després de ser irradiades amb radiació ultraviolada de 260 nm, s’irradien immediatament amb llum visible aquestes mutacions es reparen i les cèl·lules tornen a ser viables. La llum visible activa la fotoliasa i aquest enzim trenca els enllaços covalents entre les dos bases que desfà els dímers de pirimidina, deixant el DNA intacte. Aquesta reparació està lliure d’errors. Reparació fosca: Mecanismes que no necessiten la presència de llum visible. Hi ha diversos tipus de reparació. Per escissió: Hi ha 2 tipus, la reparació per escissió de nucleòtids i la de bases. Tots dos tipus utilitzen un enfocament semblant: Eliminar la part danyada de la cadena de DNA mitjançant una endonucleasa i utilitzar la cadena complementària intacta com a motlle per la síntesi del fragment eliminat de l’altra cadena. Aquesta reparació està lliure d’errors. Per recombinació: Es produeix quan s’està produint la replicació del DNA i les dos cadenes ja estan separades. Si una de les cadenes té un dímer de T, la DNA polimerasa no pot llegir aquest fragment de la cadena i deixa un fora. La proteïna RecA s’encarrega de tallar el fragment homòleg format en la replicació de l’altra cadena, per omplir el forat que ha deixat el dímer de T. Després el dímer de T es pot corregir pel mecanisme de fotoreactivació o pel d’escissió. Reparació SOS: De vegades els danys que han provocat les mutacions en el DNA són tan grans que és necessari que la cèl·lula activi el mecanisme de resposta global SOS. Participen aproximadament 40 gens (recA, lexA, uvrA, umuCD...). Si l’afectació del DNA és molt ran, els enzims activats eliminen molts fragments de les cadenes. Per reparar aquests fragments ja no existeix la cadena motlle i s’han d’incorporar bases a l’atzar per sintetitzar de nou les cadenes. Això provoca molt errors i, conseqüentment, moltes mutacions. Reparació per escissió Reparació per de nucleòtids en E.coli recombinació  Microbiologia – 2020-21 REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA Operó: Unitat d’expressió gènica coordinada dels gens que participen en el catabolisme o biosíntesi d’enzims. Al sistema de regulació enzimàtica (operó) hi participen els següents gens: Regulador: Sintetitza una proteïna repressora activa o inactiva segons el tipus de regulació. Promotor: És on es lliga la polimerasa per fer la traducció de l’RNAm. Operador: És on actua la proteïna repressora d’aquest sistema. Estructurals: Codifiquen un polipèptid. MECANISME D’INDUCCIÓ GÈNICA: OPERÓ LACTOSA Quan parlàvem de les variacions fenotípiques, hem comentat que la utilització de la lactosa per E. coli és un clar exemple de regulació de l’expressió gènica. Quan hi ha lactosa en el medi, aquest bacteri produeix l’enzim β – galactosidasa i si no hi ha lactosa en el medi, no es detecta aquest enzim. D’alguna forma s’han i desactivar els gens que participen en aquest catabolisme. Per arribar a conèixer com funcionaven aquests mecanismes de regulació, Monod i col·laboradors al 1940 van fer un munt d’experiments amb E. coli, induint mutacions als diferents gens implicats i arribant al concepte de l’operó. En el cas de l’operó lactosa participen gens: Regulador (lacI) que sintetitza una proteïna repressora (repressor actiu). Promotor (lacP). Operador (lacO). Gens estructurals que codifiquen diferents enzims: La β – galactosidasa (lacZ) que transforma lactosa en glucosa i galactosa. Una permeasa (lacY) responsable de la captació de lactosa. Una acetilasa (lacA). NO lactosa Lactosa És un clar mecanisme d’inducció gènica típic dels enzims inclosos en processos catabòlics. En aquests casos els enzims que participen són induïbles ja que només són necessaris quan el substrat està disponible. No es detecten quan el substrat no està disponible i, per ant, no hi ha inductor. En el cas de l’operó lactosa l’inductor és l’al·lolactosa, que es forma quan hi ha lactosa a l’interior de la cèl·lula. L’inductor bloqueja l’acció del repressor i deixa lliure la transcripció dels gens estructurals.  