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Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. ⑬ Les acides nucléiques 1) STRUCTURE A) Unité de base : le nucléotide Les acides nucléiques sont les polymères des nucléotides, présents principalement dans le noyau cellulaire, dont la taille peut atteindre jusqu’à 100 000 000 de mono...

Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. ⑬ Les acides nucléiques 1) STRUCTURE A) Unité de base : le nucléotide Les acides nucléiques sont les polymères des nucléotides, présents principalement dans le noyau cellulaire, dont la taille peut atteindre jusqu’à 100 000 000 de monomères. Ces structures sont très solubles dans l’eau grâce à leur groupement acide. Le terme « nucléique » suggère à juste titre que les polymères ADN et ARN soient ubiquitaires dans le noyau cellulaire. On trouve néanmoins de l’ADN dans les mitochondries et les plastes des cellules eucaryotes, ainsi que de l’ARN dans le cytosol. Génériquement, elles sont constituées d’un groupe phosphate ( acide sous sa forme non- ionique ), d’un sucre ( le ribose ou le désoxyribose ) et d’une base azotée dont les structures possibles seront détaillées plus loin. Structure générique d’un acide désoxy-,ribonucléique : Ibiologique) ↑ Acide nucléique sous forme acide ↑ Acide nucléique, neutre en solution La distinction entre le ribose et le désoxyribose, est au niveau du carbone C2’ qui porte soit un alcool OH et un H ( ribose ARN), soit deux H ( désoxyribose ADN ). La présence ou l’absence de ce groupement OH explique notamment les différences de propriétés. La condensation théorique des acides nucléiques se fait par formation d’un lien phosphodiester covalent, avec perte d’une molécule d’H2O : La liaison entre les deux molécules se fait entre le phosphate du C5’ et la fonction alcool OH du C3’. C’est une liaison type Acide ( phosphate ) + Alcool ( Ribose ) phosphodiester car le phosphate lie, par deux liens ester, les acides nucléiques entre eux. Note : La base azotée comporte également des carbones ( numérotés Cx ). C’est ce qui explique que les carbones du sucre soient distinctement numérotés Cx’. 162 Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. Réaction de pontage entre nucléotides condensation du lien phosphodiester covalent : H2O · C’est précisément le sens de synthèse phosphate ribose ( 5’ 3’ ) qui détermine l’orientation conventionnelle des acides nucléiques, tant dans les processus cellulaires que les représentations de séquences : ⑧ 51 3 ⑧ ⑧ ⑧ ⑧ 5 a 3 163 Biologie'Moléculaire'–'MED'11BA'–'2013/2014'–''I.'G.'&'S.'J.' B)! Bases'des'nucléotides' Les'nucléotides'sont'constitués'de'deux&familles&de&bases&faibles':'Les'bases'puriques'et'les' bases' pyrimidiques.' Leur' dénomination' fait' référence' à' la' purine& et' la' pyrimidine& qui' en' sont'les'structures\mères.'Ces'deux'familles'de'bases&azotées'ont'une'structure'aromatique' plane'avec'des'doubles'liaisons'conjuguées'('représentées'par'un'cercle')':' ' '''''''''''''''''''''''Purine':'bicyclique'''''''''''''''''''''''''''''''''''''Pyrimidine':'cyclique' 5&variantes&de'ces'bases'se'retrouvent'dans'les'acides'nucléiques':' 2&bases&puriques,&l’adénine'A'et'la'guanine'G,'commune'à'l’ADN'et'l’ARN.' 3&bases&pyrimidiques,'la'thymine'T&('dans'l’ADN')'/'l’uracile'U'('dans'l’ARN')'et'la'cytosine'C.' ' Bases'puriques':& ' Ces' deux' bases' existent' en' pratique' chacune' sous' deux' formes' tautomériques' différentes' interchangeables'par'la'translocation'd’un'H'd’une'fonction'à'l’autre.'Il'existe'pour'chacune' des'bases'une'forme'tautomérique'plus&stable'qui'est'par'cela'majoritaire.' ' 164' '  tautomères simplifiés : Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. Le I va sur l'atome qui a la double liaison la double liaison va sur Tautomères céto et énol de la guanine G : l'atome qui a perdu soutt Of > - -0 Ici, la forme céto est majoritaire du fait de la présence d’un amide N – C = O Tautomères imine et amine de l’adénine A : o (0 Ici, la forme amine est majoritaire. 