Biología Celular - Tema 19: Filamentos de Actina (PDF)

TEMA 19. FILAMENTS D’ACTINA 19.1 DROGUES QUE AFECTEN ELS FILAMENTS D’ACTINA I MICROTÚBULS Faloidina i taxol: estabilitzen els filaments, no es poden despolimeritzar i reorganitzar. Permeten analitzar la implicació d’aquests filaments en diferents pofcessos cel·lulars. La faloidina té la capacitat d’...

TEMA 19. FILAMENTS D’ACTINA 19.1 DROGUES QUE AFECTEN ELS FILAMENTS D’ACTINA I MICROTÚBULS Faloidina i taxol: estabilitzen els filaments, no es poden despolimeritzar i reorganitzar. Permeten analitzar la implicació d’aquests filaments en diferents pofcessos cel·lulars. La faloidina té la capacitat d’unir-se molt als filaments d’actina. La faloidina s’uneixen a floròfors per veure els filaments d’actina. 19.2 FILAMENTS D’ACTINA Totes les cèl·lules eucariotes tenen actina al citoplasma, la qual es pot presentar de manera globular/monomèrica o fibrosa/polimeritzada. Cada molècula d’actina globular està associada a un ió calci, que estabilitza la seva configuració globular, i a una ATP. Funcions: • Moviment cel·lular • Forma cel·lular. És important per a mantenir la forma de l’epiteli. • També participa en el transport, en processos d’endocitosi (fagocitosi...). Diàmetre: 5-9nm. 242 Formacions de gel, tridimensionals i aparentment desordenada. Es troba al cortex de la cèl·lula i permet la movilitat cel·lular. També es pot unir formant feixos contractils antiparalels (contractile bundle) o paral·lels (tight parallel bundle). Serveixen per a fixar la cèl·lula i avançar cap un lloc. Formen també altres estructures en forma de xarxa amb ramificacions per a empènyer la cèl·lula cap un lloc... 19.3 ESTRUCTURA DELS FILAMENTS D’ACTINA Els filaments d’actina estan formats d’actina polimeritzada. Subunitats dels filaments d’actina estan foramdes per monòmers units a ADP o ATP. La unió d’aquest nucleòtid a la proteïna (actina) està desplaçada, cosa que genera polarització: hi ha un extrem positiu i un de negatiu. Protofilaments tenen 2 extrems, + i -. Filaments són 2 protofilaments units enrotllats de manera helicoïdal (fibres d’uns 4nm de diàmetre, enrotllats en una hèlix de 13,5 molècules per volta). La velocitat d’unió de monòmers en l’extrem positiu és més ràpid que en l’extrem negatiu. Polimeritza més en l’extrem +. L’actina soluble del citosol està en forma d’ATP. Quan la subunitat d’actina s’uneix al protofilament, comença a hidrolitzar-se l’ATP a ADP. Quan forma part del protofilament, l’actina que s’ha incorporat més tard ja estarà en forma d’ADP. 19.4 DINÀMICA DE POLIMERITZACIÓ DE L’ACTINA Recanvi rotatori. Actina (G-actina: actina globular, la proteïna soluble que es troba al citosol). Concentració alta d’actina soluble al citosol, unida a ATP. Perquè polimeritzi, cal formar un nucli de polimerització. Fins que no s’uneixen 3 proteïnes d’actina, no es pot donar la polimerització del protofilament. Quan s’incorpora al filament, l’ATP es comença a hidrolitzar en forma d’ADP. 243 Arriba un moment en què s’arriba a una fase estacionària i hi ha un equilibri de unió i dissociació de monòmers del filament, a la mateixa velocitat, tant a l’extrem positiu com a l’extrem negatiu. Es manté estable. L’ATP afecta la concentració crítica: concentració per sota de la qual no s’incorporen nous monòmers. L’extrem negatiu té una concentració crítica molt més alta. La incorporació de monòmers de l’extrem negaiu és molt més lenta. Arriba un punt en què l’ATP dels monòmers d’aquell extrem s’hidrolitzen, i augmenta la concentració crítica. En canvi, com que l’extrem + té concentració crítica més baixa, es van unint encara que hi hagi pocs monòmers. Quan la