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1 59 399 599 399 39 599 399 599 39 599 599 399 59 399 399 599 2 FIGURA 5-22. Re Resolución solución alternativa de una estructura estruc tura de de las hebras. Cortar los enlaces como se muestra en el paso 1 y Holliday. L as líne lí neas as diago dia gonal nales es y ver ve r t ic ical ales es repr re pres esent entan an un so s o lo en en- ligar los extremos como se indica regenera los cromosomas ori-- lace fosfodiéster. La manera más simple de diagramar el proceso es ginales. Cortar las hebras como se muestra en el paso 2 y vo voll ve verr a rotar el diagrama 180° respecto de la molécula inferior, de manera ligarlas como se muestra en la parte inferior genera cromosomas que las moléculas superior e inferior tengan la misma orientación re combinantes. CONCEPTOS CLAVE DE LA SECCIÓN 5.3 5.4 Transcripción de ge- nes codificantes de proteínas Reparación y recombinación del DNA y formación de mRNA Los cambios de la secuencia del DNA se deben a erro- res de copiado y a los efectos de diversos agentes físicos En su definición más simple, un gen es una unidad de DNA y químicos. que contiene la información para especificar la síntesis de Las células eucariontes tienen tres sistemas de reparación una cadena polipeptídica individual o RNA funcional (como por escisión para corregir apareamientos incorrectos de tRNA). Las moléculas de DNA de virus pequeños contienen bases y para eliminar aductos químicos del DNA. La repa-- solo algunos genes, mientras que la molécula de DNA indi- ración por escisión de bases, la reparación de errores de apa-- vidual de cada uno de los cromosomas de animales y plan- reamiento y la reparación por escisión de nucleótidos operan tas superiores puede contener varios miles de genes. La vasta con alta exactitud y, en general, no introducen errores. mayoría de los genes contienen información utilizada para sintetizar moléculas proteicas, y son las copias de RNA de Las bases dañadas del DNA de un DNA molde de he- bra simple en una horquilla de replicación bloquearán el estos genes codificantes de proteínas las que constituyen las moléculas de mRNA de las células. progreso de una DNA polimerasa replicativa. Estos blo- En su forma más elemental, el proceso de transcripción es queos pueden ser superados por una polimerasa transle- sión que tiene requisitos más laxos para el apareamiento la formación de una copia de RNA de la información pre-- de bases adecuado durante la replicación. Las polimera- sente en el DNA para un gen. La síntesis de RNA, catalizada por una RNA polimerasa y basada en el mismo mecanismo sas translesión son proclives a errores y tienden a generar mutaciones propias en la vecindad de la lesión original. de apareamiento de bases que la replicación del DNA, copia, o tran ansscr be,, el có criibe códdig igoo de cu cuat atrro ba base sess de dell DN DNA A qu que cocont ntiie- La reparación de roturas de doble cadena por la vía de ne A, G, C y T al código de cuatro bases del RNA, que es unión de extremos no homólogos puede unir segmentos de idéntico excepto que U reemplaza a T. Dada la inestabilidad DNA de cromosomas diferentes, lo que posiblemente origine inherente del RNA dentro de la célula, la cantidad de RNA una translocación cromosómica oncogénica. Este mecanis-- transcripto puede ser regulada con facilidad mediante modi-- mo de reparación también provoca una pequeña deleción, ficaciones de la tasa de iniciación de la transcripción. Esto aun cuando se unan segmentos del mismo cromosoma. permite que distintos conjuntos de genes se expresen en los La reparación sin errores de roturas de doble cadena múltiples tipos diferentes de células que componen un orga-- del DNA se logra mediante recombinación homóloga nismo multicelular. El cap tullo 8 c on capíítu onsi sidder eraa la la re regu gullac aciión de usando como molde la cromátida hermana no dañada. la transcripción. De Deffec ecttos her hereedita tarrios de de la vía de de rep repaaraci cióón po por esc escii- Para genes codificantes de proteínas, el producto de la trans- sión de nucleótidos, como en individuos con xerodermia cripción es un mRNA, que después es traducido al código de pigmentosa, los predisponen al cáncer de piel. El cáncer 20 aminoácidos de las proteínas. En esta sección, se considera de colon hereditario suele asociarse con formas mutantes la formación de mRNA funcionales a partir de genes codifi- de proteínas esenciales para la vía de reparación de erro-- cantes de proteínas (véase fig. 5-1, paso 1). Un proceso similar res de apareamiento. Los defectos de la reparación por genera precursores de rRNA y tRNA, codificados por genes recombinación homóloga se asocian con la herencia de de rRNA y tRNA; luego, estos precursores son modificados un alelo mutante del gen BRC BRCA1 o BRCA CA2 2, qu quee pr preedis is-- aún más para dar origen a rRNA y tRNA funcionales (véanse ponen a cáncer de mama y de útero. capítulos 8 y 9). 5.4 Transcripción de genes codificantes de proteínas y formación de mRNA 199  D La RNA polimerasa transcribe una hebra molde ’’ Crecimiento 5’ 3’ de DNA a una hebra complementaria de RNA de la hebra de RNA El proceso de transcripción está estrechamente relacionado 2 con el de replicación del DNA, en el que una hebra de DNA 7 $ actúa como molde y, en el caso de la transcripción, determina 2 ’’ el orden en el que se unen los monómeros de ribonucleósido + + trifosfato (rNTP) para formar una cadena de RNA comple- + + mentaria. Los rNTP entrantes aparean sus bases con bases 2+ 2 complementarias de la hebra molde de DNA y, después, se −2 3 2 unen a una hebra creciente de RNA en una reacción de polime- rización catalizada por RNA polimerasa. La reacción de po- 2 limerización implica un ataque nucleofílico por el oxígeno 3’ $ 8 2 de la cadena de RNA en crecimiento sobre el carbono a del H + + siguiente nucleótido precursor que será añadido, lo que deter- e mina la formación de un enlace fosfodiéster y liberación de b + + pirofosfato (PPi). Al igual que en la replicación del DNA, las r 2+ 2 moléculas de RNA siempre se sintetizan en dirección 5’ → 3’ a −2 3 2 (fig. 5-23a). m Por convención, el sitio del molde de DNA en el que la RNA o 2 l & * polimerasa comienza la transcripción se numera +1 (fig. fig. 5-23b). 