Biotecnologia Exame PDF

1 → Introdução conceptual Produtos produzidos a partir de matérias primas com a ajuda de organismos vivos. Área científica que se dedica ao desenvolvimento de produtos ou processos com utilidade em áreas como a saúde, alimentação, indústria ou ambiente tendo como base a utilização de organismos vivos ou de sistemas biológicos. Exemplos de aplicações da Biotecnologia: 1 – pão (leveduras modificadas) 2 – iogurte (Lactobactérias) 3 – cereais (milho transgénico) 4 – café (filtro branqueado com enzimas) 5 – leite com redução de lactose (enzimas) História da Biotecnologia: - No antigo Egito já se produziam vinho e cerveja, bem como alimentos fermentados, como queijo e iogurte. - Na América do Sul, onde hoje é o Peru, os seres humanos estão a otimizar as variedades de batata através da seleção e do cultivo, lançando assim as bases para o melhoramento de plantas. - 17' Microscópio por Antoni van Leeuwenhoek - 1976 Físico Edward Jenner administra a primeira vacina, ele observa a epidemia de varíola e nota uma conexão entre a variante do vírus que afeta os humanos e a inofensiva varíola bovina. O nome vacina, portanto, vem da palavra latina para vaca (vaca). Primeiro OMG - 1859 Charles Darwin desenvolve sua teoria da evolução, baseada em mutações e seleção natural. - 1864 Louis Pasteur inventa a pasteurização, na qual alimentos como o leite são aquecidos por um curto período de tempo para matar quaisquer micróbios que contenham e garantir uma vida útil mais longa. - 1865 Gregor Mendel é o primeiro a formular as regras para a herança de características genéticas. As Leis de Mendel ainda desempenham um papel no melhoramento de plantas e animais. - 1915 Foi registrada uma patente para o uso de enzimas em detergentes para a roupa, para quebrar as moléculas de gordura, proteína e amido nas manchas da roupa. - 1919 Karl Ereky usa o termo biotecnologia pela primeira vez em seu livro (eng. Biotecnologia da produção de carne, gordura e leite em grandes fazendas). O objetivo de sua publicação é usar a biotecnologia para melhorar a produção de alimentos nos “anos de fome” que se seguiram à Primeira Guerra Mundial. - 1928 Alexander Fleming descobre a penicilina, deixando inadvertidamente uma cultura bacteriana por aí. O primeiro antibiótico do mundo! A produção biotecnológica em massa de penicilina começa em 1942 e salva inúmeras vidas humanas durante os anos restantes da guerra e além. - 1953 James Watson e Francis Crick decodifica a estrutura do DNA - o primeiro passo para a engenharia genética. - 1973 Clonagem de DNA O trabalho de Stanley N. Cohen e Herbert W. Boyer sobre enzimas de restrição, que podem ser usadas para cortar o DNA em fragmentos, constitui a base da engenharia genética. - 1983 Kary Mullis desenvolve um método para amplificar (multiplicar) ADN. O método é denominado PCR. - 1996 A ovelha Dolly é clonada a partir de células da glândula mamária de uma ovelha viva. Dolly é uma “cópia” das outras ovelhas. - 2012 Jennifer A. Doudna e Emmanuelle Charpentier desenvolveram o método de edição do genoma CRISPR/Cas. Isto permite a adição ou remoção precisamente direcionada de um gene do DNA. - 2021 A pandemia de COVID viu o desenvolvimento de várias vacinas contra o coronavírus em todo o mundo, algumas das quais são novas vacinas de mRNA. BioTec Página 1 2 Insulina 1. Isolar o gene ( amplificar por PCR utilizando cDNA) 2. Clonar num vetor de clonagem 3. Transferir o gene para um vetor de expressão 4. Expressar o gene num organismo procariota 5. Purificar a proteína OMG - Detergente com enzimas (microrganismos) - Bioetanol (microrganismos) - Bioplásticos com ácido láctico - Óleo omgena-3 - Roupa (algodão OMG) - Plantas transgénicas- resistência a herbicidas, pragas e doenças - Aumento do valor nutricional- arroz dourado (acumulação de β caroteno no endosperma da semente- - expressão de 2 genes) - Produção de biomassa - Produção de proteínas com elevado valor funcional- Vaca geneticamente modificada para produzir leite - com lactoferrina e lisozima humanas (2 glicoproteínas com elevada atividade antimicrobiana) - Resistência a doenças- Resistência à tuberculose - Produção de alimentos com redução de alergénios Biotecnologia Azul Ramo da biotecnologia aplicada aos ambientes marinhos Explora a biodiversidade dos ecossistemas marinhos e sua potencial aplicação biotecnológica Inclui a utilização de organismos marinhos na obtenção de novos produtos processos com aplicações inovadoras medicina farmacêutica restauro dos ecossistemas etc Biotecnologia Vermelha Ramo da biotecnologia utilizado nas áreas da saúde farmacologia Considera o estudo desenvolvimento dos processos de terapia génica e produção de fármacos com recurso à tecnologia recombinante utilizando diferentes sistemas microrganismos plantas e animais Biotecnologia Branca Ramo da biotecnologia associado à produção industrial Considera a substituição de tecnologias poluentes por tecnologias limpas tirando partido da utilização de microorganismos e plantas São exemplos a produção de enzimas (ex detergentes) e plásticos biodegradáveis Biotecnologia Verde Ramo da biotecnologia aplicado à agricultura desenvolvimento do setor agrícola com a produção de culturas resistentes tolerantes a stresses bióticos abióticos etc e ambiente utilização de microorganismos e plantas para reduzir a poluição Considera a engenharia genética de plantas a seleção assistida por marcadores a cultura in vitro de tecidos vegetais a biorremediação e a produção de biofertilizantes e biodiesel BioTec Página 2 3 Biotecnologia Vermelha- Médica Desenvolvimento de terapias que utilizam células ou microrganismos, recorrendo a técnicas de engenharia Molecular. Desenvolvimento de organismos para a produção de produtos farmacêuticos proteínas terapêuticas (hormonas de crescimento, insulina, anticorpos) antibióticos vacinas Cuidados de saúde animal e humana: as ferramentas e técnicas da biotecnologia são usadas por exemplo: Prevenção (Vacinas), Diagnóstico, Tratamento de doenças. Genética humana: a biotecnologia tem sido utilizada por exemplo: Aconselhamento genético, Diagnóstico pré natal Terapia génica. Medicina forense: utilização em criminologia, por exemplo na identificação de criminosos. Medicamentos biológicos ou biofármacos Os medicamentos biológicos são medicamentos cuja substância ativa é produzida ou extraída de uma fonte biológica e incluem derivados do sangue e plasma, medicamentos biotecnológicos, vacinas e medicamentos de terapia avançada (terapia genética, terapia com células somáticas e engenharia de tecidos). Os medicamentos biológicos incluem proteínas, tais como as hormonas (hormonas de crescimento, insulinas, eritropoietinas), as enzimas produzidas naturalmente no organismo humano ou os anticorpos monoclonais, mas também por produtos derivados do sangue, medicamentos imunológicos, como os soros e as vacinas, alérgenos e produtos de tecnologia avançada, tais como os medicamentos de terapia genética e celular (também designados como “ biofarmacêuticos"). Estes medicamentos ajudam a tratar ou a prevenir numerosas doenças raras e graves, incluindo doenças como cancro, ataque cardíaco, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, diabetes, artrite reumatoide e doenças autoimunes. Em 2017, 7 dos 10 fármacos com maior número de vendas correspondiam a produtos de base tecnológica; Cerca de 40% dos mais de 6000 produtos em ensaios clínicos a nível mundial correspondem a biofármacos; Na Europa e Estados Unidos existem +300 biofármacos com licenças ativas As vendas de biofármacos aumentam a uma velocidade anual de 10%, estimando se que atinjam 300 biliões $US em 2021 , correspondendo a 1/3 das vendas totais de fármacos Em 2019, 11 dos 25 medicamentos mais vendidos eramanticorpos monoclonais BioTec Página 3 4 Biosimilares -de uma forma grosseira podemos dizer que são os equivalentes aos “medicamentos genéricos” Um medicamento biossimilar é um medicamento biológico similar a outro medicamento biológico que já tenha sido objeto de autorização de introdução no mercado, o “medicamento de referência”. Espera se que o medicamento biossimilar e o seu medicamento de referência tenham o mesmo perfil de segurança e de eficácia. Os medicamentos biossimilares são autorizados para todas as indicações terapêuticas do medicamento de referência, ou apenas para algumas indicações selecionadas, com base numa decisão caso a caso. O desenvolvimento e o processo de fabrico de medicamentos biossimilares são mais complexos e dispendiosos do que os dos medicamentos genéricos químicos (pequenas moléculas). Produção de biofármacos 1.Manipulação/modificação células/Multiplicação/Expansão das células 2.Upstream: Produção das células no bioreator 3.Upstream: Produção do API no bioareator de produção 4.Downstream: Separação e purificação do API 5.Dowstream: Preservação/armazenamento API Existem diferentes tipos de biofármacos, sendo que para cada tipo de biofármaco existem métodos de produção e purificação distintos. BioTec Página 4 5 Biofármacos: Anticorpos monoclonais Classes de Biofármacos: mAbs e Fc Proteins Os anticorpos monoclonais e proteínas de fusão têm sido usados essencialmente nos campos da oncologia e da patologia inflamatória grave , autoimune ou não. Este tipo de medicamentos podem ser servir como: competidor contra moléculas com ação indesejável, substituir moléculas deficitárias, servir como agonista, amplificando a ação de moléculas endógenas ou a ativação de células de interesse, inibir ou bloquear a ação de moléculas e células, ou mesmo eliminar moléculas e células deletérias, nomeadamente tumorais. Produção de mAbs Hibridoma 1. Animal é injetado com o antigénio purificado 2. Células produtoras de Anticorpos isoladas do baço 3. Cultura de Células Mieloma 4. Fusão das células para formar Hibridomas 5. Cultura de Células do Hibridoma produtoras de anticorpos 6. Clonagem das células do Hibridoma que produzem Anticorpos (após testar com o antigénio específico para o mAB em questão) 7. mAbs isolados Produção de proteínas recombinantes BioTec Página 5 6 Tipos de vetores para clonar DNA - Plasmídeos: são usados para clonar fragmentos de DNA com um tamanho médio de 4 kb. - Fagos: Usados para fragmentos de DNA com cerca de 20 kb. - Cosmídeos:Usados para fragmentos com cerca de 40 kb. - BACs:(“bacterial artificial chromosomes") Usados para fragmentos maiores até cerca de 350 kb. Estes vetores de grande capacidade, têm sido de extraordinário valor para proceder ao mapeamento do genoma. - YACs (yeast artificial chromosomes) Para fragmentos de DNA até 1,5 Mb. Evolução