Biochemistry 2-22-31 PDF

Chapitre 2 : Cycle de l’acide citrique – Catabolisme de l’acétyl-CoA Objectifs : ▪ Décrire les réactions du cycle de l’acide citrique et celles conduisant à la production d’équivalents réducteurs qui sont oxydés dans la chaîne mitochondriale de transport des électrons pour la production d’ATP. ▪ Exp...

Chapitre 2 : Cycle de l’acide citrique – Catabolisme de l’acétyl-CoA Objectifs : ▪ Décrire les réactions du cycle de l’acide citrique et celles conduisant à la production d’équivalents réducteurs qui sont oxydés dans la chaîne mitochondriale de transport des électrons pour la production d’ATP. ▪ Expliquer comment le cycle fournit à la fois une voie de catabolisme et de synthèse des acides aminés. ▪ Décrire les principales voies anaplérotiques permettant le réapprovisionnement en intermédiaires du cycle de l’acide citrique et la façon dont le prélèvement d’oxaloacétate pour la gluconéogenèse est contrôlé. ▪ Décrire le rôle du cycle dans la synthèse des AG. ▪ Expliquer comment l’activité du cycle est contrôlée par la disponibilité de cofacteurs oxydés. ▪ Expliquer comment l’hyperammoniémie peut conduire à la perte de conscience. Anaplérotique = anabolique ayant pour but le réapprovisionnement du cycle de Krebs. 1- Importance biomédicale du cycle de l’acide citrique Le cycle de l’acide citrique (= cycle de Krebs = cycle des acides tricarboxyliques) est une série de réactions se déroulant dans les mitochondries et conduisant à l’oxydation de la partie acétyle de l’acétyl-CoA en CO2 et à la réduction de coenzymes (qui seront réoxydés par la chaîne respiratoire avec formation couplée d’ATP). • Implication dans de nombreux processus métaboliques Le CAC est la voie finale commune de l’oxydation des glucides, des lipides et des protéines, puisque le glucose, les acides gras et la plupart des acides aminés sont métabolisés en acétyl-CoA ou en intermédiaire de ce cycle. Il joue aussi un rôle central dans la gluconéogenèse, la lipogenèse et l’interconversion des acides aminés. Une grande partie de ces processus se déroule dans la plupart des tissus mais le foie est le seul tissu dans lequel ils s’effectuent tous à un degré significatif. Les répercussions sont donc profondes quand, par exemple, un grand nombre de cellules hépatiques sont endommagées lors d’une hépatite aigue ou remplacées par du tissu conjonctif (comme dans le cas d’une cirrhose). • Maladies du CAC Les quelques anomalies génétiques des enzymes du cycle de l’acide citrique connues sont associées à de sévères altérations neurologiques dues à une synthèse très diminuée d’ATP dans le SNC. L’hyperammoniémie (excès d'ammoniac NH3 dans le sang) qu’on observe lors de maladies hépatiques à un stade avancé, conduit à des pertes de connaissance, au coma et à des convulsions à cause du défaut d’activité du CAC qui entraîne une formation réduite d’ATP. L’ammoniac cause à la fois un appauvrissement en intermédiaires du CAC et une inhibition du complexe de l’α-cétoglutarate déshydrogénase. 2- Fonctionnement général du cycle • Déroulement général du cycle Première réaction → Réaction entre le résidu acétyle de l’acétyl-CoA (2C) et l’oxaloacétate (acide dicarboxylique à 4C) pour former le Citrate (acide tricarboxylique à 6C). 16 Dans les réactions suivantes, 2 molécules de CO2 sont libérées et l’oxaloacétate est régénéré (étant donné ce dernier aspect, on peut considérer qu’il joue un rôle catalytique). NB : Seule une petite quantité d’oxaloacétate est nécessaire pour l’oxydation d’une grande quantité d’acétyl-CoA. • Approvisionnement de la chaine respiratoire Le CAC est la principale voie de formation d’ATP liée à l’oxydation des carburants métaboliques. Durant l’oxydation de l’acétyl-CoA, des coenzymes sont réduits puis réoxydés ultérieurement dans la chaîne respiratoire, avec formation couplée d’ATP (phosphorylation oxydative). Ce processus aérobie, requiert l’oxygène comme oxydant final des coenzymes réduits. Les enzymes du CAC sont situées dans la matrice mitochondriale, soit à l’état libre, soit attachées à la membrane mitochondriale interne et à la membrane des crêtes où se trouvent également les enzymes et coenzymes de la chaîne respiratoire. 