5-23b). d 2 En dirección 3’ (corriente abajo) denota la dirección en la que e + + d + e ’’ + 2+ 2+ FIGURA 5-23. El RNA RNA se se si sint nte etiza en en di cciión 5’ → 3’. (a) Po direcc Polimeri meri-- D zación de ribonucleótidos por la RNA polimerasa durante la transcrip-- 3ROLPHUL]DFLĂQ N ción. El aminoácido que será agregado al extremo 3’ de una hebra de A 2 2 2 RNA en crecimiento se especifica mediante el apareamiento de bases $ 8 α β γ 2 3 2 3 2 3 2− entre la siguiente base de la hebra de DNA molde y el ribonucleósido 2 trifosfato (rNTP) entrante complementario. Se forma un enlace fosfo- + + 2− 2− 2− diéster cuando la RNA polimerasa cataliza una reacción entre el oxí- + + geno 3’ de la hebra en crecimiento y el fosfato a de un rNTP apareado 2+ 2+ correctamente por sus bases. Las hebras de RNA siempre se sintetizan rNTP entrante en dirección 5’ → 3’ y son de polaridad opuesta a sus hebras de DNA molde. (b) El nucleótido de DNA donde la RNA polimerasa inicia la $ transcripción se designa +1. La dirección en la que viaja la polimerasa sobre el DNA de denomina en di dire recc 3’, y las bas cciión 3’ bases es en en direcci dirección ón 3’ se se marcan con números positivos. La dirección opuesta es en di direcc cciión 5’ 5’, y las bases se marcan con números negativos. Algunas características génicas importantes se localizan en dirección 5’ respecto del sitio de inicio de la transcripción, incluida la secuencia promotora que loca-- liza la RNA polimerasa al gen. (c) La hebra de DNA que está siendo transcripta es la hebra molde; su complemento es la hebra no molde. 7 El RNA sintetizado es complementario de la hebra molde y, por con- siguiente, idéntico a la secuencia de la hebra no molde, excepto que ’’ tiene uracilo en lugar de timina. E 7UDQVFULSFLĂQ 3URPRWRU 6HFXHQFLDFRGLıFDQWH ’’ ’’ ’’ ’’ ş ş ş           &RUULHQWHDUULEDHQGLUHFFLĂQ’ &RUULHQWHDEDMRHQGLUHFFLĂQ’ F ’’ &8*&&$88*8&$*$&$8*8$8$&&&&*8$&*8&88&&&*$*&*$$$$&*$8&8*&*&8*& ’7UDQVFULSWR SULPDULRGH51$ +HEUDQRPROGH’’ &7*&&$77*7&$*$&$7*7$7$&&&&*7$&*7&77&&&*$*&*$$$$&*$7&7*&*&7*&’’ '1$ +HEUDPROGH’’ *$&**7$$&$*7&7*7$&$7$7****&$7*&$*$$***&7&*&7777*&7$*$&*&*$&*’’ 200 O 5 Mecansmos genétcos CAPÍTULO CAPÍTUL genétcos moleculares moleculares fundamentales fundamentales se transcribe la hebra molde de DNA; en dirección 5’ (corriente por la RNA polimerasa (paso 2). Se separan alrededor de arriba) indica la dirección opuesta. Las posiciones de los nu-nu- 12-14 pares de bases de DNA alrededor del sitio de inicia-- cleótidos de la secuencia de DNA en dirección 3’ a partir de un ción de la transcripción, lo que permite que la hebra molde sitio de iniciación se indican con un signo positivo (+); aquellas ingrese en el sitio activo de la enzima. El sitio activo es donde en dirección 5’, con un signo negativo (–). Como el RNA se tiene lugar la catálisis de formación de enlaces fosfodiéster sintetiza en dirección 5’ → 3’, la RNA polimerasa se mueve por entre rNTP que son complementarios con la hebra molde. la hebra molde de DNA en dirección 3’ → 5’. El RNA recién La región de 12-14 pares de bases de DNA desnaturalizado sintetizado es complementario de la hebra molde de DNA; por en el sitio activo de la polimerasa se conoce como burbuja consiguiente, es idéntico a la hebra no molde de DNA, con ura-- de transcripción. La iniciación de la transcripción se consi- consi- cilo en lugar de timina (fig. 5-23c). dera completa cuando los primeros dos ribonucleótidos de una cadena de RNA están unidos por un enlace fosfodiéster Etapas de la transcripción Para llevar a cabo la transcrip- (paso 3). ción, la RNA polimerasa cumple varias funciones distintas, Después de que se han polimerizados varios ribonucleóti-- como se ilustra en la figura 5-24. Durante la iniciación de la dos, la RNA polimerasa se disocia tanto del DNA promotor transcripción, la RNA polimerasa, con la ayuda de factores como de los factores de iniciación (denominados factores de iniciación (denominados factores s en las bacterias y fac-- s en las bacterias y factores de transcripción general en ar- tores de transcripción general en los eucariontes), reconoce queobacterias y eucariontes). Durante la etapa de elonga elonga-- una secuencia específica de DNA de doble hebra denomina-- ción de la hebra, la RNA polimerasa se mueve a lo largo da promotor y se une a ella (paso 1). Después de la unión, del DNA molde y abre el DNA de doble hebra por delante la RNA polimerasa y los factores de iniciación separan las de su dirección de movimiento y guía a las hebras para jun-- hebras de DNA para que las bases de la hebra molde puedan tarlas de nuevo, de manera que se reasocien en el extremo aparearse con las bases de los rNTP que serán polimerizados en dirección 5’ de la burbuja de transcripción (paso 4). La RNA polimerasa Sitio de Sitio de iniciación terminación en INICIACIÓN en la hebra molde la hebra molde 1 La polimerasa se une la secuencia del 5’ 5’ promotor del 3’ 3’ DNA dúplex. “Complejo cerrado” Promotor 2 La polimerasa desnaturaliza el DNA dúplex cerca del sitio 5’ 5’ de iniciación de la 3’ 3’ transcripción, lo que forma una burbuja Burbuja de transcripción. de transcripción “Complejo abierto” rNTP iniciales 3 La polimerasa cataliza 5’ 5’ la unión fosfodiéster 3’ 3’ de los dos rNTP iniciales FIGURA 5-24. Tre ress etapas de la transcripción. Du Du-- 5’ RNA naciente rante la iniciación de la transcripción, la RNA polime-- ELONGACIÓN rasa forma una burbuja de transcripción y comienza la polimerización de ribonucleótidos (rNTP) en el sitio 4 La polimerasa avanza 5’ 5’ de inicio, que se localiza dentro de la región promo-- en dirección 3’ 5’ 3’ 3’ por la hebra molde tora. Una vez que se ha transcripto una región de desnaturalizando el DNA, las hebras separadas se reasocian en una doble Región híbrida hélice. El RNA naciente es desplazado de su hebra DNA dúplex y agregando DNA-RNA molde, excepto en su extremo 3’. El extremo 5’ de la rNTP al RNA en crecimiento hebra de RNA abandona la RNA polimerasa a través TERMINACIÓN 5’ 5’ de un canal de la enzima. La terminación se produce 3’ 3’ cuando la polimerasa encuentra una secuencia de 5 En el sitio de terminación 3’ terminación específica (sitio de terminación). Véanse de la transcripción, detalles en el texto. Por simplicidad, el diagrama la polimerasa libera 5’ ilustra la transcripción de cuatro giros de la hélice el RNA completado y se disocia del DNA Hebra de RNA completa de DNA, que codifican alrededor de 40 nucleótidos de RNA. La mayoría de los RNA son considerablemente más largos, lo que requiere la transcripción de una región más larga de DNA. 5.4 Transcripción de genes codificantes de proteínas y formación de mRNA 201 polimerasa añade un ribonucleótido por vez al extremo 3’ Subunidad α9 de la cadena de RNA en crecimiento (naciente ). Durante naciente). Subunidad ω la elongación de la hebra, la enzima mantiene una región RNA Subunidad α desnaturalizada de alrededor de 14-20 pares de bases en la burbuja de transcripción. Aproximadamente ocho nucleóti-- dos en el extremo 3’ de la hebra de RNA en crecimiento per-- manecen apareados por sus bases a la hebra molde de DNA en la burbuja de transcripción. El complejo de elongación, Subunidad β9 compuesto por RNA polimerasa, DNA molde y la hebra na-- ciente de RNA, puede ser extraordinariamente estable. Por ejemplo, la RNA polimerasa transcribe el gen de mamífero Subunidad β más largo conocido, que contiene alrededor de 2 millones de pares de bases, sin disociarse del DNA molde ni liberar el RNA naciente. La síntesis de RNA tiene lugar a una ve-- locidad de alrededor de 1000-2000 nucleótidos por minuto, de manera que el complejo de elongación debe permanecer intacto durante más de 24 horas para garantizar la síntesis continua de pre-mRNA de este gen muy largo. Obsérvese que, si bien es similar a la replicación del DNA desde el punto de vista bioquímico, la transcripción de RNA es alre-- dedor de 30 veces más lenta en términos de la velocidad de nucleótidos añadidos. Durante la terminación de la transcripción, la etapa final de DNA la síntesis de RNA, se libera la molécula de RNA completada de la RNA polimerasa, y la polimerasa se disocia del DNA FIGURA 5-25. RNA polimer bacterriana. Es polimerasa bacte Esta ta estruc estructura tura co co - molde (paso 5). Una vez liberada, una RNA polimerasa puede rresponde a la molécula de polimerasa en la etapa de elongación de transcribir otra vez el mismo gen u otro. la transcripción. En este diagrama, la transcripción procede hacia la derecha. Las flechas indican dónde ingresa el DNA en dirección 3’ Estructura de las RNA polimerasas Las RNA polimerasas en la polimerasa y el DNA en dirección 5’ sale en un ángulo respecto de las bacterias, arqueobacterias y células eucariontes son del DNA en dirección 3’. La hebra molde es de color violeta claro; la fundamentalmente similares en estructura y función. Las hebra no molde, violeta oscuro; el RNA naciente, rojo. La subunidad RNA polimerasas bacterianas están compuestas por dos su-- b’’ de la RNA RNA popolim limeeras rasaa es es dor dorada; la la sub subun unida idadd b’, amarill amarillo o claro claro;; y las subunidades a’ visibvisible less desd desde este este ángul ángulo, o, marro marrone nes.s. Se Se agre agrega gan n bunidades grandes relacionadas (b’ y b), dos copias de una nucleótidos complementarios del DNA molde en el extremo 3’ de la subunidad más pequeña (a) y una copia de una quinta su- hebra de RNA naciente a la derecha de la burbuja de transcripción. El bunidad (v) que no es esencial para la transcripción ni para RNA naciente recién sintetizado abandona la polimerasa del lado en la viabilidad celular, pero que estabiliza la enzima y ayuda dirección 5’ a través de un canal formado por la subunidad b. La subu- en el ensamblado de sus subunidades. Las RNA polimerasas nidad v también es visible desde este ángulo. (Da (Dattos cor cortesí tesíaa de Seth Seth de arqueobacterias y eucariontes tienen varias subunidades Science 289 Darth; véase N. Korzheva et al., 2000, Science 289::619- 625 25,, y N. N. Opalk Opalkaa etet pequeñas adicionales asociadas con este complejo central, Cell 11 al., 2003, Cel 114 4:335 335-3 -345 45). que se describe en el capítulo 8. Los esquemas del proceso de transcripción suelen mostrar la RNA polimerasa unida a una molécula de DNA no curvada, como en la figura 5-24. 