Laboratorio 3: Estudio de Parametros Celulares (PDF)

Laboratorio 3 Estudio de distintos parámetros celulares en cultivos controles y tratados con una droga con probable acción citostática: estudio de la expresión de genes relacionados con el ciclo celular por RT-PCR, análisis del perfil lipídico y proteico. Doce...

Laboratorio 3 Estudio de distintos parámetros celulares en cultivos controles y tratados con una droga con probable acción citostática: estudio de la expresión de genes relacionados con el ciclo celular por RT-PCR, análisis del perfil lipídico y proteico. Docentes responsables: JTP Dr. Leandro Parra AP Farm. Matías Sierra Temario Conocimientos requeridos para el desarrollo de las actividades. Estructura de las membranas biológicas. Métodos para el estudio de las proteínas: electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Métodos de estudio de los lípidos: extracción de los lípidos totales de una muestra biológica (Método Folch), separación de los lípidos por cromatografía en capa delgada (TLC) y revelado del resultado para la evaluación del perfil lipídico. Estructura del ADN y ARN. Replicación. Transcripción. Tipos de ARN. Regulación de la expresión génica. PCR, RT-PCR. Separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa. Objetivo  Analizar los posibles cambios en el perfil proteico y lipídico, en células de la línea celular MDCK tras el tratamiento con una droga con potencial acción citostática.  Analizar a través de una RT-PCR, la expresión del ARNm de c-fos (gen implicado en la proliferación) en cultivos de la línea celular MDCK luego del tratamiento con una droga con potencial acción citostática. Objetivos específicos de la actividad práctica: 1. Analizar la expresión génica de c-fos a través de una electroforesis en gel de agarosa. 2. Evaluar el perfil proteico de una muestra celular mediante la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). 3. Estudiar el perfil lipídico de una muestra celular mediante la técnica de cromatografía en capa delgada (TLC). Actividades y protocolos experimentales En este Trabajo Práctico, evaluaremos el efecto de una droga con potencial efecto citostático sobre la expresión del gen de c-fos con el fin de determinar su efecto. Para llevar a cabo este objetivo partiremos de un lisado celular obtenido durante el trabajo práctico N°1. En esa oportunidad se reservó un microtubo conteniendo 50.000 células en buffer de lisis de ARN proveniente de un cultivo incubado con una posible droga citostática (tratado), y otro que no ha sido incubado con dicha droga (control). Ambos tubos (control y tratado) fueron utilizados por los docentes para continuar con el protocolo tal como está descripto en la presente guía con el objetivo de poder realizar la experiencia en el laboratorio. Etapas del protocolo: I. Extracción de ARN total a partir del lisado obtenido en el TP N°1. II. Retrotranscripción (Obtención de ADNc). III. Amplificación mediante PCR. IV. Electroforesis en gel de agarosa 1. Análisis la expresión génica de c-fos mediante RT-PCR seguida de una electroforesis en gel de agarosa. I. Extracción del ARN total Para poder llevar a cabo una extracción exitosa se debe realizar una ruptura eficaz de las células, la desnaturalización de complejos nucleoproteicos, inactivación de ARNasas (Ribonucleasas) y eliminación de ADN y proteínas contaminantes. Es muy importante la inactivación de las ARNasas endógenas que se liberan de las organelas al romperse las células, ya que estas, podrían degradar nuestras valiosas biomoléculas de interés: Los ARN. Además de inhibir las ribonucleasas endógenas, es muy importante evitar la contaminación con ribonucleasas exógenas. Es por esto por lo que es imperioso crear un ambiente libre de ARNasas. Para ello:  Limpiar todas las superficies de trabajo.  Rociar con alcohol 70% las manos.  Evitar hablar sobre las muestras sin barbijo.  Utilizar reactivos que están certificados como ARNasa-free.  