3- Les étapes du CAC a- Formation du Citrate Cette réaction initiale est catalysée par la citrate synthase. La liaison thioester du citryl-CoA intermédiaire est hydrolysée, libérant le citrate et le CoA~SH lors d’une réaction exergonique. b- Isomérisation du Citrate en Isocitrate Le citrate est isomérisé en isocitrate par l’aconitase. Cette réaction se fait en 2 étapes : ▪ Déshydratation en cis-aconitate ▪ Réhydratation en isocitrate. 17 • Comportement asymétrique de l’aconitase Bien que le citrate soit une molécule symétrique, l’aconitase réagit avec le citrate de façon asymétrique, de sorte que les 2 atomes de carbone qui sont perdus au cours des réactions ultérieures du cycle ne sont pas ceux ajoutés à partir de l’acétyl-CoA. Ce comportement asymétrique est le résultat d’un transfert du Citrate directement au site actif de l’aconitase sans passage libre en solution. • Réserves de citrate pour la synthèse d’AG Si l’aconitase synthase est inactive (du fait par exemple d’une trop forte concentration en isocitrate), le citrate libre peut être transporté dans le cytoplasme pour la synthèse des AG. Cela garantit une activité intégrée du CAC et une réserve de citrate cytosolique comme source d’acétyl-CoA pour la synthèse des AG. 18 • Inhibition de cette étape Le fluoroacétate est un poison présent dans certaines plantes dont la consommation peut être fatale aux animaux en pâturage. Certains composés fluorés utilisés comme agents anticancéreux et des agents chimiques industriels (notamment des pesticides) produisent par métabolisme du fluoroacétate. La toxicité vient du fait que le fluoroacétyl-CoA se condense avec l’oxaloacétate pour former le fluorocitrate, qui inhibe l’aconitase, entraînant une accumulation de citrate. c- Formation de l’α-cétoglutarate L’isocitrate subit une déshydrogénation catalysée par l’isocitrate déshydrogénase pour former tout d’abord l’oxalosuccinate, qui reste lié à l’enzyme et subit une décarboxylation en α-cétoglutarate. La décarboxylation nécessite des ions Mg2+ ou Mn2+. Il existe 3 isoenzymes de l’isocitrate déshydrogénase. L’une d’elles, utilisant le NAD+ est uniquement mitochondriale, les 2 autres utilisent le NADP+ et se trouvent dans les mitochondries et le cytosol. L’oxydation de l’isocitrate lié à la chaîne respiratoire se fait presqu’exclusivement avec des enzymes dépendantes du NAD+. d- Formation du Succinyl-CoA L’α-cétoglutarate subit une décarboxylation oxydative lors d’une réaction catalysée par un complexe multienzymatique similaire à celui impliqué dans la décarboxylation oxydative du pyruvate → le complexe de l’α-cétoglutarate déshydrogénase. Il requiert les mêmes cofacteurs que celui de la pyruvate déshydrogénase : le diphosphate de thiamine, le lipoate, NAD+, FAD et le CoA. Ce complexe permet la formation de succinyl-CoA et la réaction est irréversible. Comme dans le cas de l’oxydation du pyruvate, l’arsenic inhibe la réaction, ce qui cause une accumulation du substrat. Les fortes concentrations en ammoniac inhibent également le complexe alpha-cétoglutarate déshydrogénase. e- Formation du succinate Le succinyl-CoA est transformé en succinate par la succinate thiokinase (= succinyl-CoA synthétase). C’est le seul exemple du CAC dans lequel il y a phosphorylation au niveau du substrat. Les tissus dans lesquels la gluconéogenèse a lieu (foie et reins) contiennent 2 isoenzymes de la succinate thiokinase, l’une spécifique du GDP et l’autre de l’ADP. Le GTP formé sert à la décarboxylation de l’oxaloacétate en phosphoénolpyruvate (phosphoénolpyruvate carboxykinase) lors de la gluconéogenèses qui permet un contrôle couplé entre l’activité du CAC et le prélèvement d’oxaloacétate pour la gluconéogenèses. Les tissus non gluconéogéniques ne possèdent pas l’isoenzyme utilisant le GDP. f- Reformation de l’oxaloacétate • Formation du fumarate Le succinate est d’abord déshydrogéné en fumarate. Cette réaction est catalysée