165 Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. Les bases puriques présentes à l’état libre dans les organismes vivants sont susceptibles d’être dégradées. L’un de ces produits d’élimination est l’acide urique, qui est peu soluble dans l’eau. Cet acide existe lui aussi sous des formes tautomériques céto et énol. Bien que cette dernière forme soit minoritaire, elle s’ionise à pH physiologique ( ~7 ) à cause de son pKa, conduisant à la formation d’urate qui est l’étape finale du catabolisme des bases puriques. L’urate étant très insoluble, il précipite. Cela conduit à des problèmes de santé tels que la goutte ( forme d’arthrite ), des calculs rénaux, … : 8 8 O changement O : par rapport à 8 Act G O 166  Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. Bases pyrimidiques : ≃ désoxyribose Pour rappel, l’uracile est l’équivalent de la thymine dans l’ADN, dont il diffère par la présence d’un groupement méthyl CH3 directement branché sur le carbone C5. C’est pourquoi on peut considérer la thymine comme une sorte de « méthyl-uracile ». Ce méthyl n’intervient pas dans les connectivités entre bases au sein des acides nucléiques, ce qui explique l’interchangeabilité de ces bases ( Liaisons U – A & T – A possibles ). De manière analogue, il existe également une base appelée 5-méthyl-cytosine qui correspond à une cytosine dont l’hydrogène porté par le carbone C5 va être remplacé par un groupement méthyl. De la même façon, l’appariement ( abordé plus loin ) avec la guanine G reste inchangé du fait que le méthyl soit déporté. La modification en 5-méthyl-cytosine intervient en épigénétique ( cf infra ) : ≃ ≃ numérotation des atomes Le nucre (ribose/desonyibare) 167 et basse azote : der atome est clu qui fait la liorison le sucre/la basse avec azote Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. Les bases pyrimidiques existent également en permanence sous différentes formes tautomériques. Par exemple : la forme céto de l’uracile U est majoritaire : o o ↑ Il existe donc 5 bases azotées : l’adénine, la guanine, la cytosine, la thymine et l’uracile. Lorsqu’une base est liée à un sucre uniquement, la molécule ainsi formée est un nucléoside. Lorsqu’une base est liée à un sucre et à un ou plusieurs phosphates, il s’agit d’un nucléotide. Les nucléotides peuvent ainsi être mono- ( NMP ), di- ( NDP ) ou triphosphatés ( NTP ). Ces derniers, dont le célèbre ATP qu’on ne présente plus, interviennent notamment comme source d’énergie dans la cellule, mais il en existe d’autres avec parfois d’autres fonctions. Les nucléotides ayant comme sucre un désoxyribose sont appelés désoxyribonucléotides, S notés dNMP, dNDP ou dNTP. Les désoxyribonucléotides sont les constituants de l’ADN. (lldésonyribo NuclotideMonoPhomphale") ATP 168 168 Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. C) Structure de l’ADN Les expériences d’Erwin Chargaff, dans les années 50, portant sur la fréquence et la répartition des différentes bases azotées dans l’ADN de différents être vivants a permis de mettre en évidence deux points : Il existe systématiquement une quasi-équivalence entre les quantités d’A et de T ainsi que celles de G et de C ( ce qui laisse suggérer des liens entre eux ) & ces proportions sont pratiquement constantes d’un tissu à l’autre chez le même individu : ≃ ≃ ≃ On observe ainsi que, dans l’ADN, [A] ≃ [T] et [G] ≃ [C] en nombre de bases. Cela n’est pas vrai pour l’ARN, sauf exceptions, du fait qu’il soit généralement monocaténaire et que rien n’oblige l’association en proportions équivalente des bases complémentaires. Le pourcentage de « G+C » = est constant au sein d’une espèce donnée, indépendamment de l’âge, du tissu, … Il est indicatif de la répartition en divers nucléotides. Il varie de 25% à 75% chez la plupart des