Biomol 1 y 2 PDF

dNTP 1XFOÜROR  Replicación  Transcripción tRNA...

dNTP 1XFOÜROR  Replicación  Transcripción tRNA DNA rNTP 1ěFOHR &LWRVRO  Procesamiento A del RNA AA AA Aminoácidos mRNA Proteína Aminoacil-tRNA Factores de tRNA sintetasa A traducción AA AA Subunidades ribosómicas  Traducción del mRNA FIGURA 5-1. G eneralidades de cuat cuat ro procesos procesos genétic genét icos os mo- mo - leen un codón de tres nucleótidos del mRNA. Al prepararse para la leculares básicos. En es este te capí ca pítul tulo, o, se consid co nsidereran an los l os tres tr es pro pr o ces esos os traducción, los tRNA son cargados con el aminoácido correcto por que llevan a la producción de proteínas (1-3) y el pro p roces ceso o de rep r eplili-- enzimas denominadas aminoacil-tRNA sintetasas. Los ribosomas, cación del DNA (4). DuD u rante la l a transc tr anscrip ripcc ió iónn de un u n gen ge n co co didiff i ca cante nte las máquinas macromoleculares que traducen el código de mRNA, de proteína por la RNA polimerasa (1), el códi có digo go de d e DNA de d e cuatro cu atro están compuestos por dos subunidades ensambladas en el nu-- bases que especifica la secuencia de aminoácidos de una proteína cléolo a partir de los RNA ribosómicos (rRNA) y múltiples proteínas se copia, o tr trans cribee , a un pre anscrib p recur curss o r de dell RNA R NA mens m ensaj ajero ero (pre ( pre-- mRmRNA) NA) (iz izquier da)). Después del quierda de l tran transpo sporr te al cit itop opla lasma, sma, las las subunida ubunidadesdes mediante la polimerización de monómeros de ribonucleósido trifos-- ribosómicas se asocian con un mRNA y llevan a cabo la síntesis fatos (rNTP). La eliminación de las secuencias no codificantes y otras proteica con ayuda de los tRNA y factores de traducción de proteí-- modificaciones del pre-mRNA (2), denominado denominado en conj conju unto proce ce-- nas. Durante la replicación del DNA (4), que so s o lo tien ti ene e lugar lu gar en e n las samiento del RNA,, produce produce un un mRNA mRNA funciona funcionall que es es tran transporportt ado células que se preparan para la división, se polimerizan monómeros al citoplasma. Durante la tr tra duccción (3), el códi aduc có digo go de d e cuatro cuat ro baseb asess de desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP) para producir dos copias del mRNA es decodificado en el lenguaje de 20 aminoácidos de las idénticas de cada molécula de DNA cromosómico. Cada célula hija proteínas. Los RNA de transferencia (tRNA) son los adaptadores que recibe una de las copias idénticas. En las próximas secciones, se analizarán los procesos básicos nes en el interior de células, herramientas cuya eficacia en la resumidos en la figura 5-1: transcripción de DNA a precurso- terapia génica humana se está investigando en la actualidad. res del mRNA y procesamiento de estos precursores para dar origen a moléculas de mRNA funcional. Después de resumir las funciones del mRNA, el tRNA y el rRNA en la síntesis pro-- 5.1 Estructura de doble hélice del DNA teica, se presentará una descripción detallada de estos y otros componentes en los pasos bioquímicos de la traducción. El DNA y el RNA tienen estructuras primarias muy si-- milares: ambos son polímeros lineales compuestos por solo La sección final del capítulo presentará información básica cuatro nucleótidos diferentes. Recuérdese del ca capí píttul uloo 2 qu quee acerca de los virus: parásitos que aprovechan la maquinaria todos los nucleótidos consisten en una base orgánica unida celular para la replicación del DNA, la transcripción y la sín-- a un azúcar de cinco carbonos que tiene un grupo fosfato tesis de proteínas. Además de ser patógenos significativos, unido al carbono 5’. Si bien son similares desde el punto de los virus son modelos importantes para estudiar estos meca-- vista químico, los polímeros de DNA y RNA de las células nismos celulares de síntesis macromolecular y otros procesos poseen estructuras tridimensionales bastante distintas. El celulares. Hoy en día, los virus continúan dando lecciones DNA celular existe como dos hebras largas, perfectamente importantes de biología celular molecular y se los ha adap-- complementarias, apareadas por sus bases, que pueden me-- tado como herramientas experimentales para introducir ge-- dir hasta varios cientos de millones de nucleótidos. Por lo 5.1 Estructura de doble hélice del DNA 179 general, los RNA celulares existen como moléculas mucho (a) (b) más cortas (los RNA varían de longitud de alrededor de 20 O- a miles de nucleótidos); suelen ser moléculas de hebra simple Extremo 5’ -O P O C A G que forman pares de bases autocomplementarias. Como se verá, la estabilidad química relativa del DNA y su singular O 3’ 3’ 3’ estructura complementaria redundante lo convierte en una H2C 5’ O C P molécula ideal para el almacenamiento estable de informa-- OH ción genética. H H 5’ 5’ 5’ H H 3’ O H El DNA nativo es una doble hélice de hebras Enlace -O fosfodiéster P O 5’ C-A-G 3’ complementarias antiparalelas O Los cuatro nucleótidos de DNA contienen las bases púri púri-- cas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimídicas citosi citosi-- H2 C 5’ O A na (C) y timina (T) (véase fig. 2-17). Una hebra individual de H H DNA tiene un esqueleto compuesto por unidades repetitivas H H pentosa-fosfato a partir del cual las bases púricas y pirimí-- 3’ dicas se extienden como grupos laterales. (Obsérvese que O H las abreviaturas de una sola letra para estas bases también Enlace -O P O fosfodiéster suelen utilizarse para denotar todos los nucleótidos de los polímeros de ácidos nucleicos). Al igual que un polipéptido, O una hebra de ácido nucleico tiene una orientación química H2C 5’ G O terminoterminal: el extremo 5’ tiene un grupo hidroxilo o fosfato en el carbono 5’ de su azúcar terminal; el extremo 3’ H H suele tener un grupo hidroxilo en el carbono 3’ de su azúcar H 3’ H terminal (fig. 5-2). Esta direccionalidad, más el hecho de que Extremo 3’’ OH H la síntesis siempre procede de 5’ a 3’, ha dado origen a la convención de que las secuencias polinucleotídicas se escri-- ben y se leen en dirección 5’ → 3’ (de izquierda a derecha); FIGURA 5-2. Direccionalidad química de una hebr heb ra de ácido nucleico. Aquí se s e mues mu estrtran an rep re p res resent entaa cio cione ness alt al te rnat rnativ ivas as de unun por ejemplo, se asume que la secuencia ATG es (5’)ATG(3’). DNA de hebra simple que contiene solo tres bases: citosina (C), El enlace químico entre nucleótidos adyacentes, denomina-- adenina (A) y guanina (G). (a) La estructura química muestra do habitualmente enlace fosfodiéster, consiste en realidad en un grupo hidroxilo en el extremo 3’ y un grupo fosfato en el dos enlaces fosfoéster, uno del lado 5’ del fosfato y otro del extremo 5’. Obsérvese también que dos enlaces fosfoéster unen lado 3’. nucleótidos adyacentes; este enlace doble se suele denominar en en-- El conocimiento de cómo podría almacenarse la informa-- lace fosfodiéster. (b (b)) En el e l diagra diag rama ma de d e varill var illas as (arriba (arriba)), los lo s azúc az úcaa res ción genética en la secuencia nucleotídica del DNA comenzó se indican como líneas verticales y los enlaces fosfodiéster son lí-- a tomar forma en 1953, cuando James D. Watson y Francis neas inclinadas; las bases se identifican por sus abreviaturas de una H. C. Crick postularon que el DNA tenía una estructura de sola letra. En la representación más simple (a aba jo)), sol bajo so l o se indi i ndicc an doble hélice. Su propuesta se basó en el análisis de patrones las bases. Por convención, una secuencia polinucleotídica siempre de difracción de rayos X de fibras de DNA generadas por se escribe en dirección 5’ → 3’ (izquierda a derecha), a menos que Rosalind Franklin y Maurice Wilkins, que mostraban que la se indique lo contrario. estructura era helicoidal, y en el análisis de la composición de bases del DNA de múltiples organismos por Erwin Chargaff y cols. Los estudios de Chargaff revelaron que, si bien la com-- posición de bases del DNA (porcentajes de A, T, G y C) varía mucho entre organismos con parentesco distante, el porcen-- naria capacidad del DNA de transportar información deriva taje de A siempre es igual al de T, y el porcentaje de G siempre del hecho de que cada base nucleotídica tiene solo alrededor es igual al de C, en todos los organismos. Sobre la base de de 50 átomos, pero en el contexto de una secuencia de DNA estos descubrimientos y las estructuras de los cuatro nucleó-- puede transportar dos bits de información, mientras que aun tidos, Watson y Crick construyeron modelos moleculares me-- las memorias de ordenadores más avanzadas requieren mu- ticulosos y postularon una doble hélice como estructura del chos miles de átomos para almacenar un bit de información. DNA, con A siempre unida a T por enlaces de hidrógeno y G El DNA consiste en dos hebras polinucleotídicas asociadas siempre unida a C por enlaces de hidrógeno a lo largo del eje que se enrollan para formar una doble hélice. Los dos esque-- central de la doble hélice. letos de azúcar-fosfato se encuentran en la parte externa de La característica más reveladora del modelo de Watson y la doble hélice, y las bases se proyectan hacia el interior. Las Crick fue que cada uno de los cuatro posibles pares de bases bases contiguas de cada hebra se apilan una encima de la encaja dentro de los esqueletos helicoidales precisamente de la otra en planos paralelos (fig. 5-3a). La orientación de las dos misma manera. Por consiguiente, la misma estructura helicoi- hebras es antiparalela; es decir, sus direcciones 5’ → 3’ son dal doble puede alojar cualquier secuencia arbitraria de nu- opuestas. Las hebras se mantienen en un registro preciso por cleótidos. De inmediato, esto llevó a comprender que el DNA formación de pares de bases entre las dos hebras: A se apa- apa- actúa como una molécula de información al transportar in- rea con T a través de dos enlaces de hidrógeno; G se aparea formación genética como una secuencia de cuatro letras A, G, con C a través de tres enlaces de hidrógeno (fig. fig. 5-3b ). Esta 5-3b). C y T, así como la memoria de un ordenador contiene infor- complementariedad de pares de bases es una consecuencia mación codificada como una secuencia de 1 y 0. La extraordi- del tamaño, la forma y la composición química de las bases. 180 O 5 Mecansmos genétcos CAPÍTULO CAPÍTUL genétcos moleculares moleculares fundamentales fundamentales (a) (b) 5’’ O O− P O 3’’ 5’’ CH3 O H HN O N 3’’ HO T NH N A O O O O O− P O H O O HN O − P O O O N C O G NH O NH O H O O− Surco P O O CH3 FIGURA 5-3. La doble hélice del DNA. DNA. (a) Mo Mode dello mayor O P H O − NH O espacial de DNA B, la forma más común de DNA ce- O O N HN T O lular. Las bases (colores claros) se proyectan hacia el A interior desde los esqueletos de azúcar-fosfato (rojo O O y azul oscuro) de cada hebra, pero sus bordes son O − asequibles a través de los surcos mayor y menor. Las P O flechas indican la dirección 5’ → 3’ de ca cada heb hebrara.. O O H O NH O O Los enlaces de hidrógeno entre las bases se encuen- P − O tran en el centro de la estructura. Los surcos mayor y O C N HN G O menor están revestidos de posibles donantes y acep- O HN tores de enlaces de hidrógeno (destacados en amari- Surco menor O H OH llo). (b) Estructura química de la doble hélice de DNA. 3’’ Este esquema extendido muestra los dos esqueletos 3’’ 5’’ O azúcar-fosfato y los enlaces de hidrógeno entre los O pares de bases de Waston-Crick, A·T y G·C. Véase − P O O R. E. Dickerson, 1983, Sc 249::94. (Par Sci.i. Am. 249 (Partte a: dat datos 5’’ de R. Wing et al., 1980, Nature 28787::755, PDB ID 1bma 1bma)). La presencia de miles de estos enlaces de hidrógeno en una la mayoría de los segmentos de DNA de las células. Del lado molécula de DNA contribuye mucho a estabilizar la doble externo de la hélice, los espacios entre las hebras entrelazadas hélice. Las interacciones hidrófobas y de van der Waals entre forman dos surcos helicoidales de diferente ancho, descritos los pares de bases adyacentes apilados estabilizan aún más la como el surco mayor y el el surco menor (véase fig. 5-3a). En estructura helicoidal doble. consecuencia, los átomos de los bordes de cada base dentro de En el DNA natural, A siempre se une por enlaces de hidrógeno estos surcos son asequibles desde la parte externa de la hélice, a T y G a C, lo que forma pares de bases A·T y G·C, como se lo que forma dos tipos de superficies de unión. Las proteínas muestra en la figura 5-4. Estas asociaciones, siempre entre una de unión a DNA pueden leer la secuencia de bases del dúplex purina más grande y una pirimidina más pequeña, a menudo se de DNA contactando átomos en los surcos mayor o menor. denominan pares de bases de Watson-Crick. Watson-Crick. Se dice que dos he- he- Si bien los átomos que enfrentan las superficies de los surcos bras polinucleotídicas, o regiones de ellas, son complementarias mayor y menor difieren entre las cuatro bases, la estructura cuando todos los nucleótidos forman este tipo de pares de bases. global de las hebras entrelazadas de DNA es uniforme inde- Sin embargo, en teoría y en los DNA sintéticos, pueden formarse pendientemente de la secuencia de bases. Cualquier irregula- otros pares de bases. Por ejemplo, la guanina (una purina) teó-- ridad del DNA causada por daño químico o apareamiento ricamente podría formar enlaces de hidrógeno con timina (una erróneo de bases alterará esta estructura uniforme y, como se pirimidina) dentro del espacio disponible en la hélice. De modo verá en la sección 5-3, permitirá que las enzimas de repara- similar, también podría alojar un apareamiento entre adenosina ción del DNA identifiquen el sitio de daño y actúen sobre él. y citosina. Sin embargo, como muestra la figura 5-4, los pares La unión de proteínas a secuencias de DNA específicas pro- de bases no convencionales G·T y A·C se desvían lo suficiente de voca modificaciones importantes en la estructura del DNA la geometría precisa de los pares de bases naturales para ser de forma B convencional. Si bien la multitud de enlaces de excluidos del DNA de doble hebra por la enzima que copia el hidrógeno e hidrofóbicos entre las bases confiere estabilidad DNA, como se describe más adelante en este mismo capítulo. al DNA, la doble hélice es flexible alrededor de su eje longi- Casi todo el DNA de las células adopta la forma de una tudinal. A diferencia de la hélice a de las proteínas (véase fig. hélice dextrógira. El patrón de difracción de rayos X del DNA ), no hay enlaces de hidrógeno paralelos al eje de la hélice. 