5-24. Sin embargo, la cristalografía de rayos X y otros estudios de una RNA polimerasa bacteriana en elongación indican que mostraron que un gen se transcribe, en primer lugar, a un transcripto primario que incluye las secuencias de exones, el DNA se curva en la burbuja de transcripción (fig. 5-25). así como las secuencias de intrones que las separan. Con posterioridad, se eliminan los intrones, y se cortan y empal-- Los precursores del mRNA eucarionte son man los exones (véase capítulo 9). Si bien los intrones son procesados para formar mRNA funcionales frecuentes en eucariontes multicelulares, son sumamente ra-- ros en bacterias y arqueobacterias, e infrecuentes en muchos La investigación temprana de la estructura de los genes eucariontes unicelulares, como la levadura de panadería. eucariontes implicó estudios de virus que infectan animales. En células eucariontes, el sitio de síntesis de RNA (el núcleo) Cuando los investigadores analizaron las regiones de una está separado del sitio de traducción (el citoplasma). En el nú-- molécula de DNA viral que codificaba mRNA virales, se sor-- cleo, los transcriptos primarios de genes codificantes de proteí-- prendieron al observar que la secuencia de un único mRNA nas –pre-mRNA (precursores del mRNA)– deben ser sometidos viral era codificada en varias regiones del DNA viral sepa-- a varias modificaciones, denominadas en conjunto procesamien procesamien-- radas por secuencias de DNA que no estaban presentes en el to del RNA, para dar origen mRNA funcional (véase fig. 5-1, 5-1, mRNA. Más adelante, el desarrollo de clonación de genes y paso 2). Luego, este mRNA debe ser exportado al citoplasma secuenciación del DNA (véase capítulo 6) permitió a los in- antes de que pueda ser traducido a proteína. Por consiguiente, la vestigadores comparar las secuencias de DNA genómico de transcripción y la traducción no pueden ser concurrentes en organismos multicelulares con las secuencias de sus mRNA. las células eucariontes. Esta investigación reveló que la mayoría de los mRNA ce-- Todos los pre-mRNA eucariontes son modificados ini- lulares también son codificados en varias regiones separa-- cialmente en los dos extremos, y estas modificaciones se das de DNA genómico, denominadas exones, separadas por conservan en los mRNA. A medida que el extremo 5’ de una secuencias de DNA llamadas intrones. Estudios adicionales cadena de RNA naciente emerge de la superficie de la RNA po-- 202 O 5 Mecansmos genétcos CAPÍTULO CAPÍTUL genétcos moleculares moleculares fundamentales fundamentales limerasa, actúan de inmediato sobre él varias enzimas que, en li(A) cumple funciones importantes tanto en la traducción del conjunto, sintetizan el casquete 5’, un 7-metilguanilato que está mRNA como en la estabilización de pre-mRNA en el núcleo conectado con el nucleótido terminal del RNA por un enlace y los mRNA completamente procesados en el núcleo y el cito-- 5’,5’-trifosfato inusual (fig. 5-26). El casquete protege el mRNA plasma. de la degradación enzimática y ayuda en su exportación al cito-- Otro paso en el procesamiento de muchas moléculas dife- plasma, donde se une a un factor proteico necesario para co-- rentes de mRNA eucarionte es el corte y empalme del RNA: la menzar la traducción. escisión interna de un transcripto para eliminar los intrones y El procesamiento en el extremo 3’ de un pre-mRNA im- unir los exones codificantes. La figura 5-27 resume los pasos plica la escisión por una endonucleasa para producir un gru- básicos del procesamiento del mRNA eucarionte utilizando po 3’-hidroxilo libre al que una enzima denominada poli(a) como ejemplo el gen de b-globina. En el capítulo 9, se estu- polimerasa añade una cadena de residuos de ácido adenílico diará la maquinaria celular que lleva a cabo el procesamiento de a uno a la vez. La cola de poli(A) resultante contiene del mRNA, así como del tRNA y el rRNA. 100-250 bases y es más corta en levaduras e invertebrados que Los mRNA eucariontes funcionales producidos por procesa- en vertebrados. La poli(A) polimerasa forma parte de un com-- miento del RNA conservan regiones no codificantes, denomi- plejo de proteínas que pueden localizar y escindir un transcrip-- nadas regiones no traducidas (UTR, regiones no traducidas), to en un sitio específico y, después, agregar el número correcto en cada extremo. En los mRNA de mamíferos, la UTR 5’ de bases A en un proceso que no requiere un molde. Como se puede tener 100 o más nucleótidos de longitud, y la UTR 3’, analiza más en la sección 5.6 del capítulo 10, la cola de po- varios kilobases de longitud. Los mRNA bacterianos tam- bién suelen tener UTR 5’ y 3’, pero estas regiones son mucho más cortas que las de los mRNA eucariontes y, en general, O CH3 6 N+ DNA 1 31 1 32 32 105 106 147 HN1 5 7 7-metilguanilat o genómico de 8 2 4 9 3 N -globina β-globina H2 N N Sitio de iniciación Adición del casquete Sitio de la síntesis de RNA m7Gppp poli(A) 5’ Transcripto 5’ 3’ CH 2 O primario 4’ 1’ de RNA Escisión 3’ y adición O H H de la cola de poli(A) − H O P O 3’ 2’ OH OH O Exón (A)n − O P O Unión 5’ 5’ Intrón Cola de poli(A) O − O P O UTR O Casquete (A)n 5’ CH 2 O Base 1 m7Gppp cap 4’ 1’ H H Eliminación de intrones H H 3’ 2’ Corte y empalme de exones O O CH H3 − O P O mRNA de β-globina (A)n O 1 147 47 CH2 O Base 2 FIGURA 5-27. Re Ressumen de del pr proce cessamie ient nto o de RNA. El proc del RN ocesa esa-- H H miento del RNA produce mRNA funcional en los eucariontes. El gen H H de b -glo lobbina contien contiene e tres tres exon exones es codi codiffica cantes ntes de pro protteí eínas nas (que (que constituyen la región de codificación) y dos intrones no codificantes O O CH3 − interpuestos. Los intrones interrumpen la secuencia de codificación O P O de la proteína entre los codones para los aminoácidos 31 y 32, y 105 y 106. La transcripción de genes que codifican proteínas de eucariontes comienza antes de la secuencia que codifica el primer aminoácido y se FIGURA 5-26. Estruc Estructura tura del casquete 5’ meti lado.. Las car metilado caraacte te-- extiende más allá de la secuencia que codifica el último aminoácido, rísticas químicas distintivas del casquete 5’ metilado del mRNA euca- lo que da por resultado regiones no codificantes en los extremos del rionte son (1) el enlace 5’ → 5’ de 7-metilguanilato con el nucleótido transcripto primario. Estas regiones no traducidas (UTR) se conservan inicial de la molécula de mRNA y (2) el grupo metilo del hidroxilo 2’ durante el procesamiento. El casquete 5’ (m7Gpp pppp) se se agre agrega ga dur durante ante de la ribosa del primer nucleótido (base 1). Estas dos características la formación del transcripto primario, que se extiende más allá del se observan en todas las células animales y en las células de plantas sitio poli(A). Después de la escisión en el sitio poli(A) y la adición de superiores; las levaduras carecen del grupo metilo en el nucléotido 1. múltiples residuos A al extremo 3’, el corte y empalme elimina los La ribosa del segundo nucleótido (base 2) también está metilada en intrones y une los exones. Los números pequeños hacen referencia a los vertebrados. Véase A. J. Shatkin, 1976, Ce Celll 9:645 45.. posiciones de la secuencia de 147 aminoácidos de la b - globiglobinna. 