par la succinate déshydrogénase, enzyme liée à la face interne de la membrane mitochondriale interne. Elle contient le FAD et une protéine Fer-soufre (Fe:S) (CII-complexe 2 de la chaine respiratoire) et réduit directement l’ubiquinone dans la chaîne respiratoire. • Formation du malate La fumarase catalyse l’addition d’eau sur la double liaison du fumarate pour former le malate. • Reformation de l’oxaloacétate L’oxydation du malate en oxaloacétate par la malate déshydrogénase est couplée à la réduction du NAD+. Le flux net de cette réaction va dans la direction de l’oxaloacétate en raison du prélèvement continuel de ce composé (substrat pour la gluconéogenèses ou pour subir la transamination en aspartate) et également à cause de la réoxydation continue du NADH (CI). 19 4- Bilan énergétique d’un tour de cycle 3 molécules de NADH et une de FADH2 sont produites pour chaque molécule d’acétyl-CoA catabolisée dans un tour de cycle. Ces équivalents réducteurs sont transférés à la chaine respiratoire où la réoxydation de : ▪ Chaque NADH entraine la formation de 2,5 ATP (~3) ▪ Chaque FADH2 entraine la formation de 1,5 ATP (~2) De plus, 1 ATP (ou 1 GTP) est formé par phosphorylation catalysée par la succinate thiokinase au niveau du substrat. Total : 3 x 2,5 (NADH) + 1,5 (FADH2) + 1 ATP = 10 ATP 5- Le CAC, « plaque tournante » du métabolisme Le CAC est aussi une voie essentielle de l’interconversion des métabolites produits par la transamination et la désamination d’acides aminés. Autrement dit, il fournit des substrats pour la synthèse d’acide aminés (par transamination), la gluconéogenèses et la synthèse des AG. Il est donc amphibolique (à la fois catabolique et anabolique). 20 a- CAC et gluconéogenèse • Formation de PEP à partir d’Oxaloacétate Tous les intermédiaires du CAC sont glucogéniques puisqu’ils peuvent aboutir à de l’oxaloacétate qui peut servir à la néoglucogénèse dans le foie et les reins. La phosphoénolpyruvate carboxykinase est l’enzyme clé qui lie le CAC avec la gluconéogenèse. Elle catalyse en effet la décarboxylation de l’oxaloacétate en phosphoénolpyruvate avec l’intervention de GTP comme source de phosphate (le GTP est fourni par l’isoenzyme GTP-dépendante de la succinate thiokinase. Cela garantit que l’oxaloacétate ne soit par retiré du cycle pour la gluconéogenèse si cela pouvait conduire à une carence en intermédiaires du cycle de l’acide citrique et donc à une production réduite d’ATP). • Formation d’Oxaloacétate à partir de pyruvate L’une des plus importantes réactions anaplérotiques est la formation de l’oxaloacétate par carboxylation du pyruvate catalysée par la pyruvate carboxylase. Cette réaction maintient la concentration de l’oxaloacétate à un niveau adéquat pour la réaction de condensation avec l’acétyl-CoA. Si l’acétyl-CoA s’accumule, il agit à la fois comme activateur allostérique de la pyruvate carboxylase et comme inhibiteur de la pyruvate déshydrogénase, assurant ainsi le ravitaillement en oxaloacétate. Par conséquent, le lactate, substrat de la gluconéogenèse, entre dans le cycle par l’oxydation en pyruvate suivie de sa carboxylation en oxaloacétate. 21 b- CAC et transamination Le glutamate et la glutamine sont d’importants substrats anaplérotiques car ils donnent de l’α-cétoglutarate par des réactions catalysées par la glutaminase et la transaminase ou par la glutamate déshydrogénase. Les transaminases catalysent la production de pyruvate à partir d’alanine, d’oxaloacétate à partir de l’aspartate et l’α-cétoglutarate à partir du glutamate. Comme ces réactions sont réversibles, le cycle sert aussi de source de squelettes carbonés pour la synthèse de ces acides aminés. D’autres acides aminés contribuent à la gluconéogenèse parceque leurs squelettes carbonés donnent naissance à des intermédiaires du CAC. ▪ L’alanine, la cystéine, la glycine, l’hydroxyproline, la sérine, la thréonine et le tryptophane forment du pyruvate. ▪ L’arginine, l’histidine, la glutamine et la proline forment de l’α-cétoglutarate. ▪ L’isoleucine, la méthionine et la valine forment du succinyl-CoA. ▪ La tyrosine et la phénylalanine forment du fumarate. 