Preparar las soluciones con agua libre de ARNasas. Protocolo La extracción y purificación del ARN total a partir de las muestras obtenidas fue llevada a cabo por los docentes utilizando el kit comercial SV Total RNA Isolation System desarrollado por la firma 1 Promega y comercializado en Argentina por la compañía Biodynamics. Se procedió según las instrucciones del fabricante que pueden descargarse accediendo al siguiente link: https://worldwide.promega.com/products/nucleic-acid-extraction/rna/sv-total-rna-isolation- system/?catNum=Z3101 Luego de esta extracción:  ¿Qué biomoléculas se obtienen?  ¿Cuál es la utilidad de Agregar ADNasa?  ¿Cómo comprobaría que el protocolo de extracción de ARN fue exitoso? Cuantificación y determinación de pureza: Una vez extraído el ARN se debe cuantificar y evaluar su pureza. Dichas determinaciones se realizarán mediante mediciones espectrofotométricas. Esta técnica se basa en la capacidad del ARN para absorber ciertas longitudes de onda de luz ultravioleta: Cuando el ARN se expone a la luz ultravioleta, absorberá selectivamente esta luz en la longitud de onda de 260 nm. Por su parte, las proteínas, principal contaminante durante este protocolo, absorben selectivamente a 280 nm. Mayores concentraciones de ARN absorberán más luz. 1 unidad de absorbancia a 260 nm en 1 cm de trayectoria óptica para ADN de doble cadena= 50 µg/ml y para ARN= 40 µg/ml La relación de absorbancia a ambas longitudes de onda permite determinar si la muestra se encuentra contaminada con proteínas. ADN puro: A260/280 ~1.8 ARN puro: A260/280 ~2.0 II. Retrotranscripción Esta etapa fue realizada por los docentes utilizando la enzima M-MLV de la firma Promega según las instrucciones del fabricante: 2  M-MLV Reverse Transcriptase (promega.com)  ¿Cuáles son las biomoléculas de partida y cuál es el producto final de esta reacción? Protocolo La transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV RT) es una polimerasa RNA-dependiente que se puede utilizar en la síntesis de ADNc con cadenas largas de ARN mensajero (>5kb). 1. El procedimiento utiliza 2 μg de ARN total. Colocar en un microtubo estéril libre de RNasa, añadir 0,5 μg del Primer Oligo dT por microgramo del ARN total en un volumen total de ≤15 μl en agua. Calentar el tubo a 70 °C durante 5 minutos para romper la estructura secundaria. Enfríe el tubo inmediatamente con hielo para evitar que la estructura secundaria se reforme 2. Agregue los siguientes componentes en el orden que se muestra.  Buffer de reacción M-MLV 5X 5μl  dNTPS 10 mM  M-MLV RT 200 UI  Agua libre de nucleasas hasta el volumen final de 25 μl Mezclar suavemente moviendo el tubo e incubar durante 60 minutos a 42 °C La temperatura de extensión puede optimizarse entre 37 °C y 42 °C. III. Amplificación: PCR La amplificación del ADNc correspondiente a c-fos fue realizada por los docentes de la cátedra utilizando los siguientes primers: Forward 5’- CAACGAACCCTCCTCTGACT-3’ primer Reverse 5’-TGTTTCGCGCACAGATAAGG -3’ primer Para diseñar estos primers se utilizó la herramienta en línea Blast Global Align: BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (nih.gov) donde se obtuvo la informacion de la secuencia de ADNc del gen c-fos : Canis lupus familiaris Fos proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit (FOS), mRNA Accession number: XM_038672975.1 Los primers luego fueron diseñados utilizando la herramienta libre Primer3web Cada tubo de reacción se armó según: Reactivo Volumen Buffer GoTaq 5x 2 µL dNTPs (10 mM) 0,8 µL Primer Forward (20 µM) 0,5 µL Primer Reverse (20 µM) 0,5 µL 3  Go Taq (10UI/100µl) 0,05 uL ADNc (Se colocara luego) 6,15 µL Luego se procedió a correr la reacción de la cadena de la polimerasa en el termociclador con las siguientes condiciones:  Etapa de desnaturalización inicial: 2 min a 94ºC  1 min a 94ºC  1 min 59ºC 30 ciclos  1 min a 72ºC  10 min a 72ºC IV. Análisis de la expresión del gen c-fos: Electroforesis en gel de agarosa Para verificar la presencia del producto de PCR se realizará una electroforesis en un gel de agarosa. 