5.4 Transcripción de genes codificantes de proteínas y formación de mRNA 203  Gen de fibronectina EIIIB EIIIA mRNA de fibronectina 5’ 3’ de fibroblastos mRNA de fibronectina de hepatocitos 5’ 3’ FIGURA 5-28. Cor orte te y empalme alter alternativo. El gen nativo gen de fib fibrone ronecctina los fibroblastos incluye los exones EIIIA y EIIIB, mientras que estos exo-- de ~75 kb kb (arr (arriba iba)) contie contiene ne múltip múltiplles exon exones; es; el el cor corte te y emp empalm alme e del del nes son cortados del mRNA de fibronectina en los hepatocitos. En este transcripto de fibronectina varía según el tipo celular. Los exones EIIIB y diagrama, los intrones (líneas negras en el diagrama superior del gen de EIIIA (verde) codifican dominios de unión para proteínas específicas de fibronectina) no están dibujados a escala; la mayoría de ellos son mu-- la superficie de los fibroblastos. El mRNA de fibronectina producido en cho más largos que cualquiera de los exones. contienen menos de 10 nucleótidos. Como se considera en el plasmática de los fibroblastos. En consecuencia, esta isoforma capítulo 9,, las secuencias de la UTR 5’ y UTR 3’ participan en de fibronectina adhiere fibroblastos a la matriz extracelular. la regulación de la traducción y la estabilidad del mRNA, y las En los hepatocitos, el tipo principal de célula hepática, el corte UTR 3’ también actúan en la localización de muchos mRNA y empalme alternativo del transcripto primario de fibronec- en regiones específicas del citoplasma. tina produce mRNA que carece de los exones EIIIA y EIIIB. Por consiguiente, la fibronectina secretada por hepatocitos a la sangre no se adhiere estrechamente a los fibroblastos ni El corte y empalme alternativo aumenta a la mayoría de los otros tipos de células, lo que le permite el número de proteínas que pueden ser circular. Sin embargo, durante la formación del coágulo san- expresadas por un único gen eucarionte guíneo, otros dominios de unión a fibrina de la fibronectina de los hepatocitos se unen a fibrina, uno de los principales La vasta mayoría de los genes de eucariontes multicelu-- componentes de los coágulos sanguíneos. Después, otro do- lares están compuestos por múltiples exones separados por minio de la fibronectina unida interactúa con integrinas de intrones. Como se observó en el ca capítu lo 3, mucha pítulo muchass prote proteíí- las membranas de las plaquetas circulantes, lo que expande el nas de eucariontes superiores tienen una estructura terciaria coágulo por adición de plaquetas. multidominio (véase fig. 3-10 3-10)) y, y, a menu menudo, do, los los límite límitess entre entre Se han identificado más de 20 isoformas diferentes de fibro-- los dominios proteicos corresponden a la unión entre exones nectina, cada una codificada por un mRNA distinto cortado y del gen subyacente. Esta tendencia de los exones a corres-- empalmado en forma alternativa compuesto por una combi-- ponder a dominios plegados independientes de la proteína nación singular de exones del gen de fibronectina. La secuen-- codificada hace pensar que muchas proteínas eucariontes ciación de grandes cantidades de mRNA aislados de diversos han surgido por eventos de recombinación genética que re-- tejidos y la comparación de sus secuencias con el DNA genómi-- únen los exones en nuevas combinaciones, un proceso cono-- co han revelado que casi el 90% de los genes humanos se expre-- cido como intercambio de exones. san como mRNA cortados y empalmados en forma alternativa. En todo este libro, se presentarán muchos ejemplos de pro- Evidentemente, el corte y empalme alternativo del mRNA ex-- teínas de mamíferos que contienen múltiples copias repetidas pande mucho el número de variantes de proteínas codificadas de un dominio proteico con secuencias de aminoácidos idénti- por los genomas de organismos multicelulares superiores. cas o casi idénticas. Es evidente que estas secuencias surgieron por eventos de recombinación que condujeron a una cadena de múltiples copias del mismo exón separado por intrones. La presencia de múltiples intrones en los genes permite la ex- presión de numerosas variaciones de la proteína por un único CONCEPTOS CLAVE DE LA SECCIÓN 5.4 gen mediante corte y empalme alternativo. En eucariontes su- periores, el corte y empalme alternativo es un mecanismo im- Transcripción de genes codificantes de portante de producción de diferentes formas de una proteína, denominadas isoformas, por distintos tipos de células. proteínas y formación de mRNA La fibronectina, una proteína multidominio hallada en ma- La transcripción del DNA es llevada a cabo por la RNA míferos, representa un buen ejemplo de corte y empalme al- polimerasa, que agrega un ribonucleótido por vez al ex- ternativo (fig. 5-28). La fibronectina es una proteína adhesiva tremo 3’ de una cadena de RNA en crecimiento (véase fig. larga secretada al espacio extracelular y que puede unir a otras ). La secuencia