22 Le CAC ne fournit pas en lui-même une voie d’oxydation complète du squelette carboné des acides aminés qui forment des intermédiaires comme l’α-cétoglutarate, le succinyl-CoA, le fumarate et l’oxaloacétate, car il en résulterait une augmentation de la quantité d’oxaloacétate. • Oxydation complète de l’oxaloacétate Pour une oxydation complète, l’oxaloacétate doit subir une phosphorylation et une décarboxylation en phosphoénolpyruvate (aux dépens de GTP) puis une déphosphorylation en pyruvate (catalysée par la pyruvate kinase) et une décarboxylation oxydative en acétyl-CoA (catalysé par la pyruvate déshydrogénase). Chez les ruminants dont le principal carburant métabolique est constitué d’AG à courtes chaînes formés par la fermentation bactérienne, la conversion du propionate (principal produit glucogénique issu de la fermentation dans la panse) en succinyl-CoA, via la voie du méthylmalonyl-CoA, est particulièrement importante. c- CAC et synthèse d’acides gras • L’acétyl-CoA, source des AG L’acétyl-CoA est le principal substrat de la synthèse des AG à longue chaîne chez les non-ruminants. La pyruvate déshydrogénase qui permet la production d’acétyl-CoA à partir de pyruvate est une enzyme mitochondriale or la synthèse des AG s’effectue dans le cytosol et la membrane mitochondriale est imperméable à l’acétyl-CoA. NB : Chez les ruminants, l’acétyl-CoA provient directement de l’acétate. • Comment faire passer l’Acétyl-CoA de la mitochondrie au cytosol ? L’acétyl-CoA du cytosol provient du citrate synthétisé dans la mitochondrie (par le CAC) qui lui peut passer les membranes mitochondriales. Une fois dans le cytoplasme, il est clivé par la citrate lyase et redonne de l’acétyl-CoA. Attention, le citrate ne peut être transporté hors de la mitochondrie que lorsque l’aconitase est inhibée par son produit. Cela garantit que le citrate ne soit utilisé pour la synthèse d’AG que lorsque sa quantité est suffisante pour permettre une activité continue du CAC. 23 • Récupération de l’oxaloacétate cytosolique par la mitochondrie L’oxaloacétate libéré par la citrate lyase ne peut pas directement regagner la mitochondrie. Il doit être réduit en malate avec consommation de NADH. Le malate subit alors une décarboxylation oxydative en pyruvate avec réduction du NADP+ en NADPH. Cette réaction catalysée par l’enzyme malique est la source de la moitié du NADPH nécessaire à la synthèse des AG (le reste provenant de la voie des pentoses phosphates). Le pyruvate entre dans la mitochondrie et est carboxylé en oxaloacétate par la pyruvate carboxylase. 24 6- Régulation du CAC L’activité du CAC est contrôlée par la chaîne respiratoire et la phosphorylation oxydative. Cette activité est donc sous la dépendance immédiate de la quantité de NAD+, lequel, dépend de la disponibilité en ADP et donc, finalement, de la vitesse d’utilisation de l’ATP. Les principaux sites de régulation sont les réactions de non-équilibre (irréversibles) catalysées par : - La pyruvate déshydrogénase - La citrate synthase - L’isocitrate déshydrogénase - L’α-cétoglutarate déshydrogénase. Ces enzymes sont sensibles : - Aux ions Ca2+, pour les déshydrogénases, dont la concentration augmente au cours de la contraction musculaire - Au statut énergétique exprimé par les rapports [ATP]/[ADP] et [NADH]/[NAD+] - A la concentration du produit de la réaction qu’elles catalysent. Ainsi, il y a inhibition allostérique de la citrate synthase par l’ATP et par les acyl-CoA à longues chaînes par exemple. Activation allostérique de l’isocitrate déshydrogénase mitochondriale par le NAD+ et l’ADP et inhibition par l’ATP et le NADH. Le complexe de l’ α-cétoglutarate déshydrogénase est aussi contrôlée par une kinase qui phosphoryle 3 résidus Sérine de la déshydrogénase du complexe ce qui diminue son activité. La succinate déshydrogénase est inhibée par l’oxaloacétate dont la disponibilité est contrôlée par la malate déshydrogénase cytosolique qui dépend elle-même du rapport [NADH]/[NAD+]. 25