1. Preparación del gel de Agarosa: al comienzo de la experiencia se preparará el gel de Agarosa (1 por comisión), a partir de una solución de Agarosa 2 % (P/V) en buffer TBE (Tris 89 mM, Ácido Bórico 89 mM, EDTA 2,5 mM, pH= 8,0-8,3) conteniendo bromuro de etidio 0,5 µg/ml. 2. Desarrollo de la electroforesis: sembrar 8 µl de las muestras en las calles asignadas (4 calles de muestras control y 4 calles de muestras de células tratadas) en el gel de agarosa y aplicar una corriente de aproximadamente 100 V. La corrida se desarrollará hasta que el colorante haya alcanzado las ¾ partes de la distancia total del gel. Las bandas correspondientes a los fragmentos de ADN serán visualizadas a la luz UV.  ¿Puede asegurar que la banda obtenida corresponde al gen c-fos? Justifique.  ¿Puede cuantificar la expresión del gen de c-fos con esta metodología? Justifique. 2. Evaluación del perfil proteico mediante la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Fundamento de la técnica La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS) es una técnica electroforética que permite la separación de proteínas en función de su masa, debido a que el SDS desnaturaliza las proteínas, las cuales adquieren una conformación extendida, con una relación masa/carga similar. Protocolo Experimental:  Preparación de las muestras: Resuspender los pellets de células obtenidos durante el TP N° 1 en 25 μL de buffer LAEMMLI (Tris.HCl 62,5 mM, SDS 2%, β-mercaptoetanol 5%, glicerol 10%, azul de bromofenol). Calentar los tubos a ebullición durante 5 minutos.  Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS: Se sembrarán cuidadosamente las alícuotas de 20 μL de las muestras preparadas en el punto anterior sobre el pocillo de siembra de un gel de poliacrilamida. Finalizada la carga de las muestras, se conectará la cuba de electroforesis, que contiene el gel y el buffer de corrida, a una fuente de poder. La corrida se desarrollará durante 1h 30 min a voltaje controlado. Una vez finalizada la corrida, el gel se retirará para su revelado. 4  Revelado del gel: Finalizada la corrida electroforética, el gel se colocará en una solución de colorante Phastgel Blue R (Coomassie R 350) durante 20 min. Después de este tiempo se procederá a la decoloración del gel con un primer lavado de agua corriente y un lavado con solución decolorante (metanol:ácido acético:agua (3:1:6, v/v)) hasta que las bandas se visualicen correctamente. 3. Estudio del perfil lipídico de muestras biológicas mediante la técnica de cromatografía en capa delgada. Fundamento de la técnica Este método se basa en una primera etapa de extracción de lípidos totales por el método de Folch (realizada durante el TP 2). Posteriormente, los lípidos totales extraídos son separados en función de su polaridad a través de una cromatografía en capa delgada. Protocolo experimental: 1) Resuspender el extracto seco en 20 μL de Cl2CH2:MeOH (2:1). 2) Vortexear. 3) Aplicar la muestra sobre una placa cromatográfica previamente marcada, conteniendo la fase estacionaria de sílica gel. 4) Colocar la placa en una cuba cromatográfica previamente saturada con la fase móvil: Éter de petróleo/hexano/éter etílico/ácido acético (40:40:20:1 v/v). 5) Una vez que el frente de corrida alcanza el último medio centímetro de la placa, retirar de la cuba y dejar secar. Revelar exponiendo la placa cromatográfica a vapores de I2. 4. Resolución de problemas. Problema 1. En un hospital, un paciente presenta una infección urinaria recurrente causada por una cepa de Escherichia coli. Los antibióticos recetados no han sido efectivos, lo que sugiere que la bacteria podría estar portando genes de resistencia a antibióticos. Para confirmar esta sospecha, se envían muestras de orina del paciente al laboratorio para realizar pruebas moleculares que identifiquen genes de resistencia a antibióticos específicos. El equipo de microbiología del laboratorio decide realizar una PCR para detectar tres de los genes más comunes asociados con la resistencia a antibióticos beta-lactámicos, específicamente los genes blaTEM, blaCTX-M, y blaSHV. Estos genes codifican enzimas beta-lactamasas, que degradan antibióticos como penicilinas y cefalosporinas, haciendo ineficaces estos tratamientos. Se realizó sobre el ADN extraído, un ensayo de PCR para cada gen utilizando un control positivo y negativo para