de la hebra molde de DNA determina 5-23). proteínas. Qué une y dónde lo hace depende de qué dominios el orden en que se polimerizan los ribonucleótidos para son cortados y empalmados entre sí. El gen de fibronectina formar la cadena de RNA. contiene numerosos exones, agrupados en varias regiones correspondientes a dominios específicos de la proteína. Los Durante la iniciación de la transcripción, la RNA po- fibroblastos producen mRNA de fibronectina que contienen limerasa se une a un sitio específico del DNA (el promo- exones EIIIA y EIIIB; estos exones codifican un dominio pro- tor), desnaturaliza localmente el DNA de doble hebra teico que se une estrechamente a proteínas de la membrana 204 O 5 Mecansmos genétcos CAPÍTULO CAPÍTUL genétcos moleculares moleculares fundamentales fundamentales  tRNA, que están unidos en forma covalente a ese aminoácido para revelar la hebra molde no apareada y polimeriza los y lo transportan el extremo en crecimiento de una cadena po- primeros dos nucleótidos complementarios de la hebra lipeptídica cuando el siguiente codón del mRNA lo solicita. molde. La región desnaturalizada de 12-14 pares de bases En cada paso, se selecciona el tRNA correcto con su aminoá- se conoce como burbuja de transcripción. cido unido, porque cada molécula específica de tRNA con- Durante la elongación de la hebra, la RNA polimerasa tiene una secuencia trinucleotídica, un anticodón, que puede aparear sus bases con su codón complementario del mRNA. se mueve a lo largo del DNA y lo desnaturaliza por delan- te de la polimerasa, de manera que la hebra molde pueda 3. El RNA ribosómico (rRNA) se asocia con un conjunto de ingresar en el sitio activo de la enzima y permitir que las proteínas para formar ribosomas. Estas estructuras complejas hebras complementarias de la región recién transcripta se forman el andamiaje de la alineación escalonada de los codo- renaturalicen detrás de ella. La burbuja de transcripción nes del mRNA con los anticodones del tRNA. El ribosoma se mueve con la polimerasa a medida que la enzima añade también cataliza la formación secuencial de enlaces peptídicos ribonucleótidos complementarios de la cadena molde al entre aminoácidos transportados por tRNA para el ensam- extremo 3’ de la cadena de RNA en crecimiento. blado de una cadena polipeptídica. Los ribosomas están com- puestos por una subunidad grande y una pequeña, cada una de Cuando la RNA polimerasa alcanza una secuencia de las cuales contiene su propia molécula o moléculas de tRNA. terminación en el DNA, la enzima detiene la transcrip- ción, lo que determina la liberación del RNA completado Estos tres tipos de RNA participan en la síntesis de pro- y la disociación de la enzima del DNA molde. teínas en todos los organismos. En esta sección, se considera la decodificación del mRNA por los tRNA y de qué manera la En el DNA eucarionte, cada gen codificante de proteí- estructura de cada uno de estos RNA se relaciona con su na es transcripto a partir de su propio promotor. Muy a tarea específica. En la siguiente sección, se detalla cómo ac- menudo, el transcripto primario inicial contiene regiones túan junto con ribosomas y factores proteicos para sinteti- no codificantes (intrones) interpuestas con regiones codi- ficantes (exones). zar proteínas. Como la traducción es esencial para la síntesis de proteínas, los dos procesos suelen denominarse en forma Los transcriptos primarios eucariontes deben ser someti- someti- dos a procesamiento del RNA para producir RNA funcio-- nales. Durante el procesamiento, los extremos de casi todos Cadena aa1 los transcriptos primarios de genes codificantes de proteí-- polipeptídica aa2 Llegada de nas son modificados por adición de un casquete 5’ y una en crecimiento aa7-tRNA7 H cola de poli(A) 3’. Los transcriptos de genes que contiene aa3 intrones son sujetos a corte y empalme, la eliminación de H2N C aa4 R7 los intrones y la unión de los exones (véase fig. 5-27). Ribosoma H H C O (rRNA) H C R5 N C R6 Los dominios individuales de proteínas multidominio O halladas en eucariontes superiores suelen ser codificados C H C O O O O por exones individuales o un pequeño número de exones. A menudo, distintas isoformas de estas proteínas se ex- presan en tipos celulares específicos como resultado del corte y empalme alternativo de exones. C CA S alida de C C tRNA4 G 5.5 Decodificación del mRNA UUUAUAGGC aa3 GGGA GA A AU AU C G por los tRNA aa7 GU aa2 aa4 aa5 aa6 C Como se comentó en el capítulo 3, el orden lineal de los ami- noácidos de cada proteína determina su estructura tridimen- Codones: aa1 sional y su actividad. La traducción es el proceso completo por el que la secuencia de nucleótidos de un mRNA se utiliza como Movimiento del mRNA molde para unir los aminoácidos de una cadena polipeptídi- mRNA 5’ ca en el orden correcto (véase fig. 5-1, paso 3). En las células 3’ eucariontes, la síntesis proteica tiene lugar en el citoplasma, donde se reúnen tres tipos de moléculas de RNA para cumplir FIGURA 5-29. Tres funciones funcione s del RNA en la sín s íntesis tesis de pro- pro - teínas. El RNA R NA mens m ensaj ajero ero (mR (mRNA) NA) es tra tr a duci ducidd o a proteín pro teínaa por p or la la funciones diferentes pero cooperativas (fig. 5-29): acción conjunta del RNA de transferencia (tRNA) y el ribosoma, que 1. El RNA mensajero (mRNA) transporta la información está compuesto por numerosas proteínas y tres (bacterias) o cuatro genética transcripta del DNA en forma lineal. El mRNA se lee (eucariontes) moléculas de RNA ribosómico (rRNA) (no mostrado). en conjuntos de secuencias de tres nucleótidos, denominadas Obsérvese el apareamiento de bases entre los anticodones del codones, cada una de las cuales especifica un aminoácido en tRNA y los codones complementarios del mRNA. La formación de particular. un enlace peptídico entre el grupo amino N del aa-tRNA entrante y el C terminal (carboxilo terminal) de la cadena proteica en creci-- 2. El RNA de transferencia (tRNA) es la clave para descifrar miento (verde) es catalizada por uno de los rRNA. aa= aminoácido; los codones del mRNA y sirve como adaptador para vincular R = grupo lateral. Obsérvese que estos son diagramas simplificados tres bases de la secuencia de RNA a un determinado aminoá- de los tRNA y las subunidades ribosómicas. Sus estructuras reales cido. Cada tipo de aminoácido tiene su propio subconjunto de se muestran en las f i g u r a s 5-32 b y 5 -35 5 -32b -35.. 