concentració és menor que la del – però prou alta per ser superior a la concnetració crítica de l’extrem +, es dissocien monòmers del – i se n’incorporen pel +. Això és el recanvi rotatori. Per un extrem decreix i per l’altre augmenta. Es manté la llargària del filament, trobant-se en un estat estacionari. Treadmilling. Veiem les fases de nucleació, elongació i estat estacionari del filament d’actina. De l’extrem positiu també es dissocien monòmers, però se n’incorporen més ràpid. També es podria mantenir un estat estacionari 244 sense recanvi rotatòri, si la concentració és major a la crítica dels dos extrems, i els dos es dissocien i se n’incorporen. 19.5 PROTEÏNES ACCESSÒRIES Sense les proteïnes accessòries no farien res els filaments d’actina; aquestes permeten que polimeritzin en llocs concrets de la cèl·lula... Els filaments d’actina tenen centres de nucleació distribuïts per tota la cèl·lula. Les proteïnes de nucleació de l’actina són els complex Arp2/3. Complexe nucleador d’actina que unirà els monòmers d’actina. S’uneix a l’extrem negatiu, i a partir d’aquí es formarà el filament d’actina. Extrem positiu: barbed end. Negatiu: pointed end. En un filament d’actina es pot unir un Arp2/3 enmig del filament i fer que en creixi un altre a partir de llavors, per a formar branques/xarxa. Sempre es disposa de manera que formen 70 graus. Ara ja no s’ha de formar de manera espontània el nucli de nucleació/polimerització del filament d’actina; l’organitzaran allà on hi hagi el complex Arp2/3. Així, no surten tots els filaments d’un sol nucli com centrosoma. De fet, a diferència de la tubulina, hi ha múltiples llocs de polimerització, que contenen unes quantes proteïnes accessòries que permeten nuclear o sintetitzar els microfilaments d’actina. El creixement no segueix una disposició radial, sinó que és desorganitzat. A vegades es donen ramificacions degudes a proteïnes d’ancoratge, que donen lloc a nous centres d’organització. 245 Els bacteris també utilitzen un mètode similar. Tenen proteïnes a la seva coberta (ActA) que interaccionen amb Arp2/3, que s’activarà per a començar a formar filaments d’actina. La cofilina despolimeritza els filaments d’actina que estan amb ADP (els vells). Els nous van polimeritzant i tenen ATP. Però els més vells de la xarxa es despolimeritzen per a tenir recnavis per a formar-ne de nous, més llunyans en la xarxa perquè, per exemple, la cel·lula pugui avançar. La formina actua com a dímer. És una proteïna accessòria que s’uneix a l’extrem positiu perquè polimeritzi. En comptes de formar xarxes, forma feixos d’actina rectes a prop de la membrana. Algunes proteïnes regulen la polimerització d’actina. Segresten els monòmers d’actina per baixar la concentració de subuintats solubles i impedeix que s’uneixin als extrems del filament. Timosina eviten que s’uneixin a l’extrem positiu. En canvi, la profilina fa el contrari. S’uneixen als monòmers d’actina per fer que s’uneixin a l’extrem positiu. Impedeix que s’uneixin a l’extrem positiu, però que s’uneixin al positiu. La profilina s’activa amb un estímul. Està regulat per fosforilació. 246 La tropomiosina estabilitza el filament d’actina. Les proteïens capping s’uneixen a l’extrem positiu i impedeixen que l’extrem polimeritzin i despolimeritzin. Estabilitzen, doncs, els filaments. En canvi, la tropomodulina estabilitza l’extrem negatiu (s’uneix a aquest extrem perquè no des/polimeritzin. Els filaments poden formar feixos contràctils o no contràctils. Hi ha porteïnes que uneixen els filaments entre ells, algunes perquè quedin més propers (fimbinina) i altres menys compactes (actinina). Unió filaments a la membrana plasmàtica: espectrina o ERM. 247 Filamina: (dímer) encreua els filaments d’actina, fent que tinguin un estructura de gel. Espectrina (tetràmer) manté l’estructura de la membrana cel·lular, unint actina. Actinines i fimbrines uneixen filaments d’actina. L’actinina n’uneix de manera antiparal·lela: un +...