espèces, et vaut +/- 40% pour l’homme. En 1953, Watson et Crick compilent des travaux antérieurs et prédisent, en même temps que Franklin qui l’a déterminé par diffraction aux rayons x, la structure hélicoïdale de l’ADN. Apparemment visionnaires, Watson et Crick ont par ailleurs assez vite deviné l’appariement complémentaire des bases dans l’ADN : Une base purique se lie à une base pyrimidique grâce à des ponts hydrogène : 169 Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. Les ponts hydrogène étant des liaisons non-covalentes, ils peuvent assez aisément se rompre et se reformer. Cette propriété intervient dans certains processus (Transcription, …). La thymine T ( ou l’uracile U ) se lie à l’adénine A par le biais de 2 ponts hydrogène. La cytosine C se lie à la guanine G par le biais de 3 ponts hydrogène. δ- δ+ La liaison Cytosine – Guanine est plus stable du fait de la présence d’un troisième pont H. Les brins d’ADN se présentent en regard l’un de l’autre de manière antiparallèle. Ce qui fait qu’en parcourant l’ADN sur sa longueur, on observe un brin 5’ 3’ longeant son brin complémentaire se déroulant dans le sens 3’ 5’, les séquences se lisent néanmoins toujours dans le sens conventionnel 5’ 3’. Observez plutôt : ⑧ 5 do O ↑ Représentation plane non réaliste des brins antiparallèles, par convenance. 170 Biologie'Moléculaire'–'MED'11BA'–'2013/2014'–''I.'G.'&'S.'J.' L’ADN'se'présente'en'réalité'comme'une'double&hélice&de&pas&droit,'avec'un'pas'd’hélice'de' 3,4&nm'et'10,4&nucléotides/tour':' '' Cette' agencement' hélicoïdal' de' pas' droit,' forcé' par' la' conformation' du' sucre,' est' immédiatement'retrouvé'après'la'réplication'de'l’ADN':' ' Cette'double\hélice'se'présente,'comme'le'montre'les'figures,'non'pas'comme'une'structure' parfaitement'symétrique'et'régulière'mais'avec'des'distorsions'appelées'sillons.'Ces'sillons' sont' dits' mineurs,' s’ils' montrent' un' rétrécissement,' et' majeurs,' s’il' y' a' un' élargissement.'' Ils'sont'relatifs'à'la'perspective,'en'ce'sens'où'un'sillon'majeur'vu'de'devant'serait'mineur'vu' de'derrière,'et'inversement.'Ils'sont'dus'à'la'conformation'des'nucléotides,'qui'créent'une' angulation'dans'le'plan.'Celle\ci'a'une'influence'sur'la'fixation'des'protéines'sur'l’ADN':' ' ' ' ' ' ' 171' ' Biologie'Moléculaire'–'MED'11BA'–'2013/2014'–''I.'G.'&'S.'J.' Cette'double\hélice'd’ADN'ne'reste'pratiquement'pas'sous'forme'linéaire'('elle'serait'bien' trop' longue' )' mais' adopte' le' plus' souvent' une' structure' tertiaire' appelée' superhélice.''''''''''''' C’est'surtout'le'cas'des'bactéries&ou'de'la'mitochondrie,'qui'possèdent'un'ADN&circulaire,' mais'd’autres'ADN'sont'également'susceptibles'de'se'«'superenrouler'».'Explications':' "' La' structure' secondaire' de' l’ADN' consiste' en' l’enroulement' du' double' brin' autour' d’un' axe' fictif'de'duplex'indiqué'en'rouge.' T'représente'le'nombre'de'tours' autour' de' cet' axe,' dans' un' état' «'relâché'»'idéal.' ' ' "'La'structure'tertiaire'de'l’ADN' représente'le'surenroulement'de' la' double' hélice' sur' elle\même.' ' W' représente' le' nombre' de' ces' supertorsions.' ' ' "' Le' nombre' d’intersections' correspond' au' nombre' de' ces' supertorions.' L’ADN' circulaire' existe' essentiellement' sous' forme'd’ADN'superenroulé.' ' ' Si'l’ADN'est'circulaire,'le'nombre'de'torsions&T'et'le'nombre'de'supertorsions&W&sont'liés.' Mathématiquement'"' T& +& W& =& constante& =& L.' De' ce' fait,' si' W' ≠' 0,' le' nombre' de' torsions' intrinsèques'de'l’hélice'autour'de'son'axe'de'duplex'doit'nécessairement'diminuer.' L&=&nombre&d’enlacements&='nombre'de'fois'qu’un'brin'tourne'autour'de'l’autre' Si'un'brin'fait'un'tour&de&pas&droit'autour'de'l’autre':'on'fait'+1&sur'L' 172' ' Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. Si un brin fait un tour de pas droit autour de l’autre : on fait +1 sur L Si un brin fait un tour de pas gauche autour de