dos Biofármacos -> ácidos nucleicos - A produção de mRNA envolve a linearização do DNA plasmídico pDNA ), misturando o com enzimas e nucleótidos parapermitir a sua transcrição em mRNA, e o encapsulamento do mRNA, etc. Uma abordagem baseada em mRNA pode, teoricamente, produzir qualquer proteína/peptídeo através da máquina de síntese proteica processada na célula transfectada in vitro ou in vivo. Classes de Biofármacos: mRNA Vantagens: Eficiência de transfecção relativamente elevada e uma baixa toxicidade, uma vez que não necessitam de entrar no núcleo para serem funcionais. Não apresenta qualquer risco potencial de infeção acidental ou de mutagénese insercional oportunista. Vasto potencial para o tratamento de doenças que requerem a expressão de proteínas e uma maior eficácia terapêutica devido à sua tradução contínua em proteínas/peptídeos codificados, desencadeando uma expressão duradoura em comparação com os fármacos tradicionais à base de proteínas/peptídeos. BioTec Página 6 7 Novo desenvolvimentos em biotecnologia (biofármacos) usando solventes alternativos (líquidos iónicos) mABs -> anticorpos monoclonais Dificuldades associadas à produção de mABs ou as “dores da indústria”: * Produção: Produção em bioreactor já está bastante otimizada, existem algumas limitações que impedem rendimentos mais elevados, como p. ex. a formação de agregados * Purificação: Complexa, com muitos passos; Custos muito elevados associados essencialmente ao processo de captura que é realizado com ligados biológicos (proteína A); A cromatografia de afinidade com ProA é responsável por quase 60/80% dos custos! Como tornar a produção de mABs mais eficiente? Líquidos Iónicos = "Designer Solvents" = "Green Solvents" Temperatura de fusão 100 ºC Larga gama de temperaturas às quais os ILs são líquidos Pressão de vapor desprezável Não inflamáveis Elevada estabilidade térmica e química Elevada condutividade iónica Possibilidade de 10^6 combinações de iões Possibilidade de recuperação remoção e reciclagem Bons solventes para uma larga gama de compostos nomeadamente orgânicos inorgânicos e poliméricos ILs- “green solvents" Colina -> nutriente que faz parte da dieta humana, precursor da Acetilcolina, baixa toxicidade. “Green Solvents" ILs – Química verde O termo “green chemistry” foi usado pela primeira vez em 1991 por Paul T. Anastas num programa especial lançado pela EPA, a Agência de Protecção Ambiental dos USA. Baseia-se no desenvolvimento e implementação de produtos químicos e processos para reduzir ou eliminar o uso ou produção de substâncias nocivas à saúde humana e ao meio ambiente. A química verde pode ser encarada como a associação do desenvolvimento da química em busca da auto- sustentabilidade. BioTec Página 7 8 Ils Perspetiva Histórica 1914- Paul Walden quando estudava substitutos para a nitroglicerina sintetizou o primeiro líquido iónico, nitrato de etilamónio por neutralização de etilamina com ácido nítrico concentrado [EtNH3 ][NO 3 temperatura de fusão 13/14 ºC 1934- registo da patente americana 1 943 176 onde se mostrou que sais compostos por halogéneos e bases nitrogenadas (como o cloreto de 1 benzilpiridínio e cloreto de etilpiridínio conseguiam dissolver celulose a temperaturas pouco acima dos 100 ºC. Estas soluções apresentavam viscosidade variável e permitiam diversas reacções químicas em solução, tais como esterificação, e a obtenção da celulose substituída por adição de anti solventes apropriados. 1948- foi descrita a aplicação de misturas de AlCl 3 e brometo de etilpiridínio na electrodeposição de alumínio por Hurley and Wier 1975- 1975/1978-foi estudado o diagrama de fases de misturas de AlCl 3 e brometo de butilpiridínio pelo grupo de investigação de Osteryoung 1976- foi proposto o diagrama de fases de misturas de AlCl 3 e cloreto de 1 etil 3 metil imidazólio 1992- foi preparada e caracterizada uma nova geração de líquidos iónicos com o catião 1etil3 metilimidazólio e novos aniões. A publicação foi feita por Wilkes e Zawarotko com o título "Air and water stable 1 ethyl 3 methylimidazolium based ionic liquids" A partir de 1992 foram preparados mais líquidos iónicos contendo o catião imidazólio e outros aniões 1999- Surgem os primeiros líquidos iónicos comerciais Desde então existiu um interesse elevado nestes últimos líquidos iónicos devido à sua estabilidade em água e principalmente devido à sua ampla “ eletroquímica" 1. geração Líquidos iónicos formados por misturas de cloretos de piridínio ou imidazólio com AlCl 3 2. geração Líquidos iónicos mais estáveis na presença de humidade e oxigénio com o catião imidazólio e os aniões 3. geração "Task specific ionic liquids" com aniões tão diversos e com catiões imidazólios, piridínios, piperidínios e com catiões e/ou aniões com grupos funcionalizados. No fundo, trata-se da síntese de novos ILs visando já uma determinada aplicação. Geração actual: "Task specific ionic liquids ” sintetizados a partir de fontes renováveis, de materiais de partida de baixo custo , e com baixa toxicidade" BioTec Página 8 9 Aplicações dos Líquidos Iónicos Existem muitos trabalhos relativos à utilização de ILs em separação e proteínas (incluindo biofármacos) - A maioria diz respeito a sistemas aquosos bifásicos - Aqueous Biphasic Systems (ABSs) ▪ ABS formam-se quando dois compostos hidrossolúveis são misturados com água. ▪ A partir de determinada concentração, ocorre uma separação espontânea das fases. ▪ A separação das biomoléculas ocorre de acordo com a sua partição entre as duas fases aquosas ILS hidrofílicos podem ser formamos ABS após a adição de agentes indutores de “salting-out”: ✓ Sais orgânicos/inorgânicos ✓Aminoácidos ✓Carboidratos ✓Polímeros BioTec Página 9 10 Purificação do antigénio específico da próstata (PSA) biomarcador do cancro da próstata Apesar de não ser um biofármaco, vamos abordar a utilização destes sistemas para a purificação da PSA. Criação de um ABS com ILs biocompatíveis (porque a PSA é uma proteína!) Não é necessário adicionar água ao sistema (temos a urina). Pré-tratamento de amostras de urina humana, que contempla a extração, concentração e purificação simultâneas do antigénio específico da próstata (PSA), um biomarcador do cancro da próstata. Nesta tecnologia são utilizados sistemas aquosos bifásicos constituídos por líquidos iónicos e sais, que permitem a extração seletiva do PSA e obtenção de elevados fatores de concentração, possibilitando assim que a sua quantificação seja realizada em equipamentos de rotina, menos sofisticados, menos dispendiosos e, consequentemente, mais acessíveis. Aplicações: Terapia IgG Purificação IgG- soro de rato 1. Avaliação inicial com ILs e IgG puro. 2. Os melhores sistemas foram usados com soro de coelho 3. Separação das fases 4. Identificação e quantificação das proteínas presentes em cada fase por SE HPLC e SDS PAGE IgG migra preferencialmente para a fase rica em IL e não para a fase rica em polímero, como acontece normalmente com ABS convencionais baseados em polímeros. ✓ IgG eficiência de extração (EE) = 100%; IgG recuperação = 85%. ✓ Aumento de 58% na pureza do IgG. ✓ Partição da albumina e dos agregados de proteína para a fase rica em PPG. ✓ Estabilidade e integridade estrutural do IgG avaliada por SE-HPLC, FTIR, e SDS-PAGE. Purificação de IgG a partir de culturas celulares Purificação de anti IL8 mAb a partir de sobrenadantes celulares de células CHO (linha celular ovário do hamster chinês). ABS e sistemas trifásicos (TPP) formados ILs análogos da glicina betaína e sais de potássio a pH neutro. TTP: sistemas trifásicos BioTec Página 10 11 IgG- IFN- interferões Processo para produção de Interferões Princípios da Captura/purificação com ATPS: O IFN migra para a fase de topo, e as impurezas para o fase de fundo. É possível usando a regra da alavanca concentrar o IFN na fase de topo. Purificação e concentração do IFN num único passo. Utilização de ILs como adjuvantes nos ATPS pode ser til na purificação de IFNα 2b ( Escherichia coli) Desenvolvidos sistemas aquosos bifásicos constituídos por dois polímeros (PPG e PEG) aos quais foram adicionados ILs como adjuvantes. O IFNα 2b recuperado a partir da fase de fundo (rica em PEG) é imunologicamente ativo e a sua estrutura secundária encontra se preservada. BioTec Página 11 12 Aplicações: Purificação de ácidos nucleicos - Utilização de ILs em processos de separação de ácidos nucleicos Existem ainda poucos trabalhos relativos à utilização de ILs em separação de ácidos nucleicos (DNA e RNA). A maioria diz respeito a sistemas extrações líquido/líquido, seguido de extrações com matrizes sólidas. (Dados de 2016) - Líquidos iónicos como ligados em suportes cromatográficos - Líquidos iónicos suportados (SILs) - Purificação de ácidos nucleicos Uma matriz macroporosa foi funcionalizada com líquidos iónicos (IL) que atuam como ligantes cromatográficos. Foi possível purificar ácidos nucleicos (diferentes classes) numa só etapa usando estas novas matrizes funcionalizadas com ILs O IL atua como um ligante multimodal e exibe uma notável capacidade de ligação. O suporte pode ser regenerado e reutilizado sem comprometer seu desempenho de separação. BioTec Página 12 14 Métodos em Proteómica - Separação e purificação de proteínas Em 1994, Marc R. Wilkins definiu o conceito de Proteoma pela primeira vez Conjunto de proteínas expressas por um genoma, célula ou tecido em um determinado momento e sob determinadas condições fisiológicas (ou patológicas) Ciência que estuda sistematicamente um proteoma, permitindo avaliações quantitativas e qualitativas de proteínas que atuam no metabolismo celular. ▪ Extração de proteínas (Isolamento inicial das proteínas totais do material de origem) As proteínas podem ser isoladas de qualquer amostra biológica, como bactérias, leveduras, tecidos e/ou fluídos de origem animal ou vegetal. Diferente metodologia para amostras de origem animal ou vegetal. Etapa fundamental para a análise do perfil proteico: Lise celular- Disrupção dos tecidos para libertar as proteínas presentes no interior das células - Rotura da membrana plasmática ○ Disrupção dos tecidos através da maceração com azoto líquido ○ Uma vez libertado o conteúdo celular para a solução de extração, o homogenato deve ser centrifugado de modo a serem separados células ainda intactas e restos celulares insolúveis das proteínas solúveis que ficam no sobrenadante - Diferentes protocolos de extração consoante o objetivo do estudo - Tampão de lise/extração- rico em detergentes para romper a camada lipídica da membrana plasmática (compatíveis com a análise por espetrometria de massa); rico