3-4), indica que las bases apiladas están regularmente espaciadas Esta propiedad permite que el DNA se curve cuando forma un a una distancia de 0,34 nm a lo largo del eje de la hélice. complejo con una proteína de unión a DNA, como el factor La hélice realiza un giro completo cada 3,4 a 3,6 nm, lo que de transcripción TBP (fig. 5-5). La curvatura del DNA tam- depende de la secuencia; por consiguiente, hay alrededor de bién es crucial para el empaquetamiento denso del DNA en 10-10,5 pares de bases por giro. Esta forma helicoidal, de- cromatina, el complejo proteína-DNA en el que está presente nominada forma B del DNA, es la forma normal presente en el DNA nuclear de las células eucariontes (véase capítulo 8). 5.1 Estructura de doble hélice del DNA 181  D + + 1 + 2 1 &+  2 + 1 1 1 1 C 1 + 1 G T 1 + 1 A 1 1 &′′ 1 1 &′′ 2 + 1 2 + &′′ &′′ + E + 1 + &+ 2 + C 1 + 1 1 T 1 + 2 1 1  1 1 1 2 + 1 A 2 + 1 G &′′ 1 &′′ 1 + 1 &′′ &′′ + FIGURA 5-4. (a) Es Estr truc uctu tura ra de de los los pares pares de de base basess A·T A·T y G· G· C conve convenci ncio o- dan en la estructura de doble hélice del DNA. (b) Los pares de bases nales que muestra el ángulo y la distancia entre los enlaces que conec- no convencionales, como G·T y A·C, tienen geometrías de enlaces muy tan las bases con el esqueleto de ribosa-fosfato. Como la geometría de distintas y, por consiguiente, son excluidos del DNA natural por el los pares de bases es casi idéntica, estos dos pares de bases se acomo- mecanismo de copiado de la DNA polimerasa. ¿Por qué el DNA, y no el RNA, evolucionó para convertirse cambio tiene un grupo hidroxilo en la posición 2’ de la ribosa en el portador de información genética de las células? El hi- (véase fig. 2-16). Los grupos 2’-hidroxilo del RNA participan drógeno en la posición 2’ de la desoxirribosa del DNA lo con- en la hidrólisis lenta catalizada por OH– de enlaces fosfodiéster vierte en una molécula mucho más estable que el RNA, que en a pH neutro (como muestra la fig. 5-6). En el DNA, la ausen- cia de grupos 2’-hidroxilo impide este proceso. Por lo tanto, la Proteína de unión a la cajaTATA TATA presencia de desoxirribosa en el DNA lo torna una molécula más estable, una característica crucial para su función de al- macenamiento a largo plazo de información genética. El DNA puede presentar una separación reversible de sus hebras Durante la replicación y la transcripción del DNA, las he- bras de la doble hélice deben separarse para permitir que los bordes internos de las bases se apareen con las bases de los nucleótidos que están polimerizándose en nuevas cadenas polinucleotídicas complementarias. En secciones posteriores, se describirán los mecanismos celulares que separan y después vuelven a asociar las hebras de DNA durante la replicación y la transcripción. Aquí se analizan los factores fundamen- tales que influyen en la separación y reasociación de hebras del DNA. Estas propiedades del DNA fueron dilucidadas me- FIGURA 5-5. La intera interacción cción con con una proteína como TBP puede diante experimentos in vitro. curvar el DNA. El domin dominio C- C-termi rmina nall con conse serr vado de la prot proteeín ínaa de Es posible inducir experimentalmente el desenrollamiento y unión a la caja TATA (TBP) se une al surco menor de secuencias especí- la separación de las hebras del DNA, denominado desnatura- ficas de DNA ricas en A y T, lo que desenrolla y curva profundamente lización o fusión, al aumentar la temperatura de una solución la doble hélice. La transcripción de la mayoría de los genes eucarion-- de DNA. A medida que aumenta la energía térmica, el con- tes requiere la participación de TBP. (Dat Datoos de D.D. B. Nikolov Nikolov y S. K. K. Burl Burley ey,, siguiente incremento del movimiento molecular finalmente 1997, Proc. Nat’l. Nat’l. Acad. USA 94:15, PDB ID 1c Acad. Sci. USA 1cdw dw)). rompe los enlaces de hidrógeno y otras fuerzas que estabilizan 182 O 5 Mecansmos genétcos CAPÍTULO CAPÍTUL genétcos moleculares moleculares fundamentales fundamentales  sorben menos luz ultravioleta (UV) que las bases no apiladas ş2 2 del DNA de hebra simple, y este cambio induce un aumento 3 brusco de la absorción de luz UV. Este fenómeno, conocido ş 2 como hipercromicidad, es útil para controlar la desnaturali- 2 3 2 zación del DNA. &+ 2 %DVHQ 2 Derivado de La temperatura de fusión (Tm) a la que se separan las hebras 2’,3’-monofosfato + + del DNA depende de varios factores. Las moléculas que con- &+ 2 %DVHQ cíclico + + tienen una mayor proporción de pares G·C requieren tempe- + + raturas de desnaturalización más altas, porque los tres enlaces 2 2 + + de hidrógeno de los pares G·C tornan a estas bases más esta- 3 ş2+ ş2 bles que los pares A·T, que solo tienen dos enlaces de hidro- 2 2 + 2 geno. De hecho, el porcentaje de pares de bases G·C de una ş2 3 2  muestra de DNA puede estimarse a partir de su Tm (fig. 5-7b). 