l’autre : on fait -1 sur L De ce fait, les changements de torsions intrinsèques de l’ADN sont compensés par des supertorsions de signe opposé. Il existe deux façons d’introduire une supertorsion : L’ADN circulaire privilégie spontanément la supertorsion ( T = 10 ) à la détorsion ( T = 9 ). Une conséquence pratique dans l’ADN est que L est constant à moins qu’on casse un brin de l’ADN par rupture d’une liaison covalente. Cette caractéristique a une importance capitale dans le processus de réplication de l’ADN, où il est nécessaire de défaire la double-hélice : X X ↑ L et W +/- 2 par rupture, chevauchement et reformation de deux brins. L +/- 1 par rupture, chevauchement et reformation d’un brin. 173 Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. Les topoisomérases sont précisément un type d’enzymes modifiant le surenroulement de l’ADN. Ce sont des enzymes polypeptidiques qui modifient le surenroulement de l’ADN par le même processus de rupture et de recombinaison. Il en existe plusieurs familles chez les procaryotes et les eucaryotes. Ces enzymes sont indispensables à la réplication et à la transcription de l’ADN : Il existe deux familles de topoisomérase, le type II nécessite systématiquement de l’énergie : L’activité de ces topoisomérases peut être inhibée par différents médicaments. Elles sont ciblées du fait qu’elles soient indispensables au processus de réplication cellulaire : Les antibiotiques tels que la ciprofloxacine ciblent et neutralisent les enzymes bactériennes. Les anticancéreux tels que la doxorubicine ciblent et neutralisent les enzymes humaines. Cette discrimination est rendue possible du fait que les familles de topoisomérases varient d’une espèce à l’autre. Cela permet d’engager des traitements spécifiques, bien que les anticancéreux impactent aussi bien les cellules cancéreuses que les cellules saines … 174 Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. Bien qu’ayant une durée de vie relativement longue, l’ADN est susceptible d’être dénaturé par différents facteurs. La dénaturation implique une rupture des ponts hydrogène MAIS une conservation des liaisons covalentes, qui ont une plus grande résistance. Un des principaux facteurs de dénaturation est la température. Afin d’objectiver ses effets, une limite de référence est la Tm = Température de fusion ( Melting = fusion ). Elle est définie comme la température à laquelle 50% de l’ADN est sous forme bicaténaire et l’autre 50% sous forme monocaténaire/dénaturée : bicaténaire monocaténaire Les facteurs qui influencent la dénaturation de l’ADN sont, outre la température : - Le pourcentage de liaisons G↔C ( Plus stables que A↔T ) - La longueur de la chaîne ( La stabilité est directement proportionnelle à la longueur ) - Le pH environnant - La composition ionique de la solution - Les agents chaotropiques, qui cassent les ponts H ( Exemple : l’urée ) La dénaturation de l’ADN est irréversible si la chute de température est brutale ou si la molécule d’ADN est trop grande. En effet, les ponts H qui se reformeraient de manière aléatoire ne correspondraient plus à la molécule de départ. A contrario, elle peut être réversible pour autant que la molécule soit de taille raisonnable et que la diminution de température soit aussi progressive que possible. 175 Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. Une séparation des deux brins de l’ADN, et donc une dénaturation, est précisément voulue lors des phases de réplication ou de transcription de l’ADN, durant lesquelles il est nécessaire « d’exposer » le code génétique pour l’utiliser. Ces ruptures localisées de ponts H sont réalisées par des enzymes, les hélicases, qui nécessitent de l’énergie sous forme d’ATP. La détente de l’ADN permet ainsi de travailler sur les brins dans les contextes précités : Cette réaction est ( heureusement ) réversible. L’ADN réacquiert sa forme après lecture. Ainsi, nos petites enzymes peuvent ponctuellement délier l’ADN, en transcrire/répliquer les brins individuellement et par la suite lui permettre de retrouver sa forme initiale stable. 