em agentes redutores para evitar a perda de atividade biológica; manter pH estável. A composição do tampão de extração determina a presença de proteínas no sobrenadante ou precipitado. - Várias etapas de centrifugação para eliminação de interferentes - Realizado a baixas temperaturas (4 ºC) para prevenir a degradação de proteínas.Nos fluídos biológicos as proteínas já se encontram suspensas em solução, não sendo necessário realizar extração;.Análise direta das proteínas totais (exemplo urina ou saliva) ou separação dos diferentes componentes do fluido biológico e posterior análise das Proteínas (exemplo sangue)-; -Centrifugação para eliminar substâncias interferentes (depende do fluído biológico em estudo) Eliminação de interferentes (compostos fenólicos, lípidos, enzimas proteolíticas, etc.) Inibição de protéases Depende do tipo de amostra Processo de otimização Extração de proteínas tampão de extração BioTec Página 13 15 ▪ Quantificação de proteínas Após a extração, as proteínas totais presentes na amostra devem ser quantificadas, ou seja, deve ser determinada a concentração proteica total da amostra (µg/ mL) Muito importante para comparar diferentes métodos de extração e calcular o rendimento da extração A escolha do método a utilizar depende dos seguintes critérios: quantidade de proteína disponível, a concentração da proteína, a presença de reagentes que poderão interferir com o ensaio A determinação da concentração proteica num extrato proteico é, normalmente, realizada por métodos colorimétricos (A intensidade da cor depende da quantidade de resíduos de aminoácidos presentes nas proteínas, quanto maior a concentração proteica da amostra, mais intensa é a cor). Método de Bradford - Utiliza o corante Coomassie Brilliant Blue que complexa com as proteínas originando um máximo de absorção a 595 nm. - Na mesma placa, juntamente com as amostras, utilizar uma curva padrão de uma proteína com concentrações conhecidas (albumina de soro bovino, BSA) - Reta de calibração com os valores da proteína padrão - A determinação da concentração proteica é feita por interpolação, a partir da equação da reta obtida com a proteína padrão BioTec Página 14 16 ▪ Separação de proteínas e/ou Purificação de proteínas As proteínas são separadas com base nas suas propriedades físico químicas e biológicas tamanho, carga, hidrofobicidade, afinidade por ligandos localização celular. Técnica de separação baseada na migração das moléculas carregadas, numa solução, em função da aplicação de um campo elétrico. Eletroforese uni dimensional (SDS PAGE) Eletroforese bi dimensional (2 DE) Eletroforese Capilar (CE) ○ Eletroforese uni dimensional (SDS PAGE) Proteínas separadas em gel de acordo com a sua Massa Molecular 1. Preparação da amostra- Desnaturação de proteínas (convertidas na sua estrutura mais linear) Proteínas carregadas negativamente Tampão de amostra (SDS Sodium dodecyl sulfate) - Confere carga negativa às proteínas de modo que sejam separadas apenas pela sua massa molecular (sem a interferência da carga) 2. Preparação dos géis- Proteínas separadas em gel de acordo com a sua Massa Molecular 3. Coloração dos géis- Coomassie Brilliant Blue R250 G250 Nitrato de prata 4. Digitalização dos géis 5. Análise com software apropriado A técnica de eletroforese unidimensional é o principal método de acompanhamento do processo de purificação e avaliação do grau de pureza. Esta técnica não é utilizada para purificar proteínas porque afeta a sua estrutura e função (desnaturação da proteína). BioTec Página 15 13 Aplicações: Purificação de ácidos nucleicos SILs Performance do novo material para sRNA de E. coli Gradiente sequencial- Interações eletrostáticas: A) Aumento da concentração de NaCl de 0 para 1 M (linha vermelha) IL funciona como ligando multimodal; Alta seletividade com elevada capacidade de design. Gradiente sequencial- Interações hidrofóbicas: B) Diminuição da concentração de (NH4)2 SO4 de 2 para 0 M (cor de laranja). 2º passo de eluição através de um aumento da [NaCl] até 1 M (linha vermelha). Performance do material para separar ácidos nucleicos de ligados bacterianos - Eluição realizada a uma velocidade de 1 mL /min usando uma concentração crescente de um gradiente de NaCl (em 10 mM Tris HCl , pH 8) num modo sequencial tal como ilustrado pela linha a tracejado. - Gel de agarose obtido após eletroforese das diferentes frações recuperadas do ensaio cromatográfico. S: amostra do lisado bacteriano inicial. 1, 2 e 3: Picos cromatográficos 1, 2 e 3. Ensaios de reprodutibilidade e regeneração do material - Elevada seletividade devido à estrutura funcional diversa dos Ils - Ligados low-cost e estáveis quimicamente e termicamente devido à ligação covalente. Facilmente regeneráveis, mantendo a performance de separação. BioTec Página 16 17 - Identificação de proteínas ○ Eletroforese bi-dimensional (2-DE) O 'Farrel e Klose (1975) Proteínas separadas de acordo com o ponto isoelétrico (pI) e a sua massa molecular Produz um mapa de proteínas que reflete alterações nos níveis de expressão, presença de isoformas e de modificações pós traducionais Muito útil no estudo de misturas complexas de proteínas- Elevada capacidade de separação 1. Preparação Amostra- Para a focagem isoelétrica, as proteínas devem ser completamente solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e reduzidas. Remoção de sais e outras substâncias interferentes: Interferem no processo eletroforético. Remoção por precipitação. Solubilização- Mistura da amostra com um tampão de solubilização 2. Focagem Isoelétrica (IEF) - Migração das moléculas num gel que contem um gradiente de pH As proteínas carregadas vão deslocar se ao longo do gradiente de pH até atingirem a zona onde a sua carga global é nula, ou seja, o seu ponto isoelétrico pI) 3. Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida- Separação das proteínas em gel de poliacrilamida de acordo com a massa molecular Equilíbrio das tiras de gel (strips): ◊ Redução e desnaturação de proteínas ◊ Proteínas carregadas negativamente ◊ Tampão de equilíbrio (SDS) 4. Coloração dos géis 5. Digitalização dos géis 6. Análise - Quantificar e comparar a intensidade relativa e cada proteína BioTec Página 17 18 - Identificação de proteínas ○ Cromatografia Líquida (LC MS) - Cromatograma Gel-free Proteomics A cromatografia líquida separa misturas de proteínas de acordo com a sua velocidade de movimento entre duas fases: fase estacionária sólida (coluna) e fase móvel líquida (LC). A proteína constituinte da amostra é detetada pela variação produzida num detetor que se traduz graficamente num pico. - Adequada para a análise de misturas complexas de proteínas e para análise de proteínas pouco abundantes - LC-MS/MS - Cromatografia Líquida acoplada a Espetrometria de Massa - Na técnica LC-MS/MS, os péptidos trípticos são separados por cromatografia liquida de fase reversa (RP-LC) e, à medida que são eluídos, são ionizados e depois analisados por espectrometria de massa (MS) Cromatografia Líquida- Técnica de separação na qual os componentes de uma mistura migram entre duas fases (fase móvel e fase estacionária). RP-LC-MS/MS Compostos apolares dissolvidos na fase móvel são atraídos para a fase estacionária apolar e os compostos polares são eluídos com o solvente. O tipo de cromatografia a utilizar num método de separação é determinado pelas características físico químicas e/ou biológicas da proteína a separar e purificar. ○ Técnicas cromatográficas ▪ Cromatografia de troca iónica Separa as proteínas com base nas suas características de carga. A fase estacionária consiste numa matriz sólida à qual se encontram ligados químicos carregados positiva ou negativamente. As proteínas da amostra que não possuam carga ou de carga igual à carga da matriz, não são adsorvidas e são arrastadas com o tampão de lavagem da coluna. BioTec Página 18 19 ○ Técnicas cromatográficas ▪ Cromatografia de exclusão molecular - Separa as proteínas com base no seu tamanho - A fase estacionária consiste numa matriz com poros de diferentes dimensões - As proteínas mais pequenas demoram mais tempo a serem eluídas da coluna, entram em todos os poros proteínas de tamanho intermédio entram em alguns poros e as de grandes dimensões são excluídas de todos os poros e são as primeiras a sair da coluna - A matriz a utilizar depende do tamanho da proteína que pretendemos purificar - Esta técnica permite separar proteínas apenas com 10 kDa de diferença ▪ Cromatografia de interação hidrofóbica - Separa as proteínas com base na sua hidrofobicidade - A fase estacionária consiste numa matriz com uma resina que possui grupos hidrofóbicos - A fase móvel consiste numa solução aquosa com concentrações variáveis de sal - a presença do sal no tampão ajuda a expor as regiões hidrofóbicas das proteínas. Proteínas com maior hidrofobicidade terão regiões hidrofóbicas mais expostas, exigindo menos sal para ligação - As interações hidrofóbicas entre as proteínas e a fase estacionária hidrofóbica ocorrem durante o processo de cromatografia. Proteínas com maior hidrofobicidade interagem mais firmemente com a fase estacionária e, portanto, são mantidas por mais tempo, enquanto proteínas com menor hidrofobicidade passam mais rapidamente - Uma das vantagens é sua capacidade de purificar proteínas mantendo a atividade biológica das mesmas ▪ Cromatografia de afinidade Técnica mais utilizada na purificação de proteínas recombinantes - É a mais seletiva de todos os tipos de cromatografia - Baseada na capacidade de interação entre uma proteína e o seu ligando - O ligando da proteína de interesse é imobilizado na coluna - A proteína a isolar é eluída da coluna com um tampão contendo uma concentração elevada de ligando livre, ou uma força iónica elevada ou um pH diferente - Quando não se conhece o ligando da proteína de interesse, através de técnicas que envolvem manipulação de genes é possível a adição de um epítopo específico no início ou fim da proteína --> Anticorpos que reconhecem especificamente o epítopo são imobilizados na coluna e a proteína marcada liga se ao anticorpo. Purificação de proteínas recombinantes expressas em E. coli O exemplo da insulina ----------------->> l Dímero formado pelas cadeias A (21 aa) e B (30 aa), ligadas por pontes dissulfureto entre resíduos de cisteína. Purificação: -Lise celular por homogeneização -Cromatografia de afinidade BioTec Página 19 20 Purificação de proteínas Estudos e aplicações biotecnológicas das proteínas --> Amostras puras (Combinação de técnicas que exploram as propriedades da proteína alvo de modo a isolá- la das restantes