5-7b). Asimismo, la concentración de iones de la solución influye en 2 2+ la Tm, porque los grupos fosfato con carga negativa de las dos &+ 2 %DVHQ &+ 2 %DVHQ hebras están protegidos por iones con carga positiva. Cuando la concentración de iones es baja, esta protección disminuye, + + + + lo que aumenta las fuerzas de repulsión entre las hebras y + + + + reduce la Tm. Los agentes que desestabilizan los enlaces de 2 2+ 2 2+ hidrógeno, como formamida o urea, también disminuyen la Tm. Por último, los extremos de pH desnaturalizan el DNA ş2 3 2 ş2 3 2 a bajas temperaturas. A pH bajo (ácido), las bases presen- 2 2 tan protonación y, por consiguiente, adquieren carga positiva repeliéndose entre sí. A pH alto (alcalino), las bases pierden protones y adquieren carga negativa y se repelen entre sí, tam- FIGURA 5-6. Hidrólisis espontánea de RN RNA catalizada catalizada por el grupo bién en este caso debido a sus cargas similares. En las células, 2’-hidroxilo. El grupo grupo 2’- 2’-hidr idro oxi xilo lo del RNA RNA puede actu actuar ar como como un nucnucleó leó-- el pH y la temperatura se mantienen, en su mayor parte, en un filo y atacar el enlace fosfodiéster. El derivado monofosfato 2’,3’ cíclico nivel constante. Estas características de la desnaturalización es hidrolizado aún más a una mezcla de monofosfatos 2’ y 3’. Importa destacar que este mecanismo fácil de hidrólisis de enlaces fosfodiéster no del DNA son muy útiles para manipularlo en un contexto de puede producirse en el DNA, que carece de grupos 2’-hidroxilo. laboratorio. Las moléculas de DNA de hebra simple resultantes de la desnaturalización forman espirales aleatorias sin una estruc- tura organizada. Descender la temperatura, aumentar la con- la doble hélice. Luego se separan las hebras y se apartan por la centración de iones o neutralizar el pH causa que dos cadenas repulsión electrostática de los esqueletos de desoxirribosa- complementarias vuelvan a asociarse en una doble hélice per- fosfato con carga negativa de las dos hebras. Cerca de la fecta. El grado de esta renaturalización depende del tiempo temperatura de desnaturalización, un pequeño aumento y la concentración de DNA y de iones. Dos hebras de DNA de temperatura causa una pérdida rápida, casi simultánea, de las con secuencias no relacionadas permanecerán como espira- múltiples interacciones débiles que mantienen juntas las he- les aleatorias y no se renaturalizarán, pero no impedirán que bras a lo largo de toda la longitud de la molécula de DNA hebras complementarias se encuentren y se renaturalicen. La (fig. 5-7a). Los pares de bases apiladas del DNA dúplex ab- fig. 5-7a). desnaturalización y renaturalización del DNA son la base de (a) DNA de (b) 1,0 hebra simple 100 Fracción de hebra simple Porcentaje de pares G C 80 40% de pares G C 50% de pares G C 60 0,75 40 DNA de doble hebra 20 7m 0,5 0 75 80 85 90 70 80 90 100 110 Temperatura (°C) 7 m (°C) FIGURA EXPERIMENTAL 5-7. El con conte ten nid ido o de de G· G· C af afecta la la te tem - la absorción de luz por esas regiones aumenta casi al doble. La tem- peratura de fusión. La temp tempeeratu ratura ra a la la que se se desnat desnatur urali alizza el el DNA peratura a la cual la mitad de las bases de una muestra de DNA de aumenta con la proporción de pares G·C. (a) La fusión del DNA de doble hebra se ha desnaturalizado se designa Tm (p (po or “te “temp mpeerat ratur uraa de doble hebra puede ser monitorizada por su absorción de luz UV a fusión” [ttempe emperratur aturee of meltin meltingg]) ]).. (b (b)) La Tm es una fu funci nción ón de del conte contenid nido o 260 nm. A medida que se separan regiones del DNA de doble hebra, G·C del DNA; cuanto mayor es el porcentaje de G + C, más alta es la Tm. 5.1 Estructura de doble hélice del DNA 183 (a) Superenrollado (b) Círculo relajado FIGURA EX EXPPERIMEN RIMENTTAL 5- 5-8. 