Microbiologia – 2020-21 MECANISME DE REPRESSIÓ GÈNICA: OPERÓ TRIPTÒFAN En el cas dels enzims que participen en processos de biosíntesis, com per exemple en la síntesi d’aminoàcids, aquest control és una mica diferent. Es tracta d’un procés de repressió gènica, on els enzims són reprimibles quan el producte final de la síntesi està en excés (ex: triptòfan) i no es necessita més quantitat per la síntesi de proteïnes. En aquest cas, el repressor que produeix el gen regulador és inactiu i s’activa quan hi ha triptòfan de més, molècula que funciona com a correpressor. Nivells baixos de triptòfan: Nivells alts de triptòfan: Es Es produeix la transcripció de produeix la repressió l’operó sencer Alguns enzims, que s’anomenen enzims constitutius, es sintetitzen contínuament a una taxa constant, ja que es necessiten sempre. Exemple: Els enzims de la glucòlisi, que participen en el catabolisme de la glucosa, font de carboni i energia àmpliament utilitzat a la natura. Pregunta 9. Amb el que hem explicat fins ara sobre la regulació gènica, quin sucre utilitzaria primer una soca de E. coli si en el medi de cultiu hi ha glucosa i lactosa? Glucosa, ja que és una via més ràpida i menys costosa. En el cas de la lactosa, per poder-la aprofitar, primer hem de trencar el disacàrid en galactosa i glucosa, i això comporta un cost energètic (a més, els enzims no són constitutius, a diferència d’en la glucosa). Però, tant la glucosa com la lactosa s’haurien de poder utilitzar. ALTRES MECANISMES DE REGULACIÓ (A NIVELL DE TRANSCRIPCIÓ, TRADUCCIÓ) Alguns són sistemes de regulació global que afecten a molts gens i moltes vies simultàniament. El mecanisme de repressió per catabòlit dona resposta a la pregunta 9. Si una soca de E. coli creix en un medi de cultiu amb glucosa i lactosa, utilitzarà primer la glucosa fins que s’esgoti i després continuarà amb la lactosa, activant-se la síntesi de la β – galactosidasa. Aquest patró de creixement s’anomena diàuxic i el mecanisme de regulació que participa és el mecanisme de repressió per catabòlit. La glucosa, la millor font d’energia i carboni per aquest bacteri, s’utilitza primer perquè els enzims que participen a la glucòlisi són constitutius i perquè l’operó lactosa està inhibit per la repressió per catabòlit. Aquest mecanisme inhibeix l’expressió de l’operó quan hi ha molta glucosa en el medi, encara que hi hagi lactosa. REGULACIÓ DE L’OPERÓ LACTOSA PER LA REPRESSIÓ PER CATABÒLIT El monofosfat d’adenosina cíclic (cAMP) participa com a senyal metabòlica. Quan hi ha molta glucosa baixa el nivell de cAMP i si baixa el cAMP es produeix la repressió de l’operó lactosa. També participa la proteïna activadora per catabòlit (CAP) que és la receptora de cAMP.  Microbiologia – 2020-21 Si augmenta el cAMP (nivells baixos de glucosa), la CAP capta cAMP i s’uneix al lloc CAP. Aquest lloc està situat a prop del promotor. La unió del complex CAP – cAMP en aquest lloc, facilitat la unió de la RNA polimerasa, estimulant d’aquesta forma la transcripció a nivells màxims. Si no hi ha cAMP (nivells alts de glucosa), no hi ha unió de la CAP amb el cAMP, la CAP està inactiva i no s’uneix al lloc CAP. El nivell de transcripció és baix. INTERCANVI GENÈTIC ENTRE BACTERIS A diferència dels eucariotes, els bacteris no presenten reproducció sexual ni meiosi. No obstant, poden incrementar la seva variació genètica utilitzant diferents mecanismes d’intercanvi genètic: Transformació, transducció i conjugació. Aquests mecanismes s’anomenen col·lectivament transferència horitzontal de gens i són molt importants en els processos