proteínas) A purificação de uma proteína pode ser feita por uma série de etapas e técnicas diferentes --> Dependem das propriedades da proteína alvo Fatores a considerar na estratégia de purificação: Objetivo para a pureza Quantidade e rendimento Custo Tempo Manutenção da estrutura e/ ou atividade biológica da proteína ○ Técnicas imunoquímicas --> Western blot Protocol Técnica realizada pela primeira vez em 1979 por Harry Towbin e Neal Burnette Deteção e validação de proteínas de interesse numa amostra Técnica muito utilizada para garantir a eficiência da tecnologia do DNA recombinante Ligação antigénio anticorpo 1. Separação proteínas em gel (SDS PAGE) 2. Transferência para a membrana - As proteínas separadas em gel, são transferidas para uma tampão de transferência e aplicação de campo elétrico) 3. Bloqueio - Bloqueio (saturação) da membrana com proteína conhecida para evitar a ligação do anticorpo à membrana (ligações inespecíficas) 4. Incubação anticorpo primário (específico para a proteína que queremos detetar) 5. Incubação anticorpo secundário 6. Deteção e análise -Incubar a membrana com o substrato da enzima -Reação enzima substrato -Emissão de fluorescência Purificação de anticorpos - A aplicabilidade do anticorpo influencia o grau de pureza do mesmo, o que determina a estratégia de purificação - O processo de purificação do anticorpo, normalmente é constituído por múltiplas etapas cromatográficas até obter o grau de pureza exigido - O tipo de coluna cromatográfica a utilizar, os parâmetros da coluna, o produto e as impurezas que introduzimos na mesma, bem como a composição do tampão, influenciam e determinam o processo de purificação - O processo de purificação deve ser concebido de forma a assegurar, que todas as impurezas introduzidas durante o processo são eliminadas, de modo a atingir os níveis de pureza e segurança desejados no produto final - Os métodos cromatográficos mais utilizados para a purificação de anticorpos são a cromatografia de afinidade, a cromatografia de troca iónica, a cromatografia de interação hidrofóbica e a cromatografia de exclusão molecular BioTec Página 20 21 Identificação de proteínas - Proteína interesse ou proteoma total - Digestão de proteínas (As proteínas vão ser digeridas, ou seja, as suas ligações vão ser quebradas dando origem a péptidos) Digestão em gel --> Excisão dos spots ou bandas do gel Digestão das proteínas no gel através de uma enzima protéase (tripsina) Digestão líquida --> Digestão das proteínas em solução através de uma enzima protéase p e tripsina Método mais rápido e direto - Identificação das proteínas (Espetrometria de massa (MS)) Técnica que permite a identificação, quantificação e caracterização molecular de amostras com base na sua composição elementar. Técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/péptidos e a sua sequência de aminoácidos. Espetrómetro de massa As moléculas são convertidas em iões de fase gasosa, os quais são separados no espetrómetro de massa de acordo com a sua razão massa/carga (m/z). - Espetrometria de Massa (MS) Componentes de um Espetrómetro de massa - Compartimento de entrada da amostra - Fonte iões - As moléculas da amostra são vaporizadas e convertidas em iões de fase gasosa - Analisador de massa - Separa os iões da amostra com base na relação m/z - Detetor - Mede a abundância relativa dos iões separados pela massa - Sistema de dados - Registo, processamento, armazenamento e exibição dos dados A passagem da amostra no espetrómetro de massa permite obter um espetro de massas Registo dos valores da razão m/z e abundância de todos os iões que alcançam o detetor l Massa molecular de cada fragmento da proteína/péptidos A massa molecular de cada fragmento, determinada com ESI-MS ou MALDI-MS, é comparado com os valores de massa dos fragmentos peptídicos teóricos de cada proteína numa base de dados. Softwares : MASCOT - compara os dados obtidos com os existentes nas bases de dados de proteínas e nucleótidos SWISS-PROT - exemplos de bases de dados BioTec Página 21 22 - Identificação e isolamento de um gene de interesse Interesse no isolamento de um gene em biotecnologia - obtenção de proteínas recombinantes - produção de metabolitos - obtenção de organismos geneticamente modificados para introdução de uma característica de interesse (introdução de resistência/tolerância a stresses ambientais, características nutricionais, - desenvolvimento de marcadores moleculares (ex. auxiliar programas de melhoramento; identificação de populações; discriminação varietal Gene- Genoma # Gene - segmento de DNA que codifica a informação transmitida de geração em geração (herdada) unidade fundamental, física e funcional da hereditariedade # Genoma completo em eucariotas - informação genética (DNA) armazenada no núcleo das células e em alguns organelos - mitocôndrias e cloroplastos (herança materna) # O DNA nuclear (informação genética) é uma dupla sequência linear de nucleótidos # As duas cadeias apresentam orientação antiparalela na estrutura de dupla cadeia 5 ´ grupo fosfato, 3 grupo OH) # As bases azotadas (A,T,C, G) localizam se para o interior das cadeias # A cadeia simples é estabelecida por ligações fofodiester (extremidade 3´ hidroxilo do nucleótido recetor e 5 ´ fosfato) # As ligações que permitem manter a estrutura de dupla hélice ligações de hidrogénio são ligações que se estabelecem tendo por princípio a complementaridade entre bases (A::T, C:::G) # As ligações C:::G são mais fortes que as A::T # Organismos procariotas # Organismos eucariotas ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Conteúdo de informação genética ao nível no núcleo é extremamente variável. O C value corresponde à quantidade de DNA contida num núcleo haploide (gâmeta), ou metade da quantidade de DNA de uma célula somática diploide num organismo eucariota (independentemente do nível de ploidia do taxa). BioTec Página 22 23 Gene- Genoma # Verifica se a inexistência de uma correlação entre a complexidade dos organismos e o tamanho do genoma Organismos mais complexos --> Genomas maiores # A complexidade de um genoma eucariota está relacionado com o conteúdo de DNA nuclear. # Espécies filogeneticamente muito próximas que diferem bastante em termos de tamanho do genoma: Arroz: 430 Mb Milho: 3000 Mb Mesmo número de genes funcionais (40.000 - 50.000) # Organização do genoma humano ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1. Deve conter informações complexas a) deve ser capaz de armazenar grandes quantidades de informação (características e funções de um organismo) b) a informação deve ter a capacidade de variar (espécies diferentes) c) o material genético deve ser estável (mutações nocivas) 2. Deve ser replicado fielmente a) o material genético deve ter a capacidade de ser copiado com precisão Fusão dos gâmetas (célula única) --> ser multicelular complexo (requer bilhões de divisões celulares) 3. Deve codificar o fenótipo a) a informação contida no material genético (o genótipo) deve ter a capacidade de “codificar" (determinar) as características (o fenótipo) GENÓTIPO vs FENÓTIPO A relação direta entre genótipo (identificação do gene(s)) e o seu papel num processo biológico (característica fenotípica) é de extremo interesse para a aplicação em biotecnologia. b) o produto de um gene é frequentemente uma proteína, por isso deverá haver um mecanismo para as instruções genéticas serem traduzidas numa proteína “Dogma central " da Biologia, segundo o qual a informação genética presente no DNA flui obrigatoriamente desde o DNA até ao RNA pela transcrição, e deste para a proteína (e para o fenótipo) através da tradução. BioTec Página 23 24 Fluxo de informação genética - genótipo versus fenótipo Um gene alelo (presente em cromossomas homólogos), localizado no mesmo locus possui informação (codifica) para a mesma característica mas pode NÃO possuir a mesma informação (diferença entre alelos A e a) Variabilidade fenotípica - componente “ambiente” A PLASTICIDADE FENOTÍPICA é a habilidade de único genótipo expressar diferentes fenótipos - formas alternativas de morfologia, estado fisiológico ou comportamental - em relação às características variáveis do ambiente Como a plasticidade fenotípica está intimamente ligada à capacidade de adaptação de um organismo perante constrangimentos ambientais impostos durante o seu desenvolvimento, temos que diferentes genótipos podem convergir em fenótipos similares originando fenocópias. Variabilidade fenotípica pode estar associada a variabilidade genética mas, por outro lado, pode ser resultado de eventos associados à regulação da expressão, incluindo eventos de epigenética. Identificação e isolamento de um gene de interesse 1. Estratégia target gene a) Gene conhecido na espécie b) Gene desconhecido na espécie mas conhecido noutras espécies filogenética/ próximas Está associada com: polimorfismo, variação alélica, diversidade de genes, caracterização de genes 1. Gene conhecido na espécie a. Isolar de um organismo ou de um número pequeno (Introdução de resistência ao fungo Botrytis cinerea em videira implica o desenho de primers específicos e isolamento do gene completo) BioTec Página 24 25 Identificação e isolamento de um gene de interesse 1. Estratégia target gene Devemos sempre ter em conta que a expressão de um gene e a funcionalidade da proteína (enzima) correspondente depende de múltiplos factores. São exemplos os eventos associados à regulação da expressão ou à presença de variabilidade: - Epigenética (na seq. do próprio gene - ex. metilação do DNA, transposões) - Polimorfismos funcionais (na seq. do próprio gene - ex. SNPs e/ou InDels - Epigenética (codificado noutra região do genoma - miRNAs, regulação pós transcrição) Desenho de primers específicos: software prime3plus Amplificação da sequência: Para isolamento do gene recorre se à técnica de PCR end point Reação de Polimerização em Cadeia (Polymerase Chain Reaction) Amplificação exponencial de uma sequência específica de DNA, determinada pelo emparelhamento dos primers Clonagem em vetor de clonagem (TA) Como revelar a sequência do fragmento amplificado? # Sequenciação SANGER # estabelecido em 1977 por Frederick Sanger # método conhecido por utilizar desoxiribonucleósidos trifosfato ( dNTPs ) terminadores, ou seja os dideoxiribonucleosidos trifosfato ddNTPs (extremidade 3' sem OH). # utilizado para sequenciar genes/famílias de genes; # foi utilizado nos últimos 40 anos para sequenciação de genomas e transcritomas Confirmação por análise Blast (NCBI) ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Introdução de resistência