-, el següent/del costat -....+... Forma una estructura més laxa (espai entre filaments més ampli), de manera que la miosina II podra unir-se entre els dos filaments. La fimbrina, en canvi, forma una estructura més compacta, i la miosina no pot enganxar-s’hi; i és que aquestes estructures fan diferents funcions. Disposa els filaments de manera paral·lela. Algunes fan que els filaments d’actina s’ancorin a llocs concrets de la membrana perquè, si cal, es doni l’endocitosi. La filamina entrecreua diferents filaments d’actina, formant una xarxa en el còrtex cel·lular (sota la membrana plasmàtica. També són importants en el moviment perquè forma filipodis. Miosines: família de proteïnes formades per dues subunitats pesades. Tenen caps polars. Són proteïnes motores que tenen un lloc d’unió a l’actina, a altres proteïnes o a membranes cel·lulars. Es mouen del pol negatiu de l’actina al positiu, amb excepció de la miosina VI. Participen en la contracció de les fibres d’estrès. 248 Té forma de dímer: està formada per dues cadenes pesades unides en una cadena helicoidal, 2 caps polars motors, i dues cadenes lleugeres. Són ATPases, i la seva activitat catalítica resideix a la part glubular (extrem N-terminal). Una fibra de miosina està formada per n monòmers de miosia, de manera que té múltiples caps. Les cadenes pesades s’uneixen formant el coiled-coil: repeticions d’AA hidrofòbics, que contacten amb els AA hidrofòbics de l’altre cadena i s’uneixen. Amb gast d’ATP, les miosines poden moure vesícules, proteïnes, molècules. En un filament d’actina, les miosines poden unir proteïnes, tals com riboproteïnes (uneixen RNA), i transportar RNA a llocs concrets de la cèl·lula per a formar una proteína en aquella regió. També intervé en el còrtex perquè es donin processos d’endocitosi. Ja que estan unides a la membrana plasmàtica. 249 Funcions dels tipus I, II i V de miosina en la imatge superior. Contracció muscular: hi intervé la miosina. Els músculs estan formats per fibres musculars, que estan formades per cèl·lules polinuclears (tenen molts nuclis). Dins les cèl·lules musculars hi han les miofibril·les. Es tracten de feixos de filaments d’actina i miosina paral·lels. Aquests últims estan disposats de tal manera que cada filament de miosina (gruixut) queda envoltat per 6 d’actina. Les repeticions contràctils de miofibrilles formen sarcòmers. Citoesquelet altament ordenat. Els sarcòmers estan limitats pel disc Z. Tenen un túbul T que connecta la membrana exterior amb l’exterior. De manera que poden passar ions. Al citosol hi ha miofibril·les, a més de recticle sarcoplasmàtic, un important magatzem de Ca2+. Per a la contracció muscular cal calci i ATP. Quan arriba un potencial d’acció, aquest es transmet a través dels tubuls T i obren canals de voltatge de Ca2+, i permeten l’entrada de calci de 250 l’exterior a l’interior. El reticle sarcoplsamàtic, a l’entrar el Ca, obra canals de calci, perquè surtin al citosol. Augmenten els nivells de calci al citosol: necessàris per a la contracció muscular. Els filaments d’actina i la miosina es col·loquen de la següent manera: Al disc Z s’uneixen els filaments d’actina. Perquè el filament d’actina mantingui la llargària correcte i siguin estables, tenen un cap Z a l’extrem positiu (units, docncs, al disc z). Per a mantenir l’estabilitat dels extrems negatius tenen