d’adaptació i evolució de les espècies. Durant aquests processos, una porció del DNA de la cèl·lula donadora, l’exogenot, és transferit a la cèl·lula receptora, formant un merocigot, o diploide parcial temporal. El destí de l’exogenot a la cèl·lula receptora pot variar: Exogenot integrat a la cèl·lula receptora: L’exogenot es pot integrar a l’endogenot produint un clon de cèl·lules que incorporen aquest nou fragment. Clon parcialment diploide: Si no s’integra, i té la capacitat de replicar-se a l’interior de la cèl·lules receptora, formarà un clon parcialment doble. Cèl·lula diploide parcial: Si no s’integra, i té la capacitat de replicar-se a l’interior de la cèl·lula receptora, només aquesta última serà un diploide parcial. Restricció de l’hoste: L’exogenot pot ser degradat per nucleases de la cèl·lula receptora. RESUM CONCEPTES IMPORTANTS Exogenot: Prové de fora (material de la cèl·lula donadora). Endogenot: Material genètic del propi organisme (material de la cèl·lula receptora). Transformació: El DNA que passa de la cèl·lula donadora a la receptora prové de la degradació, es capta DNA lliure (fàcil en la natura), Transducció: El DNA prové d’un bacteriòfag (virus de bacteris). Conjugació: El DNA prové d’un altre bacteri. Hi ha contacte directe entre la cèl·lula donador i receptora.  Microbiologia – 2020-21 TRANSFORMACIÓ En aquest tipus d’intercanvi genètic, el fragment de DNA de la cèl·lula donadora està lliure en el medi. Es pot trobar DNA lliure en molts ambients, ja que s’allibera després de la lisi dels bacteris. Com aquest procés és aleatori, qualsevol fragment de DNA pot arribar a posar- se en contacte amb la cèl·lula receptora, una altra cosa és que arribi a entrar i transformi la cèl·lula receptora.. Això dependrà del tipus de transformació. Hi ha diferents tipus de transformació, detallarem un procés de transformació natural i un procés de transformació artificial. TRANSFORMACIÓ NATURAL Els experiments de Griffith realitzats al 1928 sobre la transferència de virulència en Streptococcus pneumoniae són un bon exemple de transformació natural. El Streptococcus pneumoniae pot tenir colònies de dues formes: Llises S: Amb càpsula i molts patògens. Rugoses R: Sense càpsula i de baixa patogenicitat. També van ser pioners aquests estudis per a senyalar que a les cèl·lules hi havia un material que dirigia funcions i que Griffith va anomenar Principi Transformador. Anys després es va veure que aquest principi transformador era el DNA. En aquests experiments, quan s’injectava una combinació de bacteris virulents morts (soca S, amb càpsula) i una soca no virulenta viva (soca R, sense càpsula), els ratolins morien. D’aquests animals morts es podien recuperar bacteris virulents vius S, és a dir, algunes cèl·lules R s’havien transformat en S. El responsable era un fragment de DNA lliure en el medi que provenia de les cèl·lules S i que codificava la síntesi de la càpsula. Aquesta estructura és la responsable de la virulència d’aquesta espècie. En aquest tipus de transformació natural es necessita que la cèl·lula sigui competent i S. pneumoniae ho és. Això vol dir, que aquesta espècie capta DNA lliure i es transforma. No tots els bacteris són competents, per exemple, E. coli no ho és. En el model de S. pneumoniae, les cèl·lules entren en un estat de competència per captar DNA i transformar-se. Per tal d’arribar a aquest estat es noten uns canvis en les cèl·lules i s’expressen determinats gens. Experiments de transformació de Griffith a) Els ratolins morien de pneumònia quan se’ls injectava soques patògenes de pneumococs S, que presenten càpsula i formen colònies amb aspecte llis. b) Els ratolins sobrevivien quan se’ls injectava una soca de pneumococs R, que no té càpsula i formen colònies rugoses. c) La injecció de soques de pneumococs S morts per calor no tenia efecte. d) La injecció d’una soca R viva i una soca S morta per calor causava pneumònia als ratolins, i dels ratolins morts es podia aïllar pneumococs de la soca S vius.  