8. La topoisome- topoisome- rasa I alivia el estrés de torsión del DNA. (a) Microfotografía electrónica de DNA viral SV40. Cuando el DNA circular del virus SV40 es aislado y separado de su proteína asociada, el dúplex de DNA se desenrolla y asume la configuración superenrollada. (b) Si se corta un DNA superenro- llado (es decir, se escinde una hebra), las hebras pueden volver a enrollarse, lo que induce pérdida del superenrollamiento. La topoisomerasa I cata- liza esta reacción y también vue uelv sellar los ex lvee a sellar ex- tremos cortados. Todos los superenrollamientos del DNA de SV40 aislado pueden ser eliminados mediante la acción secuencial de esta enzima, lo que produce la conformación de círculo relajado. Para aumentar la claridad, se han simplificado las formas de las moléculas en la parte inferior. (Fotos por cortesía de Laurien Poddet, tomado de A. Kornberg DNA Replicacion, p. 29, W. H. Freeman, New York). la hibridación de ácidos nucleicos, una técnica poderosa uti- replicación típica se mueve a una velocidad de 500 bases por lizada para estudiar el parentesco de dos muestras de DNA, segundo, se introducirían superenrollamientos en el DNA por y para detectar y aislar moléculas de DNA específicas de una delante de la horquilla de replicación en movimiento a una mezcla que contiene numerosas secuencias de DNA diferentes velocidad de 50 por segundo. Para aliviar el estrés de torsión (véase capítulo 6). que causarían los superenrollamientos formados durante la replicación, todas las células contienen topoisomerasa I. Esta enzima se une al DNA en sitios aleatorios y rompe el enlace Las moléculas de DNA pueden adquirir estrés de fosfodiéster en una hebra. Esta rotura de una hebra del DNA torsión se denomina muesca. Luego, el extremo roto se enrolla alrede- dor de la hebra no cortada, lo que determina la pérdida de los Muchos DNA genómicos bacterianos y numerosos DNA vi- superenrollamientos (fig. 5-8b). Por último, la misma enzima rales son moléculas circulares. También se observan molécu- une (liga) los dos extremos de la hebra rota. Otro tipo de las de DNA circular en las mitocondrias, que están presentes enzima, topoisomerasa II, alivia el estrés de torsión del DNA en casi todas las células eucariontes, y en los cloroplastos, pre- sentes en plantas y algunos eucariontes unicelulares. Aunque practicando cortes en ambas hebras de un DNA de doble he- el DNA nuclear eucarionte es lineal, bucles largos de DNA es- bra y, después, realineándolas. tán fijados en el lugar dentro de los cromosomas (véase capí- ). Cada una de las dos hebras de una molécula de DNA tulo 8). circular o de un bucle fijo de un cromosoma eucarionte forma CONCEPTOS CLAVE DE LA SECCIÓN 5.1 una estructura cerrada sin extremos libres y, en consecuencia, está sujeta a estrés de torsión. Estructura de doble hélice del DNA Cuando el DNA está superenrollado o subenrollado, lo que El ácido desoxirribonucleico (DNA), el material genéti- genéti- significa que tiene más o menos giros helicoidales que el DNA co, está compuesto por dos polímeros largos, no ramifica-- lineal de forma B de la misma longitud, el estrés de torsión dos, de nucleótidos. Un nucleótido consiste en una pentosa así producido se alivia cuando la molécula se retuerce sobre fosforilada unida a una purina: adenina (A) o guanina (G), sí misma y forma superenrollamientos (fig. 5-8a). Es posible o a una pirimidina: citosina (C) o timina (T). Los nucleóti-- demostrar una interconversión topológica similar entre giros dos adyacentes de un polinucleótido están unidos por en-- y superenrollamientos por los giros que forma una banda laces fosfodiéster. Toda la hebra tiene una direccionalidad elástica después de ser enrollada entre la punta de los dedos. química con extremos 5’ y 3’ (véase fig. 5-2). Como se verá en la siguiente sección, cuando el DNA se repli- ca, las dos hebras deben desenrollarse; la porción restante de El DNA natural contiene dos hebras polinucleotídicas la molécula ganaría un superenrollamiento por el desenrolla- antiparalelas complementarias enrolladas en una do- miento de cada giro completo de las hebras de la doble hélice, ble hélice dextrógira con las bases del lado interno y los que ocurre cada 10 pares de bases. Como una horquilla de 184 O 5 Mecansmos genétcos CAPÍTULO CAPÍTUL genétcos moleculares moleculares fundamentales fundamentales  Las DNA polimerasas necesitan un molde dos esqueletos de azúcar fosfato del lado externo (véase ). La estructura de doble hélice del DNA es esta- fig. 5-3). y un cebador para replicar el DNA bilizada significativamente mediante enlaces no covalen- Todas las DNA polimerasas tienen los mismos requisitos tes que consisten en enlaces de hidrógeno entre pares de para la síntesis de una nueva hebra de DNA: bases de hebras opuestas y por medio de interacciones i) Un molde de DNA de hebra simple. hidrófobas entre pares de bases adyacentes apiladas per- ii) Un cebador DNA apareado por sus bases con el molde y pendicularmente al eje de la hélice. con un grupo hidroxilo libre en el extremo 3’ del cebador para aceptar un nuevo nucleótido. Los pares de bases de Watson-Crick Watson-Crick convencionales (C·G y A·T) tienen dimensiones casi idénticas y son los únicos pares de bases alojados por la estructura helicoidal Cebador doble nativa. 