caputxes de tropomodulina. Les miosines s’associen formant un feix molt gruixut (miosina II muscular), de manera que queden caps polars/motors, en contacte amb els dos filaments d’actina d’ambdós cantons. La dark band són, doncs, miosines. Il la light band: actina. (La interacció entre l’actina i la miosina és gràcies a les proteïnes accessòries tropomiosina i troponina.) El disc Z és un estructura d’ancoratge per a l’actina, que s’hi uneix gràcies a determinades proteïnes. Està formada per desmina, un filament intermedi de la família de les vimentines. Al mig del sarcòmer hi trobem dues fibres de miosina disposades de manera 251 antiparal·lela entre les fibres d’actina. Estan disposades de tal manera que els caps de les miosines (zona catalítica) queden als extrems. Quan es dona la contracció, la miosina es mou cap a l’extrem positiu. Els caps motors viatjaran cap a l’extrem positu, apropant-se al disc z. Però això ho fan els caps d’ambdós cantons. Quan arriba un potencial d’acció, entra Ca2+ i ATP. El calci s’uneix a la troponina, que pateix un canvi de conformació que indueix un desplaçament en la tropomiosina, cosa que fa que quedin lliures (perquè abans quedaven “tapats” per aquestes proteïnes accessòries) els llocs d’unió del filament d’actina amb el cap polar de la miosina. Es desplacen les proteïnes i s’uneixen els caps polars a l’actina per a contraure’s (anar cap al z). Per tant, quan no hi ha calci (o sigui, quan no hi ha contracció muscular), aquests llocs actius/d’interacció queden restrigits/tapats. Un cop lliures, la miosina s’hi uneix en estat de rigor (dit de quan la miosina està unida a l’actina), sense cap nucleòtid (ni ATP ni ADP) unit. Llavors s’enganxa una ATP al cap polar de la miosina, i aquesta perd afinitat per l’actina. S’hidrolitza, s’allibera energia per activar el cap de la miosina, i es mantenen el fosfat i l’ADP units. El cap activat s’uneix a l’actina i s’allibera el fosfat inorgànic, i s’enforteix l’unió. A continuació, s’allibera l’ADP, es dona el cop de força, i el cap de miosina es desplaça pel filament d’actina. Arriba després ATP, es torna a desenganxar el cap de miosina de l’actina i torna a començar. Mentre hi hagi calci i, per tant, els llocs d’unió de l’actina estiguin exposats, es donarà la 252 contracció. S’escurcen les bandes Z i es dona la contracció. Quan es torni a reservar el calci, s’acaba la contracció. El calci fa pics, entra i surt del reticle endoplasmatic. En la imatge, els filaments més gruixuts són miosina. Els filaments d’actina són els més petits que rodegen els grans. Al voltant hi veiem mitocondris, per a proporcionar ATP. [En absència d’ATP, les fibres de miosina i actina queden juntes. Això dóna lloc al rigor mortis dels cadàvers. Si hi hagués ATP, aquest es desfosforila i permet la hidròlisi de les dues fibres, de manera que es dona la relaxació muscular.] Funcions del citoesquelet d’actina Pot formar microvilli, cinturons d’adhesió, es troba al còrtex de la cèl·lula (pot endocitosi), filopodis, lamelapodis (per a moure la cèl·lula), fibres d’estrès (permeten mantenir la cèl·lula en un a posició determinada, adherir-se a un substrat), o formar un anell contràctil entre cèl·lules filles. El que permet la formació de fibres d’estrès contràctils és la miosina, es posen filaments actina de manera antiparal·lela. Entre fibres contràctils (antiparal·leles) hi ha la miosina. +............2 miosines unides -.............+ Una miosina anirà cap al cap a 1 estrem + i l’altra cap a l’altre, es contrauran. 