Microbiologia – 2020-21 TRANSFORMACIÓ ARTIFICIAL Encara que S. pneumoniae sigui un bon model de transformació natural, no és útil per fer transformacions al laboratori. Pregunta 10. Per què no és útil treballar amb aquest model al laboratori? Perquè és un patogen que no creix bé en medis normals (agar sang) i actualment encara no es coneix prou bé, podem dir que és un model molt desconegut. La trnadformacio ed a baixa frequencia I preferim algo inocuo En el laboratori podem treballar amb E. coli amb un model de transformació artificial. Per millorar els rendiments d’obtenció de cèl·lules transformades s’utilitzen: Plasmidis: Que tenen DNA circular i, per tant, són més estables que els fragments de DNA lliures. Medis amb CaCl2: Que fan més permeables les membranes de les cèl·lules al DNA, ja que E. coli no capta per si mateixa el DNA lliure. També es pot augmentar la permeabilitat de les membranes tractant les cèl·lules amb polsos elèctrics d’alt voltatge amb la tècnica de l’electroporació. Aquests polsos creen microporus en les membranes que permeten el pas dels plasmidis. Quan acaba la descàrrega, la membrana recupera la seva integritat. TRANSDUCCIÓ En aquest cas, l’exogenot passa de la cèl·lula donadora a la receptora mitjançant un bacteriòfag. Per entendre aquest mecanisme de transferència de gens hem de revisar el cicle lític i el cicle lisogènic dels bacteriòfags. Caulsevol gen de ls celula donsdora pot pasar a la celula receptora Hi ha 2 tipus: Transducció generalitzada i Transducció especialitzada. Cicle lític i lisogènic de fags temperats Els fags virulents experimenten únicament el cicle lític. Els fags temperats tenen dues fases en els seus cicles vitals. El cicle lisogènic permet al genoma del virus replicar-se de forma passiva quan es replica el genoma de la cèl·lula hoste. Determinats factors ambientals, com la radiació UV, poden provocar un canvi del cicle lisogènic al cicle lític. En el cicle lític es produeixen noves partícules víriques que s’alliberen quan la cèl·lula hoste es lisa. TRANSDUCCIÓ GENERALITZADA En aquest cas, qualsevol gen de la cèl·lula donadora pot passar a la cèl·lula receptora. Es relaciona amb el cicle lític dels bacteriòfags. Procediment: 1. El bacteriòfag injecta material genètic amb la finalitat de multiplicar-se dins la cèl·lula infectada i crear moltes còpies del seu virus. 2. El DNA víric és suficient per multiplicar el fragment de DNA i les proteïnes per formar la càpsida que l’envolten, per això la càpsida queda fora. 3. El bacteriòfag anul·la la capacitat de funcionament del genòfor (destrueix el DNA de l’hoste). 4. El DNA del bacteri es fragmenta per nucleases. 5. El bacteri conté moltes còpies del DNA víric i fragments del seu propi DNA (que provenen del genòfor trencat). 6. El DNA víric ha de ser incorporat a la càpsida. Per això, després es produeix la síntesi del DNA i de proteïnes de càpsida del virus.  Microbiologia – 2020-21 7. Després de la síntesi de la càpsida i l’assemblatge del virus, es produeix la lisi de la cèl·lula. S’alliberen partícules fagocitades i infecta a una altra cèl·lula. En el procés de formació dels bacteriòfags es pot produir un error i un fragment del cromosoma degradat de la cèl·lula donadora (exogenot) s’inclou en un nou bacteriòfag que s’anomena partícula transductora. Aquest bacteriòfag no té la informació genètica del virus i no pot produir un procés lític. Funciona, doncs com un transportador de gens des de la cèl·lula donadora i, quan surt d’aquesta, infecta a la cèl·lula receptora amb l’exogenot i es produirà, aleshores