ao Olho de Pavão Spilocaea oleagina em oliveira 2. Gene desconhecido na espécie 1. Passo: Pesquisar referências bibliográficas que nos conduzam a um gene de interesse, em particular relacionado com a resposta das plantas ao ataque por este fungo 2. Passo: Procurar nas bases disponíveis (NCBI, PLAZA, Phytozome, etc ), sequências de cDNA (complementar ao mRNA ) preferencialmente completas (ORF completa) do gene selecionado. Um dos critérios a considerar será a proximidade filogenética. BioTec Página 25 26 Identificação e isolamento de um gene de interesse 1. Estratégia target gene (seleção de um gene conhecido ou não) Alinhamento das sequências Procurar uma região menos degenerada a: 5’ : mais próxima do codão ATG: desenho primer - Forward 3’ : mais próxima da cauda poly (A): desenho primer - Reverse Desenho de primers degenerados BioTec Página 26 27 2. Estratégia Ómicas (grupo de genes não conhecidos- transcritos associados a biossínteses diferentes) (omics approach ) - whole transcriptome /proteome and metabolome a. Transcriptómica (RNAseq) Exemplo Prático: Genes envolvidos na eficiência do enraizamento adventício Sequenciação do mRNA - Identificação de Genes Diferencialmente Expressos (DEGs) - Up/Down regulated genes --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Limitação em termos Validação funcional de reagentes e da #Estudos de expressão génica (RT qPCR) -real time atividade da enzima, PCR Quantitativo transcriptase reversa devido à quantidade de ciclos de desnaturação #Estudos de expressão proteica e atividade enzimática O objetivo deste estudo foi realizar uma avaliação mais detalhada ção das características do Sarcoma como células e para elucidar o papel do expressão aumentada de MMP 14 expressão no crescimento e morte dessas células # Silenciamento e/ou Expressão BioTec Página 27 28 Procedimento para obtenção de uma planta geneticamente modificada Etapa 1. Cassete de expressão (identificação) Identificar o gene/organismo de interesse; extrair DNA/RNA; isolar o gene por PCR; clonar a sequência num vetor de clonagem (tecnologia do DNA recombinante); confirmação por sequenciação (SANGER); transferência para um vetor de expressão (promotor, terminador, gene de seleção). Etapa 2. Transformação genética Transferência da cassete de expressão para as células vegetais para a integração no genoma (Agrobacterium tumefaciens, biolística etc.) definir sistema de seleção/rastreio (selectable/screenable markers) definir promotor Etapa 3. Seleção dos OGMs Recurso aos marcadores de seleção (seleção é exercida ao nível celular apenas as células que integram o SMG irão regenerar uma planta) Etapa 4. Regeneração dos OGMs Regeneração seguindo um protocolo previamente estabelecido in vitro que garanta a regeneração a partir de uma célula única 1 4 3 2 BioTec Página 28 29 Marcadores de rastreio - genes reporter Uma vez que a taxa de células que integram o gene/ transgene é muito baixa, a utilização de um marcador permite facilitar a seleção/rastreio. Genes reporter --> provocam alterações visualmente detetáveis nas células/tecidos transformados. permitem a deteção das células que integraram o transgene expressando o de forma estável A expressão pode ser quantificada --> otimização de protocolos de transformação GUS (β glucoronidase) - Codifica uma proteína que ao metabolizar o X gluc produz um composto insolúvel de cor azul. - Inicialmente isolada da bactéria Escherichia coli. - A sua utilização como marcador teve início na década de 80 quando foi desenvolvida a técnica de fusão de promotores com o GUS. - A fusão de promotores permite estudar como/onde ocorre a expressão de genes de interesse sendo a atividade da enzima GUS utilizada como indicador. Fusão: - Associados ao gene de interesse sem interrupção (terminador/promotor) - Permite confirmar se os genes estão a ser devidamente transcritos, traduzidos e a funcionalidade não está comprometida Vantagens - Não requer análise de DNA ( extração, PCR, …) Desvantagens - Destrutivo (sem aplicação na seleção) - Ensaios laboratoriais simples - Requer um tampão para incubar o material vegetal - Pode ser utilizado como metodologia de screening - Experimental/ fácil e realizar e fácil de interpretar - Permite obter resultados quantitativos Green Fluorescent protein - GFP - Proteínas que emite fluorescência verde sob luz azul a UV - Identificada em organismos do grupos dos cnidários- medusas - Foi isolada e caracterizada pela primeira vez na década de 60 Vantagens Desvantagens - Não requer análise de DNA (extração, PCR,…) - Necessário equipamento especializado - Baixo custo e ensaios laboratoriais simples (microscópico com fluorescência) - Pode ser utilizado como metodologia de screening e seleção (otimização de condições) - Permite obter resultados quantitativos - Não destrutivo Ex. - Geração eficiente de gado transgênico utilizando o DNA transposon e sua análise por sequenciamento de próxima geração - Geração de linhas repórteres fluorescentes de camundongos transgênicos para estudar o desenvolvimento Hematopoiético. - Engenharia da proteína fluorescente verde para maior brilho, comprimentos de onda mais longos e transferência de energia de ressonância de fluorescência. - Red fluorescent protein DsRED )- Ideal para trabalhos em material vegetal por evitar o problema de autofluorescência da clorofila. Permite combinação com gfp BioTec Página 29 30 Marcadores de seleção Uma vez que a taxa de células que integram o gene/ transgene é muito baixa, a utilização de um marcador permite facilitar a seleção/rastreio. Genes de seleção (SMG selectable marker gene) uma vez integrados e expressos permitem exercer a pressão seletiva no sentido de selecionar as células que integraram o SMG e regenerar plantas apenas a partir dessas células (suportam a pressão seletiva de forma eficiente). A expressão permite selecionar células que integraram a cassete de expressão de células que não integraram Sistema de seleção - classificado tendo em conta o modo de ação do gene inserido. Positivo - se promoverem o crescimento dos tecidos transformados e regeneração de plantas a partir desses ○ Condicional - se o gene codificar uma proteína, normalmente uma enzima, que confere resistência a um substrato específico (implica a utilização de um substrato específico para exercer a pressão seletiva). ▪ Tóxico - para as células não transformadas (herbicidas, ou outros compostos) Uma preocupação associada à pressão seletiva recorrendo a compostos tóxicos é a redução da sua eficiência. Porque a morte das células não transformadas pode: estar levar à secreção de compostos que inibem a proliferação das células transformadas; impedir o transporte de nutrientes essenciais para as células transformadas. ▪ Não tóxico - para as células não transformadas mas que potenciam o crescimento e/ou diferenciação das células transformadas Genes relacionados com o metabolismo de fontes de carbono “alternativas" (manose- man ou xilose xyl) Colocação dos tecidos transformados em meios com baixas concentrações de sacarose, mas com outras fontes de carbono alternativa (manose e a xilose) permite que apenas os tecidos com integração desses genes man e/ou xyl possam desenvolver se. As células sem esse gene integrado não morrem (porque o meio de cultura não é letal como no caso dos antibióticos ou herbicidas resistência) mas também não se desenvolvem. ○ Não condicional - não requer a utilização de qualquer substrato específico permitindo o crescimento seletivo e diferenciação do material transformado É exemplo a utilização do gene ipt (isopentanyl transferase ) que promove o desenvolvimento da parte aérea através da modificação do nível hormonal endógeno. Negativo - se associados à morte dos tecidos que integrem o gene marcador de seleção BioTec Página 30 31 Preocupações associadas aos SMG - Resistência a herbicidas Os TRANSGENES uma vez na planta levam a que os compostos associados à resistência (antibióticos ou herbicidas) sejam sintetizados até ao final do ciclo de vida da planta, mantendo se na planta, no ambiente, e nos produtos derivados (utilizados para alimentação humana ou animal) ainda que desnecessariamente. Esta é a principal preocupação ao nível da entidade que regulamenta o cultivo e consumo dos transgénicos e de muitos opositores dos OGMs. Cancerígenos Genes de resistência a Herbicidas --> Representam a maior preocupação em termos ambientais Gene flow e super- infestantes Gene flow Transferência do gene de resistência entre organismos da mesma espécie ou entre espécies filogeneticamente próximas onde seja possível ocorrer a hibridação Super- infestantes Um estudo desenvolvido no Canadá num campo de Brassica napus GM mostra que o gene de resistência a herbicidas (bar) foi transferido da cultura GM para a sua ancestral selvagem (infestante) através do pólen resultando numa SUPER infestantes. Genes de resistência a Antibióticos --> Representam a maior preocupação em termos de saúde pública Horizontal gene transfer Transferência direta de genes entre organismos de espécies diferentes O facto de muitos genes que codificam para a resistência a antibióticos serem provenientes de bactérias leva à preocupação de uma eventual transferência do gene de resistência integrado no genoma do OGM para uma bactéria de espécie diferente (do solo ou do intestino animal) conduzindo à resistência a antibióticos. BioTec Página 31 32 Sistemas de seleção - Tecnologias Clean gene Consiste no processo que permite desenvolver OGMs substituindo os SMG problemáticos (resistência a antibióticos e herbicidas) por outros mais facilmente aceites (transgénicos) ou simplesmente excluir (cisgenic e intragenic) a utilização de qualquer SMG. Métodos para produzir OGMs desprovidos de SMG: 1. Não utilização de marcadores de seleção (Não utilizar SMG) Raramente utilizada Exige o screening de todas as plantas potencialmente transformadas utilizando a técnica de PCR (primers específicos para amplificar uma região da cassete de expressão - promotor, gene de interesse ou terminador). No entanto tendo em conta que a eficiência de transformação é, normalmente, inferior a 3% significa que o grande número de plantas analisadas não tem integrado o gene de interesse. Estratégia muito dispendiosa em termos de aquisição de consumíveis (extração de DNA, PCR e análise por eletroforese) e recursos humanos para executar esse trabalho. 