5ЈЈ 3ЈЈ La unión de proteínas al DNA puede deformar su es- 3ЈЈ 5ЈЈ tructura helicoidal, lo que causa curvatura o desenrolla- miento local de la molécula de DNA. Hebra molde El calor causa la separación (desnaturalización) de las hebras del DNA. La temperatura de fusión (T Tm) del DNA iii) Una fuente de precursores de desoxirribonucleósido 5’-tri- aumenta con el porcentaje de pares de bases G·C. En con- fosfato (dNTP). diciones adecuadas, las hebras complementarias de áci- Con un cebador apareado por sus bases con la hebra mol-- dos nucleicos separadas se renaturalizarán. de, la DNA polimerasa añadirá desoxirribonucleótidos al El superenrollamiento o el subenrollamiento del DNA grupo hidroxilo libre del extremo 3’ del cebador, dirigida por determina que moléculas largas de DNA se retuerzan la secuencia de la hebra molde. La energía para esta reacción sobre sí mismas y formen superenrollamientos (véase proviene de la liberación de difosfato cuando se forma un ). El desenrollamiento del DNA cromosómico du- fig. 5-7). enlace fosfoéster entre el oxígeno 3’ y el fosfato a del dN dNTP rante la replicación generaría un gran número de superen- apropiado. La pirofosfatasa, una enzima que cataliza la esci-- rollamientos, pero enzimas denominadas topoisomerasas sión del PPi libe berrad adoo en do dos mo molé léccul ulaas dede fo fosf sfa ato inororggán ániico alivian este estrés de torsión al eliminar los superenrolla- (ffig. 5-9 5-9)), imp impuuls lsaa aú aún más más el el eq equi uillib ibrrio de lala rea reaccci ció ón hac hacia mientos de las moléculas de DNA. la elongación de la cadena. Después de la adición de un nu-- cleótido, se dispondrá de un nuevo extremo 3’ del cebador para aceptar el siguiente nucleótido. Por consiguiente, la po-- limerización avanza en dirección 5’ → 3’ y conti tin nua uarrá has hastta que el extremo en crecimiento del cebador llegue al final de 5.2 Replicación del DNA la hebra molde. En una célula humana, la información genética codificada en La replicación fiel del DNA cromosómico es crucial para la el DNA reside en 23 pares de cromosomas, y cada cromosoma vida, y las DNA polimerasas han evolucionado para replicar está formado por una molécula helicoidal de doble hebra, de el DNA con una velocidad y una fidelidad extraordinarias. cientos de millones de nucleótidos de longitud. Cuando se divi-- Una DNA polimerasa típica puede añadir un nucleótido in- den las células, cada una de las dos células hija deben contener dividual a una cadena en crecimiento en alrededor de 2 mi- exactamente la misma información genética que la célula ma-- lisegundos, pero esto no otorga mucho tiempo para que la dre. Por consiguiente, cada división celular debe acompañarse polimerasa discrimine entre un nucleótido con apareamiento de la copia exacta de la secuencia de DNA de cada cromosoma de bases correcto o incorrecto. Si la fidelidad de la polime- mediante un proceso conocido como replicación del DNA. Una rasa se basara solo en la diferencia de energía entre el par de característica clave de la estructura de doble hélice del DNA nucleótidos con enlaces de hidrógeno correctos o incorrectos, que advirtieron de inmediato Watson y Crick fue que las reglas esta enzima cometería por lo menos un error cada 50 nucleó- invariables del apareamiento de bases (A con T y G con C) tidos. Se logra un grado de fidelidad mucho más alto porque significaban que cada hebra de un polímero de DNA era por-- el sitio activo de la polimerasa solo aloja los pares de bases tadora de la misma información en forma complementaria. con la geometría exacta de un par de bases de Watson-Crick La implicación era que podía lograrse la replicación del DNA normal, mientras que rechaza las geometrías de pares de bases separando las dos hebras del polímero de DNA y, luego, uti-- no convencionales, aunque solo presenten ligeras diferencias lizar cada hebra como molde en la síntesis de nuevas hebras (véase fig. 5-4). Utilizando este tipo de selección geométrica, complementarias, lo que producía dos copias de doble hebra la mayoría de las polimerasas pueden lograr una fidelidad de la duplicadas de la molécula de DNA original. incorporación inicial de nucleótidos que produciría tasas de El conocimiento del mecanismo bioquímico de copia del DNA error de alrededor de1 nucleótido incorrecto por 104 (10 000) provino del aislamiento de la primera enzima DNA polimerasa nucleótidos polimerizados. dirigida por moldes de