la transducció quan es recombini amb l’endogenot. La quantitat de DNA bacterià transportat depèn principalment de la mida de la càpsida del bacteriòfag. S’anomena transducció generalitzada perquè qualsevol gen del bacteri donador pot ser transferit d’aquesta manera a la cèl·lula receptora. En canvi, a la transducció especialitzada, només algun gen. TRANSDUCCIÓ ESPECIALITZADA En aquest cas, només alguns gens de la cèl·lula donadora poden passar a la cèl·lula receptora. Es relacions amb el cicle lisogènic dels bacteriòfags. En el procés d’escissió del pròfag del cromosoma de la cèl·lula donadora es pot produir un error i un fragment contigu d’aquest cromosoma (exogenot) substitueix una part del genoma del fag. Els gens que es pugui emportar depèn d’entre quins gens s’integri el pròfag en el cromosoma de la cèl·lula donadora. Quan aquest fag es formi i surti de la cèl·lula donadora, pot arribar a infectar una cèl·lula receptora. Es produirà la transducció quan es recombini amb l’endogenot. FAG LAMBADA A la imatge es descriu una escissió normal i una amb error en el cas de la lisogènia produïda pel fag lambda i E.coli. El pròfag en aquest cas s’integra entre els gens gal i bio mitjançant la localització i unió en el lloc att (“attachment”). Si es produeix un error d’escissió, el fag només es pot emportar algun d’aquests dos gens a costa de perdre part del seu propi genoma. Per aquest motiu, aquests fags lambda s’anomenen defectius i poden transportar gens bio o gal (λdgal o λdbio). Aquests fags quan surtin de la cèl·lula donadora podran infectar una cèl·lula receptora. Es produirà la transducció quan els gens s’integrin amb l’endogenot. Transducció especialitzada d’un fag temperat CONJUGACIÓ En aquest cas, la transferència de gens es fa per contacte directe entre dues cèl·lules mitjançant un pèl sexual (pilus), aquestes dues cèl·lules bacterianes són: La donadora (Hfr, F+) i la receptora (F-).  Microbiologia – 2020-21 Cèl·lules donadores: Poden ser Hfr (“High Frequency of Recombination”) o les F+. Aquestes cèl·lules contenen un plasmidi anomenat factor F (F de fertilitat) que codifica per la formació del pili sexual. Cal fer una diferència pel que fa a aquest factor: Cèl·lules Hfr: Factor F integrat al genòfor (al cromosoma). Cèl·lules F+: Factor F no integrat al genòfor. Cèl·lules receptores: Les cèl·lules receptores no tenen aquest plasmidi s’anomenen F-. Podem trobar vàries situacions: Una F es pot transformar en Hfr quan el plasmidi F s’integra en el seu cromosoma. Creuament F+ - F-: El plasmidi es replica en F+ i una copia passa a la F-, convertint-se en F+ (Intercanvi del factor F). Creuament Hfr – F-: Com el plasmidi està integrat en el seu cromosoma, mobilitza la transferència de gens fent una còpia dels mateixos i els passa a la F- (No intercanvi del factor F). El nombre de gens que passen de Hfr a F- depèn de la durada de la conjugació. La F- informació genètica, però no es converteix en F+ o Hfr. PLASMIDIS Els plasmidis són petits elements genètics que estan formats per una doble cadena de DNA i poden existir de forma independent al cromosoma. Característiques principals: Tenen la capacitat de replicar-se de forma autònoma. Contenen pocs gens (en general menys de 30) i la informació que contenen no és essencial pel bacteri (són elements genètics prescindibles). No obstant, aquests gens poden conferir un avantatge selectiva en certs ambients. Poden estar tan en eucariotes com en procariotes, però normalment els trobem en eucariotes. Poden trobar-se des d’una còpia a moltes per cèl·lula.  