1. Remoção dos SMG recorrendo à reprodução sexuada - Lei da segregação independente dos cromossomas homólogos. Cruzamentos controlados para obtenção de plantas híbridas. Para remoção dos genes de seleção privilegiam se os auto cruzamentos a. Co transformação - Pode ser utilizado para transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens por biolística ou combinando as duas técnicas. A co-transformação consiste na integração do gene marcador de seleção e gene de interesse em loci diferentes. A combinação da transformação genética com o melhoramento convencional permite que o gene marcador de seleção possa ser removido durante a segregação e recombinação que ocorre associada à reprodução sexuada. Utilização de duas sequências de T DNA em separado Estratégias para co-transformação utilizando A. tumefaciens: - A sequência de T-DNA é a sequência de DNA que a bactéria I. Dois vetores binários cada um com uma cassete de expressão (T-DNA) transfere para a planta. a. Utilização de dois inóculos - Sequência de T-DNA corresponde Dois vetores diferentes separados em dois inóculos de à cassete de expressão Agrobacterium utilizados em simultâneo. manipulada. b. Utilização de um inóculo - A região do T-DNA é limitada Um único inóculo de Agrobacterium contendo os dois pelas sequências Left Border (LB) vetores de transformação. e o Right Border (RB) II. Um vetor binário com duas cassetes de expressão (T-DNAs) c. Super vetores binários Um único vetor com duas cassetes de expressão (regiões T-DNA). d. T-DNAs gémeos Um único vetor com duas cassetes de expressão (regiões T-DNA). 66% de frequência de co-transformação ; 24% da F1 SMG free e. Um vetor com duplo right border T-DNA Um único vetor com duas cassetes de expressão (regiões T-DNA), sendo que um dos T DNAs contem as duas opções. f. Um T-DNA com SMG fora da cassete Um único vetor com uma cassete de expressão (regiões T-DNA) onde está apenas incluído o gene de interesse, sendo que o gene marcador de seleção está fora do left border (LB). BioTec Página 32 33 Métodos para produzir OGMs desprovidos de SMG: 1. Não utilização de marcadores de seleção (Não utilizar SMG) Raramente utilizada 2. Remoção dos SMG recorrendo à reprodução sexuada - SMG negativo a. Co transformação (continuação) Após a transformação e seleção utilizando a pressão de seleção (dependo do gene marcador de seleção), todas as plantas selecionadas integram o gene marcador de seleção e parte integra também o gene de interesse. São selecionadas as plantas que integram os dois genes (seleção é feita por PCR utilizando primers específicos para o gene de interesse) consideradas como geração T0 e levadas até ao fim do seu ciclo de vida de modo a recolher as sementes As sementes são germinadas de modo a obter uma geração T1 com potencialidade (devido ao mecanismo natural de segregação) para apresentar plantas integrando apenas o gene de interesse (25% de probabilidade) Desvantagens - Não pode ser aplicado a plantas propagadas vegetativamente - O processo requer a seleção por cruzamento sendo por isso longo (dependendo do ciclo de vida da espécie) - Requer a inserção do SMG e do GOI (gene of interest) em locais distintos no genoma da planta 2ª lei de Mendel - - Ainda assim pode representar a análise de muitas plantas pelo o Segregação independente dos custo/tempo associado torna o processo moroso e de elevado custo cromossomas homólogos b. Co- transformação utilizando um sistema de seleção negativo Utilização de marcadores de seleção negativos em combinação com os marcadores de seleção positivos (colocados na mesma cassete de expressão). □ marcadores de seleção positivos --> geração T0: permite SELECIONAR as plantas que integram o gene marcador de seleção, sendo que parte integra também o gene de interesse. Plantas T0: Regeneradas imediatamente após o processo de transformação genética; A seleção é feita utilizando o marcador de seleção positivo; Parte tem apenas os genes marcadores de seleção, outra tem também o gene de interesse. □ marcadores de seleção negativos --> geração T1: permite REMOVER as plantas que integram o gene marcador de seleção (restam as plantas com apenas o gene de interesse e as plantas sem nenhum dos transgenes). Plantas T1: Obtidas por germinação das sementes recolhidas das plantas T0, são selecionadas utilizando o marcador de seleção negativo; Parte tem apenas os genes marcadores de seleção (50%), outra tem também o gene de interesse). BioTec Página 33 34 Métodos para produzir OGMs desprovidos de SMG: 1. Não utilização de marcadores de seleção (Não utilizar SMG) Raramente utilizada 2. Remoção dos SMG recorrendo à reprodução sexuada - SMG negativo 3. Expressão de SMG de forma transiente Altamente vantajoso por possibilitar a separação do gene marcador de seleção do(s) gene(s) de interesse logo na geração T0: - Maior rapidez na obtenção das plantas geneticamente modificadas; - Não requer a ocorrência de segregação e por isso sem necessidade de gerar plantas T1 (pode ser utilizado em casos em que a multiplicação das plantas é feita vegetativamente). A utilização de vírus geneticamente manipulados pode permitir esta expressão transiente na planta sem necessidade de inserção do gene no genoma da planta. BioTec Página 34 35 1. Não utilização de marcadores de seleção (Não utilizar SMG) Raramente utilizada 2. Remoção dos SMG recorrendo à reprodução sexuada - SMG negativo 3. Expressão de SMG de forma transiente 4. Excisão do SMG com recurso a ferramentas moleculares Consiste na integração do gene marcador de seleção e gene de interesse no mesmo locus o que implica a utilização de ferramentas moleculares específicas que permitem a posteriori remover o gene marcador de seleção. Um dos exemplos é baseado na Recombinação: Baseia se na utilização de uma característica natural do bacteriófago Lambda (conservative site specific recombination system) que utiliza mecanismo para integrar o seu material genético no cromossoma bacteriano. A enzima responsável pela integração do DNA viral no cromossoma bacteriano é uma integrasse. ○ Sistema Cre loxP Inicialmente utilizado em plantas como ferramenta para reorganização direcionada (site-specific ) e só posteriormente como sistema para remoção do SMG. Isolado de baceriófagos (P 1) e consiste na expressão do gene Cre que codifica para a recombinase Cre (causes recombination ou cyclization recombinase) e na introdução de dois locais específicos de recombinação (loxP com 34 pb) a flanquear o gene a excisar. Como conseguir a expressão do gene Cre Hibridação das plantas GOI+SMG com uma linhagem transgénica que expressa de forma constitutiva o gene Cre. Nas plantas F1 o screening é feito para identificar linhas onde o gene marcador de seleção foi removido. Estas plantas são depois utilizadas para cruzamento backcross com as wild type (não GM) para obtenção de plantas apenas com o gene de interesse (sem o gene marcador de seleção e sem o gene da recombinase. Re-transformação das plantas GOI+SMG utilizando uma cassete de expressão que integra o gene Cre. O screening é feito para identificar linhas onde o gene Cre foi integrado. As sementes das linhas T 0 selecionadas são germinadas e destas plantas identificadas aquelas onde o SMG foi removido Para remoção do gene Cre das linhas selecionads pode recorrer se à segregação caso os genes não estejam incluídos no mesmo loci. Desvantagens : Alternativas: 1. Espécies propagadas por reprodução sexuada 1. Expressão transiente (vírus) 2. Condicionado pelo ciclo de vida 2. Expressão developmentally programmed promotores 3. A re-transformação obriga a uma maior exposição que ativam a expressão do gene apenas em a reguladores de crescimento determinado estado de desenvolvimento da planta 3. Expressão induzida promotores que ativam a expressão do gene apenas sob condições específicas BioTec Página 35 36 Procedimento para obtenção de uma planta geneticamente I. Identificar o gene de interesse e proceder ao seu isolamento e clonagem (vetor de clonagem) II. Inserir o gene de interesse num vetor de expressão (cassete de expressão) definir sistema de seleção/rastreio (selectable/screenable markers) definir promotor III. Transferir a cassete de expressão (seleção do método de transferência do gene de interesse) IV. Regeneração das plantas geneticamente modificadas estabelecer previamente um sistema eficiente de regeneração de plantas in vitro que garanta a regeneração a partir de uma célula única. Cassete/vetor de expressão - Promotores Promotor região do DNA (100 1000 bp) localizada a 5' do gene que controla a ligação da enzima RNA polimerase ao DNA para iniciar a transcrição. Gene policistrónico - vários genes regulados pelo mesmo promotor, característico de procariotas. Nos organismos procariotas é necessário que ocorra o reconhecimento do promotor pelo fator sigma para que a transcrição se inicie. A ligação da RNA polimerase ao DNA é efetuada diretamente. Paralelismo entre operão policistrónico e fusão de genes em biotecnologia. Em eucariotas a ligação da RNA polimerase ao DNA requer o reconhecimento da região reguladora "CORE region” TATA box no promotor e consequente ligação de Fatores de Transcrição (comum entre genes) Existe uma região proximal no promotor que apresenta diversas regiões reguladoras (cis-elements) que controlam a expressão do gene- onde quando e quanto o gene será expresso (difere entre genes). Gene monocistrónico - apenas um gene regulado sob regulação de um promotor, característico de eucariotas. É necessário que ocorra o reconhecimento da TATA box por Fatores de transcrição ( TFs ) para que a transcrição se inicie. A ligação da RNA polimerase ao DNA é efetuada apenas após ocorrer a ligação de proteínas TFs , quer na “CORE region” quer na região distal. - indica qual das duas cadeias de DNA será utilizada como molde - indica a direção da transcrição - determina o local de início da transcrição ou seja, o primeiro nucleótido a ser transcrito em RNA - Um gene pode estar a ser transcrito de forma constitutiva em todos os tecidos e independentemente das condições ou apenas em alguns tecidos ou em situações específicas. BioTec Página 36 37 Cassete/vetor de expressão - Promotores O requerimento principal da transformação genética é que o gene introduzido possa ser expresso corretamente Qualquer gene que se pretenda expressar tem obrigatoriamente que estar sob o controlo de um promotor que funcione no organismo onde é introduzido Esta consideração é extremamente importante em plantas uma vez que grande parte dos transgenes são de origem bacteriana O ótimo será utilizar um promotor homólogo ou proveniente de uma espécie filogeneticamente próxima de modo a obtermos os níveis de expressão que se pretende Para produção de uma planta transgénica o promotor é inserido numa cassete de expressão em fusão com uma sequência de DNA heteróloga Os promotores utlizados podem ter diferentes origens. - Em procariotas: Os promotores utilizados para regular genes de interesse podem ter origem em: Procariotas - Em eucariotas: Em plantas, os promotores utilizados para regular genes de interesse podem ter origem em: Plantas, Vírus, Bactérias Em animais: igual/ com diversas origens Como determinar o papel de um promotor? 