cada uno y se obtuvo el siguiente resultado: 5 ¿Qué puedes concluir respecto a la resistencia a antibióticos en la cepa de Escherichia coli del paciente, basándote en los resultados del gel? Problema 2. Un recién nacido (RN) presenta síntomas compatibles con fibrosis quística (FQ), una enfermedad genética autosómica recesiva que afecta principalmente a los pulmones y el sistema digestivo. La fibrosis quística es causada por mutaciones en el gen CFTR, el cual codifica una proteína que regula el transporte de iones a través de las membranas celulares. La mutación más común asociada a FQ es la ΔF508, una deleción de tres nucleótidos en el gen CFTR. Esta deleción provoca la pérdida del aminoácido fenilalanina en la posición 508 de la proteína, causando una disfunción en el canal de cloruro que regula la proteína CFTR. La mutación ΔF508 está presente en aproximadamente el 70% de los casos de fibrosis quística. Para confirmar el diagnóstico, se realiza una PCR para detectar la mutación ΔF508 en el ADN del recién nacido, y luego se realiza una electroforesis en gel de poliacrilamida (es posible detectar diferencias de pocos pares de bases entre moléculas), comparando los resultados con muestras de los padres y controles. 6 ¿Qué puede decir al respecto del diagnóstico del recién nacido? ¿Cuáles son los componentes esenciales de la reacción de PCR y que función cumple cada uno de ellos? Problema 3. Un paciente de 52 años ha sido diagnosticado con melanoma metastásico. Se ha realizado una biopsia de su tumor, y los análisis moleculares revelan la presencia de la mutación RAF V600E, lo que sugiere que la vía de las MAP quinasas está activada de forma constitutiva, promoviendo el crecimiento tumoral. Los investigadores quisieron evaluar la efectividad de dos fármacos inhibidores de esta vía, Vemurafenib (un inhibidor de RAF) y Trametinib (un inhibidor de ERK), para determinar cuál es más efectivo en este paciente. Para ello se realizó un ensayo in vitro utilizando células tumorales obtenidas de la biopsia del paciente. Se cultivaron y trataron con diferentes concentraciones de Vemurafenib y Trametinib. Luego se evaluó la expresión de los genes E2F y BAX (E2F promueve la proliferación celular al activar genes necesarios para la replicación del ADN, mientras que BAX al activarse promueve la muerte celular por apoptosis). Las condiciones experimentales fueron las siguientes: Grupo 1: Control sin tratamiento. Grupo 2: 1 µM de Vemurafenib. 7  Grupo 3: 10 µM de Vemurafenib. Grupo 4: 1 µM de Trametinib. Grupo 5: 10 µM de Trametinib. Los Resultados que se obtuvieron fueron los siguientes: E2F BAX 300 PB ¿Como realizaron el protocolo los investigadores para evaluar el efecto de los fármacos antitumorales? ¿a qué conclusiones llegaron? ¿Cuáles son los elementos esenciales para realizar la retrotranscripción y que función cumple cada uno de ellos? El cultivo obtenido ¿A qué tipo de cultivo corresponde? Problema 4. En los últimos años, se ha demostrado que las mutaciones en el gen RAF juegan un papel crucial en la activación de la vía de señalización de las MAP quinasas, que está implicada en la proliferación y supervivencia celular. Estas mutaciones están asociadas con varios tipos de cáncer, siendo el melanoma una de las neoplasias más relevantes. Una mutación común en RAF es 600del15 la cual da lugar a una deleción. Esta mutación conduce a una activación anormal de la proteína RAF, lo que resulta en crecimiento celular descontrolado y es frecuente en el melanoma. Un grupo de investigadores en un hospital está estudiando muestras de tejido de tres pacientes diagnosticados con melanoma. Se ha diseñado un protocolo de PCR para detectar la presencia de 8 mutaciones en el gen RAF. Los resultados ayudarán a determinar si los pacientes son candidatos para tratamientos específicos con inhibidores de la vía MAPK. Resultado esperado: Paciente sano (sin mutación): Banda a 400 Pb Paciente enfermo (con mutación): Banda a 390 Pb Con estos resultados ¿Pueden los investigadores determinar si los pacientes son candidatos a tratamientos con los inhibidores de la vía de las MAPK? 9