Microbiologia – 2020-21 Alguns plasmidis poden integrar-se en el cromosoma i es repliquen amb el cromosoma. Aquests s’anomenen episomes. No tots els plasmidis poden transferir-se d’una cèl·lula a una altra. PLASMIDIS CONJUGATIUS: PLASMIDI F (FACTOR F) Transmissibles entre bacteris pel procés d’intercanvi genètic de conjugació. Tenen un mida aproximada de 100 Kb. Contenen gens que codifiquen la síntesi del pilus sexual i controlen la replicació i transferència de la informació genètica de la cèl·lula donadora a la receptora. Contenen seqüències d’inserció (IS) que permeten la integració del plasmidi F en el cromosoma. Aquestes IS poden recombinar- se amb seqüències semblants que es troben en el cromosoma de la cèl·lula i permetre aquesta integració. Les IS proporcionen petites regions d’homologia entre el DNA del plasmidi i del cromosoma ja que, aquests 2 elements genètics presenten seqüències de DNA molt diferents. PLASMIDIS DE RESISTÈNCIA (FACTOR F) Al 1953, al Japó es va produir una epidèmia per Shigella dysenteriae. Aquest bacteri es va fer resistent a molt antibiòtics en un període molt curt de temps. En poc temps, es va descobrir un nou tipus d’elements genètics que eren la causa d’aquesta multirresistència: Els plasmidis. Pregunta 11. Per què aquesta multirresistència no podia estar produïda per mutacions espontànies? No es pot explicar amb la mutació ni amb la selecció natural ja que, el procés de resistència va ser molt ràpid. Els plasmidis de resistència (R): Bacteris difícils de matar en cas de malaltia. Contenen gens que codifiquen la síntesi d’enzims que inactiven l’acció de determinats antibiòtics o els transporten fora de la cèl·lula (transposons). També poden desactivar l’acció de determinats metalls que afecten als bacteris. Alguns poden ser conjugatius. Els mecanismes que utilitzen per desactivar els antibiòtics i metalls tòxics són variats: Antibiòtics (ex: penicil·lina): Per inactivar la medicina, alguns plasmidis codifiquen una β – lactamasa, que és un enzim que trenca l’anell betalactàmic de la molècula d’aquest antibiòtic. Metalls tòxics (ex: Hg): En el cas dels metalls, poden ser tòxics pels bacteris a determinades concentracions. Alguns plasmidis codifiquen enzims, com la reductasa, que redueixen les formes tòxiques oxidades (Hg2+) d’aquest metall a Hg0 que és menys tòxic i volàtil. Un únic plasmidi R pot contenir diferents gens que codifiquin resistència (determinants de resistència) a diferents agents antimicrobians (ex: cloramfenicol, sulfamida, estreptomicina, ampicil·lina, kanamicina) i, fins i tot, a metalls, com el plasmidi R100 (ex: Hg). Quan són conjugatius una part del plasmidi conté els gens que codifiquen la seva transferència (factor de transferència de resistència: RTF; gen tra en el plasmidi R100).  Microbiologia – 2020-21 ALTRES TIPUS DE PLASMIDIS Plasmidis que codifiquen bacteriocines: Les bacteriocines són proteïnes produïdes per bacteris que inhibeixen o destrueixen altres bacteris estretament relacionats (ex: soques de la mateixa espècie). Per exemple, els plasmidis Col codifiquen colicines dirigides contra E. coli. Algunes colicines s’uneixen a receptors específics i causen la lisi cel·lular. Poden donar un avantatge competitiu al bacteri que els conté. Plasmidis de virulència: Contenen gens que codifiquen la síntesi de toxines o que augmenten la capacitat de resistir les defenses de l’hoste (ex: soques enterotoxígenes de E. coli, toxina tetànica de Clostridium tetani, toxina del carboncle de Bacillus anthracis). Plasmidis metabòlics: Contenen gens que codifiquen enzims que degraden diferents substàncies (ex: pesticides, petroli). Poden ser interessants per degradar alguns compostos contaminants a la natura en processos de bioremediació. TRANSPOSONS Els transposons són segments de DNA que tenen la capacitat de desplaçar-se (saltar) pel genoma de procariotes i eucariotes. Els més senzills s’anomenen seqüències d’inserció (IS) i contenen només gens necessaris per la seva transposició. Les IS