176 Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. B) COMPARAISONS ENTRE L’ADN ET L’ARN Malgré qu’elles soient composées d’unités de base pratiquement homologues, les molécules d’ARN et d’ADN ont des caractéristiques différentes du fait de leurs fonctions respectives. L’ARN étant essentiellement impliquée dans la synthèse protéique, son existence est relativement brève et sa dégradation rapide, les besoins de la cellule en protéine étant très variables. A contrario, l’ADN étant supposé contenir l’intégralité du génome pendant une durée compatible avec l’existence, c’est une molécule qui résiste beaucoup mieux à l’altération ( Cf : Les prélèvements d’ADN sur des momies millénaires ). Durée de vie de l’ARN : Quelques minutes, heures, ( jours ) Durée de vie de l’ADN : Toute une vie – et au-delà !. En termes chimiques, la fragilité de l’ARN s’explique par la présence du groupe OH en C2’. En milieu basique, des ions OH- captent le proton H+ du groupement OH, laissant l’oxygène O seul et riche en électrons. Après ça, l’oxygène fait une attaque nucléophile sur le phosphate ce qui conduit à un réarrangement de la molécule et une rupture du lien phosphodiester. Cette même réaction peut également être « volontairement » catalysée par les ARNases. 177 Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. On obtient la formation d’un ester phosphate cyclique. Compte tenu des importantes tensions de cycle rendant cette molécule instable, une hydrolyse par une molécule d’eau va provoquer une deuxième attaque nucléophile sur le phosphate conduisant à la rupture du cycle. La rupture peut porter aussi bien sur la liaison du phosphate au C2’ qu’au C3’. Illustration de la deuxième attaque nucléophile ( hydrolyse du phosphate cyclique ) : Beaucoup d’autres enzymes que les ARNases sont capable de dégrader l’ARN. Ce mécanisme est impossible sur l’ADN du fait de l’absence de groupement OH donneur de proton en C2’, c’est ce qui explique que l’ADN soit chimiquement beaucoup plus stable. 178 Biologie Moléculaire – MED 11BA – 2013/2014 – I. G. & S. J. C) STRUCTURE SECONDAIRE DE L’ARN ET GRANDEURS L’ARN est en principe sous forme monocaténaire, au sein de la cellule. Les molécules d’ARN sont chimiquement capables de former des doubles hélices, si on place expérimentalement 2 chaines complémentaires / antiparallèles dans un tube à essai. L’appariement ainsi formé donnera une structure hélicoïdale proche d’une molécule d’ADN. Néanmoins, l’ARN peut également former spontanément des structures secondaires en s’appariant avec lui-même sur d’éventuels segments qui seraient complémentaires entre eux. Il est donc rare d’observer de longs segments d’ARN parfaitement appariés. Structure secondaire de l’ARN : Structure secondaire de l’ARN. En jaune : Une boucle. De fait, l’ARN essaie durement d’apparier ce qui peut l’être, mais il persiste des séquences non-complémentaires entre elles. Remarque : il faudrait par ailleurs imager que les brins complémentaires se tordent en hélices ( non-représenté ). La structure en double brin de l’ARN est plutôt rare. Elle se retrouve notamment dans le génome de certains virus tels que le rotavirus ( virus de la diarrhée ). Une séquence d’ARN ( Et d’ADN également, par ailleurs ) est dite séquence palindromique si elle peut s’apparier avec elle-même, soit sous forme de tige-boucle soit avec son "double" : Expression des ordres de grandeur, pour l’ARN et l’ADN : Acide nucléique monocaténaire : en nombre de nucléotides (nt) ou de bases (b) Acide nucléique bicaténaire : en paire(s) de base(s) (pb) Multiples : kilobase (kb) = 10³ (p)b, mégabase (Mb) = 106 (p)b & gigabase (Gb) = 109 (p)b. Le génome humain comporte 3 gigabases = 3 Gb Maintenant va dormir, t’es stone. 179