1. Promotores constitutivos Estão ativos em todas as circunstâncias na célula Introdução de resistência a uma praga 2. Promotores dirigidos São utilizados para direcionar a expressão do gene inserido no genoma para células/tecidos específicos. São exemplos os promotores que direcionam a expressão para: - tecidos fotossinteticamente ativos (tecidos verdes) Phosphenol pyruvate (PEP) carboxylase (promotor de um gene que codifica para uma enzima que entra na fotossíntese) - anteras utilizados para induzir a esterilidade masculina - frutos utilizados para a expressão de genes apenas com interesse ao nível do fruto - raiz utilizados para introdução de resistência a nematodes ou para introdução de tolerância a fatores de stress abiótico ( salinidade, metais pesados) - endosperma da semente são isolados de sequências associadas a genes cujas proteínas apenas estão presentes no endosperma garantindo a expressão do transgene em níveis elevados durante o desenvolvimento da semente na maior parte dos cereais 3. Promotores induzíveis Permite ter um controlo rigoroso do momento em que o transgene deve ser expresso e o período em que decorrerá essa expressão. Necessitam da aplicação de um estímulo externo (físico ou químico) para induzir a expressão (e.g., resposta a agentes patogénicos, stresses abiótico, salinidade, temperatura, luz ou agentes químicos). Com a utilização deste tipo de promotores o gene é apenas expresso em condições muito específicas. A sua expressão é controlada artificialmente. - Controlados por estímulos químicos Promotores em que a transcrição é reguladas de acordo com a presença/ausência de álcool, tetracycline e outros compostos. - Controlados por estímulos físicos Promotores que regulam a transcrição de genes sob estímulos externos, como a luz, a temperatura. - Controlados por estímulos biológicos Promotores que regulam a transcrição de genes sob estímulos externos relacionado com o ataque de pragas ou agentes patogénicos. BioTec Página 37 38 Vetores de expressão vs. Vetores de clonagem Vetores de expressão - Usado para expressar uma proteína produzir uma grande quantidade de mRNA) numa célula hospedeira - Apresenta uma cassete de expressão promotor gene terminador - Contém todas as sequências reguladoras que permitam ao gene ser expresso e traduzido nas células hospedeiras como: ○ promotor (forte) ○ local de ligação do ribossoma (sequência de Shine Dalgarno) ○ terminador ○ tags (para sistemas de purificação his tag) ○ sinal para poliadenilação ○ domínios proteicos que favoreçam a conformação ou solubilidade As sequências reguladoras deverão ser obrigatoriamente reconhecidas pela células hospedeira Fora da cassete de expressão apresenta regiões comuns aos vetores de clonagem - origem de replicação - marcador para seleção - multiple cloning site (MCS) As características do vetor de expressão dependem da origem do gene que queremos expressar e do próprio sistema de expressão (tipo de hospedeiro, etc ). - A estrutura de um gene eucariótico não é reconhecida num hospedeiro procariótico. - Por exemplo, não serão reconhecidos intrões ou exões. - Todos os elementos de regulação da expressão genética são distintos entre procariotas e eucariotas. Muitos dos vetores usados em células de mamíferos são “trabalhados” em E. coli , pelo que têm de ser funcionais em ambos os sistemas. - SV40 ori origem de replicação de adenovirus; funcional em células de mamíferos - CVM promoter cytomegalovirus major (CMV); funcional em células de mamíferos Ex. Vaca geneticamente modificada para produzir leite com lactoferrina e lisozima humanas Muitos dos vetores usados para transformar células vegetais utilizando o sistema de A. tumefaciens são “manipulados” em E. coli antes de serem transferidos para o A. tumefaciens pelo que têm de ser funcionais em ambos os sistemas. Em plantas como em animais o vetor pode ser todo ou parcialmente integrado. Em plantas a utilização do sistema mediado por A. tumefaciens apresenta maior garantias sobre integração de apenas a região de interesse. Por outro lado, as técnicas de edição permitem a integração de uma região específica e local específico no genoma. BioTec Página 38 39 Vetores de expressão vs. Vetores de clonagem Vetores de clonagem - Usado como veículo para transferir um gene/ fragmento de DNA para uma célula hospedeira - Moléculas pequenas e s/ capacidade para serem transferidos por conjugação - Com capacidade para se incorporar na célula hospedeira - Fácil de introduzir e remover o DNA de interesse do vetor de clonagem com recurso a enzimas de restrição - Apresenta como regiões reguladoras ORI permite que o vetor de multiplique no interior de célula hospedeira utilizando a maquinaria dessa, permitindo obter múltiplas cópias marcador de seleção resistência a um antibiótico permite fazer o screening das colónias que integraram o vetor (com ou sem insert) gene reporter (LacZ) permite a identificação dos clones recombinantes (com vetor recombinante) MCS local com locais de restrição únicos, permitindo a excisão do fragmento inserido PLASMÍDEO Podem encontrar se: Linearizados com um único local de clonagem correspondente a: 1. sequência digerida por uma enzima de restrição que permite a inserção de um fragmento com extremidades complementares; 2. Presença de timinas (T) nas extremidades Circulares com: 1. a indicação das enzimas de restrição que podem ser utilizadas para inserir o fragmento de DNA; 2. local de recombinação ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Isoladas de bactérias (mecanismo de defesa). Reconhecem sequências específicas (4-8nts). Existem vários tipos de endonucleases. No entanto, no contexto de laboratório, designa se por enzimas de restrição, as endonucleases de tipo II. A MCS aumenta a versatilidade do vetor: permite a inserção de um fragmento digerido com enzimas diferentes (devem ser selecionadas tendo em conta a sequência do gene) permite inserir um gene na posição pretendida ao utilizar enzimas diferentes a 5’ e 3’ do gene Permite fazer o screening dos recombinante recorrendo a enzimas de restrição mesmo que estas não tenham sido utilizadas para inserir o gene (vetores TA). O gene de interesse (que pretendemos expressar) enquanto manipulado no vetor de clonagem deve ser compatível com as enzimas de restrição que planeamos usar Estudo dos locais de restrição para seleção das enzimas a utilizar. BioTec Página 39 40 Vetores de expressão vs. Vetores de clonagem Vetores de clonagem PLASMÍDEOS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO ETAPAS DA CLONAGEM BioTec Página 40 41 Procedimento para obtenção de uma planta geneticamente modificada I. Identificar o gene de interesse e proceder ao seu isolamento e clonagem (vetor de clonagem) II. Inserir o gene de interesse num vetor de expressão (cassete de expressão) - definir sistema de seleção/rastreio (selectable/screenable markers) - definir promotor - definir a estratégia de manipulação (gene targeting gene editing) III. Transferir a cassete de expressão (seleção do método de transferência do gene de interesse) IV. Regeneração das plantas geneticamente modificadas - estabelecer previamente um sistema eficiente de regeneração de plantas in vitro que garanta a regeneração a partir de uma célula única Manipulação genética de eucariotas ---> PLANTAS -Manipulação de uma característica (gene único), sem manipulação de genomas completos -Transferência direta -Utilização de um gene proveniente de qualquer organismo sem a barreira da espécie existente no melhoramento convencional Barreira da espécie? → Barreira Filogenética --> Espécies alotetraploides anfidiploides As alterações introduzidas podem estar associadas a: - mudanças estruturais/funcionais do material genético do próprio organismo (alteração do promotor/ silenciamento); OGM com características diferentes - inserção de qualquer material genético (um ou mais genes) proveniente de uma cultivar/variedade/espécie diferente, podendo ser de um organismo filogeneticamente muito distante. OMG -> Inserção de material genético/alteração genoma Transgénicos -> Inserção de material genético de organismos de espécies não sexualmente compatíveis (incluindo organismos filogeneticamente muito distantes) Ex. O Arroz Dourado O endosperma imaturo do arroz produz naturalmente o precursor da provitamina A geranylgeranyl diphosphate (GGPP). Foi necessário apenas a introdução de dois genes envolvidos na biosíntese da provitamina A (beta caroteno) CrtI - carotene desaturase isolado da bactéria do solo Pantoea ananatis, previamente conhecida como Erwinia uredovora Psy - phytoene synthase (isolado do Narcissus pseudonarcissus GR1 ou Zea mays GR2) BioTec Página 41 42 “Cisgenic ou Intragenic" APENAS inserção de material genético do próprio organismo ou de um organismo de cv /var distinta mas pertencente às mesma espécies ou de um organismos de uma espécie próxima que permita a hibridação (sexualmente compatíveis) gene pool utilizável no melhoramento convencional. Na expressão cisgenesis/ intragenetic é necessário ter elementos genéticos completos de fundos genéticos sexualmente compatíveis ( coding sequence including exons/introns and terminator)- genes nativos- e têm de ser inseridos no sentido de orientação do genoma. Em cisgenesis podem ser considerados um ou mais genes. O novo fenótipo depende de: i) funcionalidade do gene inserido (polimorfismos funcionais exons/íntrons em sequência homóloga inserida) ii) o efeito da localização no genoma (eucromatina/heterocromatina) iii) aumento nas cópias genéticas Intragenesis Construções de expressão intragenesis contêm genes híbridos (intragenes) compostos por elementos genéticos de diferentes genes ou loci isolados dentro de um pool genético sexualmente compatível (espécies cruzáveis) A manipulação de genes é permitida, portanto, construções de silenciamento podem ser feitas. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Cassete de expressão constituída por: - sequência codificante (ORF não gDNA )do gene ZmRca (Rubisco activase ) isolado do próprio milho ( Zm) - promotor e terminador isolado do gene ZmRBSC m3 (Rco , small subunit Rubisco) -sem genes marcadores de seleção BioTec Página 42 43 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Todos os transgénicos são OGMs mas nem todos os OGMs são transgénicos Manipulação de genomas BioTec Página 43 44 1. Expressão de um gene inexistente O Arroz Dourado Uma vez que o endosperma imaturo do arroz produz naturalmente o precursor da provitamina A-geranylgeranyl diphosphate (GGPP) foi necessário apenas a introdução de dois genes envolvidos na biosíntese da provitamina A (beta caroteno) O gene crt1 isolado da bactéria do solo Pantoea ananatis (previamente conhecida como Erwinia uredovora ) O gene psy , isolado de narcisos Narcissus pseudonarcissus O primeiro transgene psy codifica a enzima phytoene synthase (PSY) que utiliza o geranylgeranyl diphosphate (GGPP) produzido naturalmente pela planta para formar o phytoene (caroteno sem cor). O segundo gene crtI codifica a enzima carotene desaturase (CRTI) permitindo a biossíntese do caroteno. 1º evento: proof of concept prototype --> com promotor constitutivo CAMV35S (~ 1.6 μg /g de caroteno) 2º evento : GR1 (primeira linhagem de arroz dourado) --> com promotor para direcionar a expressão dos genes para a semente (endosperma): gt1 (Glu) --> rice endosperm specific glutelin promoter (6μg /g de caroteno) 3º evento : GR2 --> substituição do gene Psy de Narcissus pseudonarcissus (GR1) pelo Psy homólogo de milho (~37 μg /g de carotenos (dos quais 31 μg /g correspondem a β caroteno)) 2. Aumento da expressão de um gene endógeno Porquê transgénicas se o gene foi isolado em plantas da mesma espécie? Mesmo que um gene seja isolado de uma planta da mesma espécie, se for introduzido em outra planta da mesma espécie, o organismo resultante ainda é considerado transgênico. A razão pela qual esse termo é aplicado mesmo em casos de transferência intrassepcional de genes é histórica e está relacionada às primeiras aplicações e discussões em torno da engenharia genética. Quando o termo "transgênico" foi inicialmente cunhado, as primeiras técnicas de engenharia genética frequentemente envolviam a transferência de genes entre organismos de espécies diferentes, e essa ideia de "além das fronteiras naturais" ficou associada ao termo. No entanto, à medida que a tecnologia evoluiu, tornou- se possível e comum transferir genes dentro da mesma espécie. 3. SILENCIAMENTO - Gene Targeting Diminuição vs. Bloqueio da expressão de um gene Técnicas direcionadas para diminuição da expressão É inserida uma sequência de DNA (gene ou sequência parcial de um gene) no genoma. No entanto, o mecanismo de silenciamento atua após transcrição do gene alvo, ao nível do transcrito. Técnicas utilizadas para Knockdown de genes: 3.1. RNA de interferência ( RNAi 3.2. RNA antisense É promovida a síntese de transcritos que interferem com o transcrito do gene alvo, associadas à degradação do transcrito ou bloqueio da tradução. BioTec Página 44 45 3.1. Knockdown RNA de interferência ( RNAi) O gene alvo é transcrito nos seus níveis normais ocorrendo a regulação após a transcrição. A manipulação ainda que seja realizada ao nível do genoma processa se após transcrição, atuando no transcrito do gene alvo. MicroRNAs (miRNAs) Mecanismo de silenciamento que existe numa grande diversidade de organismos, incluindo animais, plantas e fungos, em que a célula tem a capacidade de inibir a expressão de genes após a transcrição (regulação pós transcricional). A inibição ocorre ao nível do citoplasma mas o mecanismo é codificado ao nível do genoma nuclear e acionado ao nível do núcleo através da síntese de longas moléculas de RNA de cadeia dupla (double stranded RNA, dsRNA) RISC --> RNA induced silencing complex As dsRNA (sintetizadas no núcleo) migram para o citoplasma onde são cortadas pela enzima “ Dicer ” em pequenos fragmentos de ~21bp small interfering RNAs (siRNA) Os siRNA têm a capacidade de se ligar a proteínas específicas ---> Argonaute proteins. Após esta ligação, cada siRNA gera duas cadeias simples (single stranded RNAs, ssRNAs ): uma é degradada (sense) e a ( antisense ) é incorporada no complexo RISC RNA induced silencing complex. As proteínas que formam este complexo (Argonaute 2 , Ago2) têm a capacidade de se ligar à região complementar do mRNA (transcrito do gene alvo, endógeno). A característica fenotípica associada ao gene alvo é alterada devido: -Impedimento da progressão do ribossoma aquando da tradução -Degradação do transcrito pelo complexo RISC A característica fenotípica associada ao gene alvo é alterada devido: Ligação do miRNA ao mRNA do gene alvo for perfeita Degradação do transcrito pelo complexo RISC (são sintetizados péptidos não funcionais (mRNA incompleto a 3’, semelhante às mutações nonsense) Ligação do miRNA ao mRNA do gene alvo for imperfeita Bloqueio da tradução impedimento da progressão do ribossoma (não ocorre síntese proteica). Via de biossíntese dos componentes principais que definem a coloração das flores Naturalmente as rosas, os cravos e os crisântemos (três espécies mais importantes na floricultura) não acumulam delfinidinas. As variedades obtidas por melhoramento convencional - gradiente de cor laranja/ vermelho. Não existem variedades de melhoramento convencional de cor violeta/ azul. Porquê? Porque não possuem a enzima chave para a síntese das delfininas F3’5’H (3’,5’ hydroxylase). No entanto os genes isolados em petúnia não funcionaram em rosa. O caminho para obtenção de rosas com alteração da cor associada à acumulação de delfininas foi bastante mais longo, tendo sido testado o uso de diferentes promotores genes de espécies de plantas distintas diferentes variedades como material receptor do transgene background genético e a composição natural de flavonoides). A presença dos pigmentos provenientes da via biossintética endógena impediam a obtenção da coloração desejada seleção de uma cultivar que demonstrasse: - acumulação de flavonoides que poderiam funcionar como co pigmentos pelargonidin em vez de cyanidin Sem expressão do laranja ou do vermelho a pétala é branca e não roxa (sem DFR genes). A Florigene introduziu o gene F3'5' H de petunia ou amor perfeito e o gene DFR de petunia e o resultado foi a cor pretendida: "azul" 1 --> Silenciamento pós transcripcional (RNAi) dos genes DFR da roseira responsáveis pela pigmentação natural 2 --> Expressão do gene F 3'5 ’H de amor perfeito para acumulação das dihydromyricetin 3 --> Expressão do gene DFR de lírio que codifica para a síntese das delphinidins (pigmento responsável pela cor azul) e não presente em roseiras BioTec Página 45 46 3.2. Knockdown RNA antisense Antisense RNA ( asRNA ), também conhecido por transcrito antisense , foi identificado em organismos procariotas e eucariotas e pertence a uma classe de long noncoding RNA (lncRNA) com um tamanho máximo de 200 nucleótidos. O asRNA é codificado no genoma nuclear e transcrito de igual forma que o mRNA target (que codifica uma proteína). A principal função do asRNA na célula é regular a expressão génica (pós trascricional). A cadeia simples do asRNA sendo complementar à do RNA mensageiro que codifica para uma proteína, vai ligar se a essa (ainda no núcleo ou já no citoplasma), conduzindo ao bloqueio tradução (síntese proteíca e consequente redução do nível de proteína sintetizada. A síntese proteica é boqueada porque: - a cadeia de mRNA não fica acessível ao ribossoma - cadeias duplas de RNA são rapidamente degradadas pela enzima RNaseH (digestão aleatória) A “ digestão pode induzir o mecanismo de silenciamento dos siRNA /miRNA uma vez que origina fragmentos de menor tamanho, complementares ao mRNA alvo. Tomate transgénio - Flavr Savr Alteração da maturação Foi inibida a formação da enzima poliglacturonase (PG) que é ativada durante o amadurecimento do fruto e que promove a degradação da parede celular, reduzindo assim a consistência da mesma (frutos moles). A sequência em antisense é sintetizada artificialmente como os primers. Este DNA artificial é introduzido na planta e integrado no genoma recorrendo aos métodos de transformação genética de plantas (ex: A. Tumefaciens) 4. SILENCIAMENTO Gene editing Técnicas direcionadas para bloqueio da expressão A alteração é realizada ao nível da sequência do gene alvo. O mecanismo atua ao nível do DNA. É promovida uma alteração da sequência do gene alvo associada à introdução de mutações nonsense/ frameshift com consequente tradução de proteínas não funcionais. Técnicas utilizadas para Knockout de genes: CRISPR/Cas TALENs ZINC FINGER BioTec Página 46 47 4. KNOCKOUT Mecanismos de reparação dsDNA 4.1. KNOCKOUT CRISPR/Cas9 (NHEJ) São os componentes de um mecanismo de defesa adaptive immune systems presente em Bacteria e Archaea contra bacteriófagos e plasmídeos infeciosos A especificidade e funcionalidade deste sistema depende da nuclease Cas9 ( Classe II ) e da molécula de RNA guia, que interagem e formam o complexo CRISPR/Cas9 com capacidade de identificar e degradar sequências alvo (DNA cadeia dupla) específicas. O RNA guia No sistema manipulado, o RNA guia é composto por uma cadeia simples de RNA que forma uma estrutura em loop com forma de T. O RNA guia é desenhado de forma a apresentar - uma região complementar à sequência de DNA alvo (20 nt localizados a 5 da sequência) - uma sequência PAM Protospacer Associated Motif localizada a 3 da região de corte 5 NGG 3 BioTec Página 47 48 4.1. KNOCKOUT CRISPR/Cas9 (NHEJ) A nuclease Cas9 --> A enzima Cas 9 é responsável por localizar e clivar o DNA alvo, em ambos os sistemas CRISPR/Cas, natural e artificial. Apresenta seis domínios: RECI e RECII: (região de reconhecimento): Determina a especificidade da enzima. RECI (large recognition) responsável pela ligação do RNA guia; RECII com função ainda desconhecida. Bridge Helix : crucial para iniciar a actividade enzimática de clivagem após a ligação do DNA alvo; PAM Interacting domain : confere a especificidade ao motivo protospacer adjacent motif (PAM) que interage com o interacting domain (PI) sendo posteriormente responsável pela ligação ao DNA alvo. O PAM é constituído por 2 ou 3 nt downstream da região complementar do RNA guia, sendo a sua sequência específica do Sistema CRISPR (ex.: em Streptococcus pyogenes é 5′ NGG 3); RuvC e HNH : são ambos domínios da nuclease (small nuclease , NUC) responsáveis pelo corte do DNA alvo (cadeia dupla) 1- O RNA guia (sintético) liga se à nuclease Cas9 e induz alterações na conformação da enzima, passando esta da forma inativa para a forma ativa. Uma vez ativo o complexo CRISPR/Cas9, o motivo PAM identifica a região a clivar, e a enzima desnatura a cadeia alvo na regi?

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