tenen uns 750 – 1.600 bp necessaris per codificar una transposasa. Es poden detectar per presentar seqüències inversament repetides en els extrems (IR) d’uns 10 – 50 bp. El nombre d’IS en un bacteri varia. Per exemple, determinades soques d’E. coli tenen fins a 10 còpies. Com ja hem comentat, alguns plasmidis també tenen IS. Els transposons compostos tenen uns 10 – 15 Kb perquè contenen més gens, a més, del de la transposasa. També tenen seqüències inversament repetides en els extrems o IS. Poden codificar gens de resistència als antibiòtics, toxines, etc. TIPUS DE TRANSPOSICIONS Conservativa: Mitjançant la transposasa, s’escindeix d’un lloc del cromosoma i s’insereix en un altre. Només trobaríem 1 copia d’aquest tipus de transposó en el cromosoma. El transposó pot moure’s però no pot replicar-se. Replicativa: El transposó primer es replica i després salta a un altre lloc del cromosoma, concretament, als llocs diana on s’integren són seqüències específiques d’uns pocs parells de bases (5 – 9 bp). Per tant, el nombre total de còpies és 2 com a mínim. En la majoria de transposons, una copia queda en el lloc original i l’altre s’insereix al genoma. EFECTES DE LA TRANSPOSICIÓ Poden produir mutacions a l’inserir-se en un gen determinat.  Microbiologia – 2020-21 Participen en la formació dels plasmidis i en la disseminació ràpida de la informació genètica. De fet, els plasmidis de resistència múltiple als antibiòtics poden formar-se per l’acumulació de transposons que inclouen gens de resistència diferents. Poden saltar d’un plasmidi a un cromosoma i també d’una cèl·lula a una altra, si és de tipus conjugatiu. RECOMBINACIÓ GENÈTICA La recombinació genètica és el procés en el que un o més segments de DNA es reorganitzen o combinen i formen una nova seqüència de nucleòtids. Hi ha diferents tipus: General o Homòloga: És la més freqüent. Es dona entre seqüències molt semblants, que s’anomenen homòlogues, en qualsevol lloc del genoma. No fa falta que sigui completament idèntica. Si la molècula és molt semblant al lloc on s’ha d’integrar, és molt fàcil que s’integri per complementarietat. La regulen els gens rec del cromosoma de la cèl·lula. Específica de lloc: És aquella que es dona en la integració de genomes virals en bacteris (veure punt: transducció especialitzada). Al no existir homologia entre els genomes virals i els dels bacteris, la integració es produeix mitjançant els llocs att o d’unió. Aquests llocs són unes seqüències molt petites i homòlogues que presenten tant els fags com els bacteris. En aquest tipus de recombinació intervenen enzims codificats pel fag. Replicativa: És aquella que es dona en el procés de la transposició (veure punt: transposons). En aquest tipus de recombinació intervenen enzims codificats pel propi transposó. En aquest cas, tampoc és necessari que hi hagi una homologia entre els dos tipus de segments de DNA que es recombinen. Es generen dues còpies com a mínim. No és imprescindible un previ intercanvi genètic. TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANT Enginyeria genètica: Modificació deliberada de la informació genètica d’un organisme mitjançant l’alteració directa del genoma. Tecnologia del DNA recombinant: Algunes de les tècniques utilitzades a l’enginyeria genètica que es basen en fusionar gens amb vectors per després clonar-los en cèl·lules hoste. Biotecnologia: Manipulació d’organismes per obtenir productes útils. Molts dels reactius utilitzats a la tecnologia del DNA recombinant provenen dels microorganismes. A continuació destacarem alguns d’ells. ENZIMS DE RESTRICCIÓ Per la tecnologia del DNA recombinant ens interessen especialment uns enzims que reconeixen i tallen seqüències específiques d’una longitud de 4 – 8 pb, que són útils per obtenir clonació de gens. Per