5.5 Decodificación del mRNA por los tRNA 205 indistinta. Sin embargo, las cadenas polipeptídicas resultantes metionina. En las bacterias, se utiliza una forma especiali-- de la traducción deben ser sometidas a otros pasos después de zada de metionina con un grupo formilo unido a su grupo la traducción, incluidos plegamiento y, a menudo, otros cam- amino. En la mayoría de los mRNA, el co codó dón n de inic inicia ia-- bios (p. ej., modificaciones químicas, asociación con otras ca- ción que espec especif ifica ica esta metio metioni nina na ami mino- no-te termi rmina nall es es AUG. AUG. denas) requeridos para la producción de proteínas maduras, En algunos mRNA bacterianos, se emplea GUG como codón funcionales (véase capítulo 3). de iniciación, y en ocasiones, se utiliza CUG como codón de iniciación en eucariontes. Los tres codones UAA, UGA y El RNA mensajero transporta información del UAG no especifican aminoácidos, sino que constituyen codones de terminación que marcan el extremo carboxilo DNA en un código genético de tres letras de las cadenas polipeptídicas en casi todas las células. La Como se mencionó antes, el código genético usado por las secuencia de codones que se extiende entre un codón de células es un código de tripletes, en el que cada secuencia de iniciación específico y un codón de terminación se deno-- tres nucleótidos, o codón, se lee a partir de un punto inicial mina marco de lectura. Esta disposición lineal precisa de especificado en el mRNA. De los 64 codones posibles del có- ribonucleótidos en grupos de tres en el mRNA especifica digo genético (uno de cuatro nucleótidos en cada una de las la secuencia lineal precisa de aminoácidos de una cadena tres posiciones de un codón da origen a 4 ´ 4 ´ 4 = 64 co- polipeptídica y también señala dónde se inicia y termina la dones posibles), 61 especifican aminoácidos individuales, y 3 síntesis de la cadena. son codones de terminación. El cuadro 5-1 muestra que la La gran utilidad de la tabla del código genético es que mayoría de los aminoácidos son codificados por más de un permite deducir la secuencia de aminoácidos de la proteí-- codón. Solo dos –metionina y triptófano– tienen un solo co- na codificada a partir de la secuencia de un mRNA. Como dón; en el otro extremo, la leucina, la serina y la arginina son el código genético se lee como una secuencia continua de especificadas, cada una, por seis codones diferentes. Se dice codones (tripletes) sin divisiones entre ellos, un mRNA en que los distintos codones que codifican un aminoácido indivi- particular podría, teóricamente, ser traducido en tres mar-- dual dado son sinónimos. El código en sí mismo se denomina cos de lectura diferentes (fig. 5-30). Una vez que se conoce degenerado, lo que significa que un determinado aminoácido la secuencia de un mRNA (en general, determinada a par-- puede ser codificado por varios codones. tir de la secuencia de DNA del gen transcripto), es necesa-- En las células procariontes y eucariontes, la síntesis de to-- rio determinar cuál de los tres posibles marcos de lectura das las cadenas polipeptídicas comienza con el aminoácido es traducido por el ribosoma a la secuencia proteica. En CUADRO 5-1 Código genétic genético o (c (codones odones par paraa aminoácidos)* Segunda posición U C A G Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C U Leu Ser Terminación Terminación A Leu Ser Terminación Trp G Leu Pro His Arg U Primera posición (extremo 5’) Tercera posición (extremo 3’) Leu Pro His Arg C C Leu Pro Gln Arg A Leu (Met)* Pro Gln Arg G Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C A Ile Thr Lys Arg A Met (inicio) Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C G Val Ala Glu Gly A Val (Met)* Ala Glu Gly G *AUG es el codón de iniciación más común; GUG suele codificar valina; y CUG, leucina, pero rara vez estos codones también pueden codificar metionina para iniciar una cadena proteica. 206 O 5 Mecansmos genétcos CAPÍTULO CAPÍTUL genétcos moleculares moleculares fundamentales fundamentales  Marco 1 desplazará el marco de lectura. Un cambio de este tipo de 5’ GCU UGU UUA CGA AUU AA mRNA la secuencia, conocido como mutación del marco de lectu- lectu- ra, determinaría una secuencia de aminoácidos mezclada Ala Cys Leu Arg Ile Polipéptido 1 con terminación prematura de la proteína. A menos que la mutación del marco tuviera lugar cerca del final de la Marco 2 secuencia codificante, la consecuencia probable sería una 5’ G CUU GUU UAC GAA UUA A mRNA pérdida completa de la función. El código genético mostrado en el cuadro 5-1 se conoce como Leu Val Tyr Glu Leu Polipéptido 2 código universal, porque el significado de cada codón es el mismo en la mayoría de los organismos conocidos, evidencia Marco 3 firme de que la vida sobre la Tierra evolucionó solo una vez. 5’ GC UUG UUU ACG AAU UAA mRNA Los 20 aminoácidos no se distribuyen entre los 61 codones codificantes de manera aleatoria, y la estructura de base Leu Phe Ser Tyr Stop Polipéptido 3 del código universal aporta indicios sobre cómo se desarro-- lló un código óptimo. El patrón más notorio que