253 Microvilli Estructures digitiformes a la membrana plasmàtica de cèl·lules epitelials formades per filaments d’actina. Estructures molt estables. Augmeten la superfície d’absorció de la cèl·lula, permeten captar més nutrients. En cèl·lules polars. La membrana plasmàtica que recobreix el microvilli conté una coberta extracel·lular de polisacàrids i enzims més gruixudes que la resta de la membrana plasmàtica de la cèl·lula. Tots els filaments d’actina del feix estan orientats de forma que els seus extrems positius apunten cap a l’exterior i es mantenen units mitjançant proteïnes formadores de feixos d’actina, com la fimbrina i la fascina, que se situen a intervals regulars dels filaments. Mentre que la part inferior del feix arriba a la zona apical de la cèl·lula. No confondre amb CILIS (dreta), que tenen estructura de microtúbuls!! Fixa’t en les imatges següents: Fibres d’estrès Feixos d’actina contràctils. En els punts de contacte amb els substrat formen les adhesios focals (punts grocs imatge). A través de l’alfa beta .... s’uneixen .... 254 L’actina polimeritzada polimeritza per a formar fibres contràctils anomenades fibres d’estrès. Al final d’aquestes hi ha proteïnes accessòries i, a través d’aquestes, s’uneixen al substrat al que s’ha d’unir la cèl·lula: adhesions focals. Adhesions focals: amb membrana plasmàtica. Còrtex cel·lular Xarxa de filaments d’actina sota la membrana plasmàtica de totes les cèl·lules. Molt dinàmic. Permet formar invaginacions, protusions, anell contràctil, lameilpodis o filopodis. Perquè es els filaments d’actina s’organitzin d’una o altra manera calen senyals externes. Proteïnes de la família Rho estan implicades en traduir senyals externs en reorganitzacions d’actina intracel·lulars. Rho són GTPases de la família Ras. A través d’una o altra s’activen proteínes que fan que es formin fibres d’estrès, filopodis o lamelipodis (mirar proteínes imatge). 255 Moviment cel·lular La cèl·lula està enganxada a un substrat mitjançant proteïnes d’adhesió. En un moment determinat, la cèl·lula rep algun tipus de senyal que li indica que es mogui. Així que es donen nucleacions d’actina a regions específiques pròximes a la membrana plasmàtica. La protusió d’actina en forma en lamelipodis empeny membrana endavant. La cèl·lula s’ha d’adherir al substrat amb adhesions focals, perquè pugui avançar. Però darrera, les adhesions focals han de desaparèixer, per a contraure’s per darrera i avançar. La miosina i les proteïnes Rho fan que la cèl·lula es retraigui per la part posterior. Per a estudiar el moviment cel·lular, es fa un cultiu. Quan estan en forma confluent, estan totes en contacte unes amb altres. Llavors, amb el contacte, s’inhibeix la proliferació cel·lular, excepte si les cèl3lules són tumurals. SI es treu una línia de cèl·lules, les cèl3lules intentearan cobrir la ferida, movent-se. Nom experiment: wound healing. Depenent de les cèl3lules, o les condicions, aquestes tancaran més ràpid o 256 menys la ferida. I s’inhibeix el dominant negatiu de Rac1 no es poden moure tant, perquè no poden formar lamelipodis. Igual amb la Cdc42 i la Rho. Microscopi òptic de fluorescència. Imatges obtingudes amb contrast de fases i detecció de GFP per fluorescència. Exp. Wound healing (tancament de ferida) - Mobilitat cel·lular Les fluorescents tenen inhibida Rac1, per exemple, i no es mouen. Amb la senyalització de rac1, gràcies a arp2/3 es formen nous filaments d’actina cap a un front determinat (lamelipodis). En el front de darrera s’activa Rho A, es formen fibres d’estrès contràctils (contràctils perquè tenen miosina) perquè es contregui. 257 Rac1, a través de la proteïna que activa, en aquest cas una quinasa, activa u Els microtúbuls també aporten proteíens que activen Rac1: les gef. Aquestes activen Ras. 258