tant, diem que són nucleases que s’activen quan s’introdueix un DNA no propi. Cada enzim tallarà d’una forma específica. Hi ha 3 tipus d’enzims de restricció: I, II i III, i reben el nom del bacteri productor. Per exemple, EcoRI (Escherichia coli; soca R; enzim I). Veiem un parell d’exemples: Pregunta 12. Quines diferències veieu entre aquests dos exemples? A la primera EcoRI deixa dos llocs oberts que poden tallar (combinació plasmidis recombinants) o unir-se. Alu talla directament. El fragment és més curt i per tant, hi ha més possibilitats de trobar lloc. Un deixa extrems cohesiu i altre no  Microbiologia – 2020-21 CONSTRUCCIÓ I CLONACIÓ D’UN PLASMIDI RECOMBINANT Construcció i clonació d’un plasmidi recombinant S’utilitza un gen de resistència a antibiòtics per seleccionar la presència de plasmidi. Els vectors amb insert són reconeguts degut a que la inserció del DNA clonat interromp el gen lacZ. a) La micrografia electrònica mostra un plasmidi que ha estat tallat per un enzim de restricció i un fragment de DNA donant. b) La micrografia mostra un plasmidi recombinant. c) Després de la transformació es sembren les cèl·lules d’E. coli en un medi amb ampicil·lina i X – Gal. De forma que, només creixeran els transformants resistents a l’ampicil·lina. El X – Gal permet la visualització de colònies que han estat transformades amb el vector recombinant (vector + insert, colònies blanques). Amb EcoRI podem tallar un plasmidi i també DNA d’un bacteri per generar els inserts que puguin ser inclosos en els plasmidis vectors. Posteriorment, per transformació artificial podem incloure aquests plasmidis a les cèl·lules d’E. coli. Pregunta 13. Amb un plasmidi que només tingués un marcador de resistència a l’ampicil·lina, podríem saber si l’insert s’ha incorporat a la cèl·lula bacteriana? Un plasmidi Amb un marcadro unic el que pot pasar rs que tingue el imdert i si entra dins creixeria pero si es trenca sol tindria elel plasmidi, no podem estar segurs, necestiem dos marcadors de resistencia DETECCIÓ DE L’INCORPORACIÓ DE L’INSERT Existeixen diferents tècniques per detectar si l’insert s’ha incorporat a la cèl·lula bacteriana. Exemple: Podem utilitzar el plasmidi pUC19, que conté dos marcadors: AmpR i lacZ, i el medi X – Gal. Com pots veure a la imatge, el plasmidi té 2 marcadors, un gen de resistència a l’ampicil·lina i el gen lacZ que codifica l’enzim β – galactosidasa. Una vegada feta la transformació, en cèl·lules d’E. coli, en el medi X – Gal creixen 2 tipus de colònies: Blaves i blanques. Pregunta 14. Quines d’aquestes colònies contenen l’insert? Per què? N D’aquesta forma, podem obtenir genoteques amb èxit que incloguin diferents inserts que poden representar diversos gens d’interès. Pregunta 15. Què és una genoteca? N Pregunta 16. En aquest cas què emmagatzemaria aquesta genoteca? N  Microbiologia – 2020-21 TRANSCRIPTASA INVERSA No seria útil fer aquest tipus clonació (veure estructura i funció del gen bacterià) amb DNA d’una cèl·lula eucariota. Pregunta 17. Per quin motiu no seria útil fer-ho? Pregunta 18. Si ho féssim, quin tipus d’inserts obtindríem? Pregunta 19. Com serien les genoteques? Per resoldre aquest problema podem utilitzar la transcriptasa inversa que és un enzim típic del retrovirus. Serveix per transformar el seu genoma de RNA a DNA. Podem utilitzar el mRNA corresponent del gen que ens interessa i, com a reactiu previ, la transcriptasa inversa, per transformar-lo a cDNA (DNA complementari). Ara sí que podríem fer-ho. VECTORS DE CLONACIÓ Serveixen per clonar gens i cadascun d’aquest tipus de vectors pot incorporar un insert de diferent mida. VECTOR MIDA DE L’INSERT EXEMPLE CARACTERÍSTIQUES (1kb = 1.000 pb) Plasmidi 100 codons, possible ORF). 4. Troba seqüències Shine – Dalgarno. 5. Busca similituds al GenBank.