aparece FIGURA 5-30. Tre ress posibles posible s marcos marcos de lectura lec tura de una secuen- secuen - cuando se considera el código genético en su conjunto es cia de mRNA. Si la la traduc traduccción de la secuenci secuenciaa de mRNA mRNA mostrada mostrada que el cambio de una pirimidina por otra (C → U o U → C) comienza en tres sitios de inicio en dirección 5’ diferentes (no mos-- o el cambio de una purina por otra (G → A o A → G) en la trado), entonces hay tres marcos de lectura superpuestos posibles. primera o la tercera posición suele producir un codón sinó-- En este ejemplo, los codones se desplazan una base a la derecha nimo o cambios a un codón para un aminoácido con pro-- en el marco del medio y dos bases a la derecha en el tercer marco, piedades químicas similares. Como se comentó en la secció sección n que finaliza en un codón de terminación. En consecuencia, la mis-- ma secuencia nucleotídica del mRNA puede especificar diferentes 5.3,, estos estos tipos de de cambio cambioss de de secuen secuencia cia so sonn las las clase clasess más más aminoácidos. En general, el marco de lectura correcto para una frecuentes de errores cometidos durante la replicación del secuencia de mRNA dada puede ser identificada con facilidad como DNA. Evidentemente, el código evolucionó para minimizar el marco de lectura abierto más largo que no es interrumpido por los efectos deletéreos sobre la secuencia de aminoácidos de codones de terminación. las proteínas de los tipos más frecuentes de mutaciones del DNA. La estructura plegada del tRNA promueve sus principio, esto podría hacerse identificando el codón AUG que es el inicio de la traducción. Sin embargo, en la práctica, funciones de decodificación hallar el codón de iniciación correcto es proclive a error, y Los dos polímeros portadores de información, DNA y el método utilizado con mayor frecuencia consiste en bus-- mRNA, cumplen sus funciones con la flexibilidad de alojar car un marco de lectura abierto largo. La idea en la que se una gran cantidad de secuencias diferentes. Por otra parte, los basa este método es que en las secuencias que no codifican tRNA tienen secuencias fijas específicas que permiten que sus proteínas, incluidos los dos marcos de lectura incorrectos de moléculas se plieguen en una estructura tridimensional que es un mRNA, deben aparecer codones de terminación al azar crucial para su función. Para participar en la síntesis proteica, como 3 de 64 codones y, por ende, los marcos de lectura no una molécula de tRNA debe unirse químicamente a un ami- codificantes deben de tener solo segmentos relativamente noácido en particular a través de un enlace de alta energía, lo cortos (de alrededor de 20 codones de aminoácidos en pro-- que forma un aminoacil-tRNA (fig. 5-31). Enzimas denomi- medio) entre los codones de terminación. Por consiguiente, nadas aminoacil-tRNA sintetasas son responsables de añadir un mRNA dado tendrá dos marcos de lectura interrumpidos el aminoácido correcto a un tRNA dado y, según se descri- por múltiples codones de terminación y, en general, solo birá, lo hacen mediante el reconocimiento de características tendrá un marco de lectura abierto largo no interrumpido particulares de la estructura del tRNA. Durante el proceso de por codones de terminación que representa la secuencia de traducción, un aminoacil-tRNA interactúa con el ribosoma y la proteína codificada. otros factores proteicos, de manera que la secuencia del anti- Un uso relacionado del código genético es deducir el efec-- codón se aparea en forma correcta con un codón del mRNA. to que ejercerá una mutación génica sobre la proteína codi-- Asimismo, todas estas interacciones dependen de la estructura ficada. Para valorar el espectro de posibilidades, imagine el plegada del tRNA (véase fig. 5-29). efecto de mutaciones del codón de serina UCG que ocurre Se han identificado alrededor de 30-40 tRNA diferentes en en el medio de una secuencia codificante de proteína. Una células bacterianas y hasta 50-100 en células animales y vege- mutación que cambie G → A produciría un codón UCA, tales. Por consiguiente, el número de tRNA de la mayoría de que también codifica serina y, por lo tanto, es una mutamuta-- las células supera el número de aminoácidos utilizados en la ción sinónima, que no tendría efecto sobre la función de la síntesis proteica (20), pero es menor que el de codones de ami- proteína codificada. En cambio, una mutación que cambie noácidos del código genético (61). En consecuencia, muchos C → U produciría un codón UUG, que codifica leucina; aminoácidos tienen más de un tRNA al que pueden unirse esta es una mutación de aminoácido (missense mutation) (lo que explica por qué puede haber más tRNA que aminoá- que puede tener un efecto sobre la función de la proteína cidos); además, muchos tRNA pueden aparearse con más de codificada según la importancia de la serina en esa posi-- un codón (lo que explica cómo puede haber más codones que ción para esta. Por otra parte, una mutación que cambie tRNA). C → A produciría UAG, que es un codón de terminación y, y, Inicialmente, las moléculas de tRNA, que tienen 70-80 nu- en consecuencia, causaría una mutación terminadora que cleótidos de longitud, se forman por la transcripción de un finalizará la secuencia proteica en forma prematura y, pro-- gen de tRNA molde. La maduración del transcripto prima- bablemente, causaría una pérdida completa de la función. rio a una molécula de tRNA funcional con estructura tridi- Por último, una adición o sustracción de una o dos bases mensional precisa tiene lugar en tres etapas. La primera es la 5.5 Decodificación del mRNA por los tRNA 207 (a) Aminoácido (Phe) Enlace éster H O de alta energía H2 N C C OH H O H O CH2 OH H2 N C C O H 2N C C O CH2