extractos de células de Escherichia coli En la mayoría de los organismos, la fidelidad de la repli-- por Arthur Kornberg y cols. en 1956. Si bien ahora se sabe que la cación del DNA es de alrededor de 1 error cada 109 (mi mill enzima aislada conocida como DNA polimerasa I participa en millones) de nucleótidos incorporados en una hebra en cre-- la reparación del DNA y no en la replicación del cromosoma de cimiento, mucho mayor de lo que puede explicar la selectivi-- E. coli, todas las DNA polimerasas dirigidas por molde operan dad máxima del apareamiento de bases. En gran medida, esta con las mismas reglas fundamentales. Las lecciones aprendidas notable exactitud se debe a la cor orrrec eccció n por DNA ión DNA pol polim imee- del estudio de la DNA polimerasa I han probado ser universales. rasas. La corrección depende de la act ctiivi viddad de ex exon onuucl cleeas asaa 5.2 Replicación del DNA 185  9 FIGURA 5-9. El DNA DNA se se si sint nte etiza en en di dire cciión 5’ → 3’ a pa recc partir de de Crecimiento 5’3’ precursores dNTP. Los tres tres requ requisitos isitos par paraa la sínt síntesi esiss de DNA DNA son son de la hebra de DNA una hebra cebadora con un extremo 3’ libre, una hebra molde que aparee sus bases con el cebador y una fuente de desoxirribonucleósi- 2 7 $ dos trifosfatos (dNTP). La DNA polimerasa actuará sobre este sustrato 2 99 para añadir un nuevo dNTP al extremo 3’ de la hebra cebadora según + + especifique el apareamiento de bases entre la base añadida y la hebra molde de DNA. La DNA polimerasa cataliza la formación de un enlace + + + 2 fosfodiéster entre el oxígeno 3’ de la hebra cebadora y el fosfato a de un dNTP correctamente apareado por sus bases. Las nuevas hebras −2 3 2 de DNA siempre se sintetizan en dirección 5’ → 3’ y tienen pol polarid aridad ad opuesta a la de las hebras molde de DNA. $ 7 2 2 + + + + 3’ → 5’ de alglgu una nass DN DNA pol poliime merras asaas. Cua uanndo se in inco corrpo porra + 2 una base incorrecta durante la síntesis de DNA, no se produ-- ce el apareamiento de bases entre el nucleótido 3’ de la hebra Hebra molde de DNA −2 3 2 naciente y la hebra molde. En consecuencia, la polimerasa * 2 se detiene y luego transfiere el extremo 3’ de la cadena en & crecimiento a su sitio exonucleasa, donde se elimina la base 2 incorrecta mal apareada (ffig 10)). De ig.. 5-10 Desp spuués és,, el extrtreemo 3’ + + vuelve a ser transferido al sitio polimerasa donde esta región + 99 + se copia correctamente. La mayoría de las DNA polimera-- + 2+ sas requieren un alto grado de fidelidad y, por consiguiente, 3ROLPHUL]DFLĂQ tienen capacidad de corrección. Por ejemplo, las tres DNA 2 2 2 polimerasas de E. col colii tien eneen cor corrrec eccció iónn po por act activiviida dadd de de ex exo - $ 7 α β γ nucleasa 3’ → 5’. 2 2 3 2 3 2 3 2− + + 2− 2− 2− El DNA dúplex se desenrolla y se forman + + + 2+ las hebras hijas en la horquilla de replicación dNTP entrante del DNA Para que el DNA dúplex funcione como molde durante la $ replicación, las dos hebras entrelazadas deben desenrollarse, o separarse, a fin de que sus bases estén disponibles para el apareamiento con las bases de los dNTP que se polimerizarán en las hebras hijas recién sintetizadas. Enzimas denominadas helicasas llevan a cabo este desenrollamiento de las hebras del DNA parental. El desenrollamiento comienza en segmentos 7 de la molécula de DNA denominados orígenes de replicación, 99 5’ 5’ Dedos Pulgar Dedos Pulgar Hebra Pol en crecimiento Pol Palma 5’ Palma 5’ 3’ 3’ 3’ Hebra molde 3’ Exo Exo FIGURA 5-10. Cor orrección polimerasa. Todas las rección por la DNA pol las DNA DNA po po- para la polimerización del siguiente nucleótido, y la polimerasa se detie-- limerasas tienen una estructura tridimensional similar, que se asemeja ne. Como el extremo 3’ de la hebra cebadora no tiene apareamiento de a una mano derecha semiabierta. Los “dedos” se unen al segmento de bases estables con el molde, es libre de moverse al sitio exonucleasa hebra simple de la hebra molde, y la actividad catalítica de la polimerasa 3’ → 5’ (Exo) alrededor de 3 nm más lejos, donde se elimina la base mal (Pol) reside en la unión entre los dedos y la “palma”. En tanto se unan los apareada. Posteriormente, el nuevo extremo 3’, ahora libre del nucléotido nucleótidos correctos al extremo 3’ de la hebra en crecimiento, esta per-- mal apareado, puede formar un par de bases correcto con el molde y manece en el sitio polimerasa. La incorporación de una base incorrecta en puede reanudarse la polimerización. Véase C. M. Joyce y T. T. Steitz, 1995, el extremo 3’ da por resultado un sustrato que no satisface los requisitos J. Bac Bactteriol 17 eriol 7:63 177 632 21, y S. S. Be Bell y T. T. Bake akerr, 199